菰均一化全長(zhǎng)cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建

臧 劍，顏育民，張志剛，鄒世湘，彭 瓊

（1.廣東菰稻農(nóng)業(yè)有限公司，廣東 廣州 511400；2.湖南雜交水稻研究中心，湖南 長(zhǎng)沙410125；3.湖南旺湘隆農(nóng)業(yè)有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410125；4.湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

菰均一化全長(zhǎng)cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建

臧 劍1，顏育民2，張志剛2，鄒世湘3，彭 瓊4

（1.廣東菰稻農(nóng)業(yè)有限公司，廣東 廣州 511400；2.湖南雜交水稻研究中心，湖南 長(zhǎng)沙410125；3.湖南旺湘隆農(nóng)業(yè)有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410125；4.湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

為了獲得國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物品種菰的功能基因信息，并克隆功能基因片段，研究以SMART（switching mechanism at 5 end of RNA transcript）方式合成菰全長(zhǎng)cDNA，結(jié)合DSN（duplex-specific nuclease）均一化技術(shù)，構(gòu)建菰葉片組織的均一化全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。該cDNA文庫(kù)庫(kù)容量大，達(dá)到了3.6×106PFU/mL，插入片段平均長(zhǎng)度為1 000 bp，重組率為97.9%。均一化全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)能有效富集低豐度表達(dá)基因，降低冗余率，適用于目的基因的篩選，以及后續(xù)的基因、蛋白互作分析。

菰；均一化；cDNA文庫(kù)；功能基因

菰（Zizania latifolia （Griseb.） Stapf）即茭白，為多年水生禾本科植物，國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物品種，也是水稻的近緣屬。菰米是菰的穎果，又稱茭米、黑米、雕胡米、雕菰、茭白子[1]。由于生物量大、抗病蟲(chóng)害能力強(qiáng)、耐寒性好等優(yōu)良性狀，近年來(lái)被專家學(xué)者用作水稻遺傳育種優(yōu)良基因資源庫(kù)的重要來(lái)源之一[2]。然而，針對(duì)菰的分子生物學(xué)研究仍然處于起步階段，菰的遺傳信息尚未完全獲知，這嚴(yán)重阻礙了其作為水稻育種優(yōu)良基因資源庫(kù)的應(yīng)用。

構(gòu)建cDNA文庫(kù)是功能基因組學(xué)研究的基本手段之一，在研究某類特定細(xì)胞基因組表達(dá)狀態(tài)及基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢(shì)，在動(dòng)植物的個(gè)體發(fā)育及細(xì)胞周期調(diào)控（細(xì)胞分化、細(xì)胞衰老和凋亡）等生命進(jìn)程的研究中具有更為廣泛的應(yīng)用價(jià)值[3]。然而，以常規(guī)方法構(gòu)建的cDNA文庫(kù)通常面臨著高通量分析過(guò)程中重復(fù)拷貝比例高這一問(wèn)題，對(duì)基因的篩選和鑒定造成不必要的浪費(fèi)[4]。研究表明，這一問(wèn)題主要是因?yàn)楦叩日婧松锏募?xì)胞中基因表達(dá)水平差異較大引起的。

為了克服基因轉(zhuǎn)錄水平上巨大差異給文庫(kù)篩選和分析帶來(lái)的障礙，人們?cè)噲D在文庫(kù)測(cè)序前就降低高豐度轉(zhuǎn)錄本的克隆，增加中、低豐度轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)的頻率，以有利于低豐度表達(dá)基因的發(fā)現(xiàn)[5]。因此，均一化cDNA文庫(kù)便應(yīng)運(yùn)而生。目前，主要有2種觀點(diǎn)來(lái)構(gòu)建均一化cDNA文庫(kù)[6]。一種是以復(fù)性動(dòng)力學(xué)為原理。通常，高豐度cDNA在退火下復(fù)性速度快，而低豐度cDNA復(fù)性需要較長(zhǎng)時(shí)間，從而可以通過(guò)控制復(fù)性時(shí)間來(lái)降低豐度；另一種則認(rèn)為基因組DNA在拷貝數(shù)上具有相對(duì)均一化的性質(zhì)，那么通過(guò)cDNA和DNA的飽和雜交就可以降低文庫(kù)中高拷貝存在的cDNA豐度，從而降低高豐度轉(zhuǎn)錄本的克隆。自1990年首次報(bào)道均一化cDNA文庫(kù)以來(lái)，各種構(gòu)建方法便層出不窮，目前該技術(shù)已日趨完善，市場(chǎng)上也有各種試劑盒以供選擇。

該研究以菰幼嫩的葉片組織為試驗(yàn)材料，采用雙鏈特異性核酸酶（DSN）酶切的均一化技術(shù)并結(jié)合SMART技術(shù)構(gòu)建葉片的均一化全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，并從中挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序及生物信息學(xué)分析，該方法不僅能解決常規(guī)操作步驟復(fù)雜、RNA容易降解的問(wèn)題，而且能夠克服基因轉(zhuǎn)錄水平上的巨大差異，提高發(fā)現(xiàn)隨機(jī)序列和稀有基因的幾率，為菰新基因的發(fā)掘和功能基因組學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料 供試材料菰取自湖南省沅江市洞庭湖區(qū)，選取生長(zhǎng)狀況良好的菰幼嫩葉片，迅速投入液氮，存于-70℃ 超低溫冰箱備用。

1.1.2 主要試劑 Plant RNA提取試劑盒Tiangen（北京）、凝膠回收試劑盒（PureLink Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo Kit）、SMART cDNA Library Construction Kit（Clontech，634901）、QIA quick PCR Purification Kit（Qiagen，28104）、Advantage 2 Polymerase Mix（Clontech，639201）、Duplex-Specific Natlax（Evrogen，EA003）、Sfi I（NEB，R0123L）、DL2000 Marker（TaKaRa，D501A）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菰總RNA獲得 使用Plant RNA（Tiangen，北京）提取試劑盒提取菰幼嫩葉片的RNA。

1.2.2 雙鏈全長(zhǎng)cDNA的合成 使用SMART cDNA Library Construction Kit（Clontech，Cat. No.634901）試劑盒（5′和3′端均帶有特異引物的全長(zhǎng)cDNA）合成第1鏈。使用CDS III/3'引物和特異引物5'引物（5'-AAG CAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'），通過(guò)LD-PCR（long distance polymerasechain reaction）反應(yīng)合成雙鏈全長(zhǎng)cDNA，純化后用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 蛋白酶K消化 蛋白酶K消化參照鄭鴻昌等[7]的方法，加入25 μL去離子水溶解沉淀，最后取5 μL樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.4 cDNA文庫(kù)均一化 （1）雜交。將已純化的雙鏈cDNA加入0.2 mL PCR管中與雜交試劑混勻，而后分為4等分置于PCR管中。反應(yīng)體系（16 μL）：ds cDNA (1 μg) 8 μL；2×Hybridization buffe 8 μL。反應(yīng)條件：98℃預(yù)處理2 min，然后迅速轉(zhuǎn)入68℃中雜交5 h。（2）DSN消化。反應(yīng)體系（10 μL）：雜交后的cDNA 4 μL；2×DSN master buffer（68℃預(yù)熱）5 μL；DSN solution（含DSN，1/2 DSN，1/4 DSN，control）1 μL。反應(yīng)條件：68℃反應(yīng) 25 min后；加入10 μL 2×DSN stop buffer室溫放置5 min終止反應(yīng)，-20℃保存。（3）兩次PCR放大。cDNA均一化后，參照蔣敏等[8]的方法進(jìn)行兩次PCR的放大處理。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 cDNA文庫(kù)構(gòu)建 （1）酶切消化。反應(yīng)體系（100 μL）：ds cDNA（2 g）79 μL；10×Sfi Buffer 10 μL；Sfi I酶10 μL；100×BSA 1 μL。反應(yīng)條件：50℃溫浴2 h進(jìn)行sfi I酶切消化。（2）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。純化酶切cDNA后，T4 DNA連接酶與適量的pUC19改造載體于4℃下連接過(guò)夜進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，此時(shí)即為初始均一化全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。（3）文庫(kù)放大。為了放大文庫(kù)的質(zhì)量，挑選24個(gè)克隆，37℃，200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，利用M13正反向引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25 μL）：ddH2O 19.5 μL；10×PCR Buffer 2.5 μL；50×dNTP Mix 0.5 μL；M13F引物 0.5 μL；M13R引物 0.5 μL；rTag酶 0.5 μL；PCR模板1 μL。反應(yīng)程序：94℃ 3 min； 94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 1 min；36個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。從各管中分別取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.6 均一化效率驗(yàn)證 取200 μL菌液涂布于15 cm培養(yǎng)皿上（Apr-IPTG/x-gal LB固體培養(yǎng)基），觀察記錄菌落總數(shù)，按照“重組率（%）=（菌落總數(shù)-藍(lán)斑總數(shù)）/菌落總數(shù)×100”的公式計(jì)算重組率。按照公式“文庫(kù)容量=克隆數(shù)/涂板體積×稀釋倍數(shù)×重組液體積”計(jì)算文庫(kù)容量。式中，涂板體積為0.2 mL，稀釋倍數(shù)為10，重組液體積為30 mL。參照高山等[9]的方法，以1/2 DSN和control為模板，利用用18S管家基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，經(jīng)Tanon GIS軟件分析灰度后，驗(yàn)證cDNA文庫(kù)的均一化效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA 質(zhì)量鑒定

如圖1所示，反轉(zhuǎn)錄后cDNA 呈現(xiàn)均勻的彌散帶，大小分布在750～2 000 bp，符合植物雙鏈cDNA 長(zhǎng)度。彌散帶的亮度代表菰葉片中的RNA 成分具有多樣性和復(fù)雜性。試驗(yàn)中合成的cDNA 質(zhì)量較高，可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 菰葉片cDNA 電泳圖

2.2 均一化處理cDNA及效果分析

未經(jīng)過(guò)均一化處理的傳統(tǒng)cDNA文庫(kù)具有高豐度轉(zhuǎn)錄基因克隆數(shù)目過(guò)多的缺點(diǎn)[10]。在該研究中，與對(duì)照相比，cDNA經(jīng)過(guò)3個(gè)不同濃度DSN的均一化處理后在第一次PCR擴(kuò)增時(shí)發(fā)現(xiàn)，1/4DSN均一化處理后，PCR產(chǎn)物中間較亮的條帶消失明顯，呈現(xiàn)一條均勻的彌散條帶（圖2A），表明高豐度表達(dá)基因的豐度呈現(xiàn)出明顯下降的趨勢(shì)。因此，選擇1/4DSN的cDNA進(jìn)行第2次PCR放大。檢測(cè)結(jié)果同樣顯示擴(kuò)增條帶均勻彌散，擴(kuò)增產(chǎn)物有所增加（圖2B），可以用于建庫(kù)。

2.3 cDNA文庫(kù)質(zhì)量分析

重組菌涂布試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌落總數(shù)為2 440個(gè)，其中藍(lán)斑50個(gè)，即：重組率=（2 440-50）/2 440=97.9%，具有較高的重組效率。通過(guò)計(jì)算得出文庫(kù)容量為3.6×106PFU/mL。隨機(jī)挑取24個(gè)陽(yáng)性克隆，用插入位點(diǎn)兩側(cè)引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)插入片段大多＞750 bp，平均大小為1 000 bp（圖3）。以1/2 DSN和對(duì)照為模板，用18S管家基因進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)電泳后用Tanon GIS軟件分析灰度，結(jié)果顯示該cDNA文庫(kù)均一化后比非均一化的豐度下降26 倍以上（圖4）。

圖2 DNS消化cDNA后第1次PCR放大檢測(cè)（A）和第2次PCR放大檢測(cè)（B）

圖3 隨機(jī)挑取24個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行插入片段的PCR檢測(cè)

圖4 均一化效率驗(yàn)證

3 討 論

構(gòu)建cDNA文庫(kù)是獲得研究對(duì)象基因序列信息的有效方法之一，可為新基因的發(fā)掘、功能基因的鑒定提供高效、便捷的途徑。經(jīng)典的cDNA文庫(kù)構(gòu)建往往所需時(shí)間較長(zhǎng)、克隆的片段較短，不能提供完整的mRNA信息，而均一化的cDNA文庫(kù)能增加低豐度mRNA的表達(dá)機(jī)會(huì)。

重組率、庫(kù)容量、插入片段大小及均一化效果等是對(duì)均一化cDNA文庫(kù)構(gòu)建質(zhì)量的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)[11]。該研究獲得的原始文庫(kù)容量為3.6×106PFU/mL，保證了文庫(kù)的完整性與覆蓋度。插入片段平均長(zhǎng)度為1 000 bp，重組率為97.9%，均一化全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)能有效富集低豐度表達(dá)基因，降低冗余率。研究結(jié)果表明，該文庫(kù)是一個(gè)高質(zhì)量的全長(zhǎng)均一化cDNA文庫(kù)。該方法構(gòu)建的文庫(kù)不僅為功能基因的驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)，而且為進(jìn)一步發(fā)掘和利用菰自身有利基因打下了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Establishment of a Normalized Full-Length cDNA Library of Zizania latifolia

ZANG Jian1，YAN Yu-min2，ZHANG Zhi-gang2，ZOU Shi-xiang3，PENG Qiong4
（1. Guangdong Gudao Agricultural Limited Company, Guangzhou 511400, PRC; 2. Hunan Hybrid Rice Research Center, Changsha 410125, PRC; 3. Hunan Wangxianglong Agricultural Limited Company, Changsha 410125, PRC; 4. Hunan Agricultural Biotechnology Research Center, Changsha 410125, PRC）

In order to obtain functional genes, a narmalized stems cDNA library was constructed from precious plant Zizania latifolia (Griseb.) Stapf. SMART (switching mechanism at 5 end of RNA transcript) cDNA synthesis combined with DSN (duplex-specific, nuclease) normalization was applied to construct the normalized full-length cDNA library of Z. latifolia. The titer of cDNA library was about 3.6×106PFU/mL and the average insertion size was about 1.0 kb with high recombination rate (97.9%). Homogenization full-length cDNA library enrichment of low abundance is suitable for the purpose of gene selection and subsequent analysis of the gene and protein interactions, for expressing genes effectively and reducing the redundancy rate.

Zizania latifolia; normalization; cDNA library; functional gene

Q943.2

A

1006-060X（2017）04-0011-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.004.003

2017-02-08

湖南農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新資金（2016QN08）

臧 劍（1972-），男，湖南沅江市人，工程師，主要從事水稻育種研究。

彭 瓊