枯草芽孢桿菌對(duì)黑木耳發(fā)酵液糖類成分降解規(guī)律的影響?yīng)?/h1>
2017-05-18 21:57:04王斌張騰霄張春華陳洪玉蘇適于德
山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年4期
王斌 張騰霄 張春華 陳洪玉 蘇適 于德涵 黎莉
摘要：為開發(fā)以黑木耳為原料的益生菌保健品提供理論支持，以黑木耳子實(shí)體為主要原料配制培養(yǎng)液，接入純培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌，在36、46℃條件下分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定0～60 h內(nèi)發(fā)酵液中總糖、還原糖濃度，計(jì)算發(fā)酵液中多糖濃度及枯草芽孢桿菌菌落數(shù)。結(jié)果表明，總糖和多糖含量的變化均呈先下降上升再下降后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，還原糖含量的變化36℃條件下呈先下降后上升的趨勢(shì)，46℃條件下呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)；大部分發(fā)酵過程中，46℃發(fā)酵條件下發(fā)酵液的總糖、多糖、還原糖含量高于36℃發(fā)酵條件；兩種發(fā)酵條件下菌落數(shù)的變化趨勢(shì)是先上升后下降再上升后略下降。從糖類降解程度和活性菌體數(shù)量確定枯草芽孢桿菌發(fā)酵黑木耳子實(shí)體的最佳工藝為發(fā)酵溫度46℃，發(fā)酵時(shí)間24 h。
關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；黑木耳；總糖；多糖；還原糖；降解規(guī)律
中圖分類號(hào)：S646.609.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2017）04-0068-04
Study on Degradation of Sugars in Black Fungus
Fermentation Broth Affected by Bacillus subtilis
Wang Bin， Zhang Tengxiao， Zhang Chunhua， Chen Hongyu， Su Shi， Yu Dehan， Li Li
（Department of Food and Pharmaceutical Engineering， Suihua University， Suihua 152061， China）
Abstract The effects of Bacillus subtilis on degradation rule of sugars in black fungus fermentation broth was studied in order to provide theoretical supports for the development of probiotic health care products with black fungus as raw material. The pure cultured Bacillus subtilis was inoculated into the culture liquid with black agaric fruiting body as main raw material and cultured at 36℃ and 46℃ respectively by fermentation. The total sugar and reducing sugar concentration were determined in the fermentation liquid in 0～60 hours， and the polysaccharide concentration and Bacillus subtilis colony number were calculated. The results showed that the contents of total sugars and polysaccharide decreased firstly， then increased， and then decreased to tend to stablization. The content of reducing sugars decreased firstly and then increased at 36℃， but decreased firstly， then increased and then decreased at 46℃. In most of the fermentation process， the total sugar， polysaccharide and reducing sugar contents at 46℃ were higher than those at 36℃. The change trend of colony number in the two kinds of fermentation conditions both increased firstly followed by decrease， and then increased followed by slight decrease. Comprehensively considering the sugar degradation and colony number， the optimum fermentation technology for black agaric fruiting body with Bacillus subtilis was fermented for 24 hours at 46℃.
Keywords Bacillus subtilis； Black fungus； Total sugar； Polysaccharide； Reducing sugar； Degradation rule
黑木耳是一種藥食同源的食用菌，主要分布于黑龍江、吉林等地，具有涼血、止血、補(bǔ)氣耐饑、補(bǔ)胃理氣和活血的功效[1]。黑木耳中含有多糖、腺苷類物質(zhì)、黑色素、麥角甾醇、磷脂類及多種維生素等化學(xué)成分。研究表明，黑木耳多糖是重要的活性成分，具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、降血糖、降血脂、抗凝血、抗演瘍、抗肝炎、抗生育、抗感染、促進(jìn)血清蛋白生物合成和淋巴細(xì)胞核酸生物合成等作用[2]。隨著對(duì)活性成分的深入研究，黑木耳深加工制品種類也比較豐富，一類是非發(fā)酵制品，如黑木耳粉、黑木耳醬、黑木耳果凍、黑木耳冰淇淋、黑木耳復(fù)合飲料、黑木耳膨化脆片、黑木耳軟糖、黑木耳五香干、黑木耳方便面、黑木耳威化餅、黑木耳甜羹、黑木耳蜜餞等；另一類是發(fā)酵類制品，如黑木耳發(fā)酵飲料、黑木耳果醋、黑木耳酸奶等[3-11]。利用黑木耳開發(fā)功能性食品添加劑、保健品或藥品的市場(chǎng)前景更加廣闊?？莶菅挎邨U菌是一種對(duì)人和動(dòng)物安全有益的微生物，其活菌制劑作為口服液用于治療腸炎、支氣管炎和腹瀉等多種疾病。本試驗(yàn)以黑木耳子實(shí)體為主要原料配制培養(yǎng)液，接入純培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌并進(jìn)行發(fā)酵，探究枯草芽孢桿菌對(duì)發(fā)酵液中黑木耳子實(shí)體糖類成分降解規(guī)律的影響因素，為開發(fā)以黑木耳為原料的益生菌保健品提供理論支持。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
黑木耳購于綏化市華辰超市，產(chǎn)地黑龍江省大興安嶺地區(qū)；實(shí)驗(yàn)試劑有葡萄糖、苯酚、濃鹽酸、濃硫酸、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、氫氧化鈉、枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂等，均為分析純。
1.2 主要儀器
FW100高效萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯儀器有限公司；FA2104電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHA-B水浴恒溫振蕩器，天津市泰斯儀器有限公司；HPX-9162MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；752型紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司。
1.3 枯草芽孢桿菌的分離
枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒主要成分是枯草芽孢桿菌和屎腸球菌，根據(jù)枯草芽孢桿菌可耐受60℃高溫而屎腸球菌不能耐受60℃高溫來分離枯草芽孢桿菌。采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)高溫滅菌、倒平板、連續(xù)濃度梯度稀釋處理、涂布后，一組置于60℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)50 min，再放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，一組直接置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，獲得菌落。通過顯微鏡鏡檢和菌落形態(tài)鑒定，判斷獲得菌落是否為枯草芽孢桿菌純菌落。60℃處理后培養(yǎng)獲得的菌落形態(tài)符合枯草芽孢桿菌的典型形態(tài)特征，所有菌體呈桿狀，說明獲得了枯草芽孢桿菌純培養(yǎng)物；直接37℃培養(yǎng)獲得的菌落，顯微鏡下觀察是球狀菌和桿狀菌混合體，說明沒有獲得枯草芽孢桿菌純培養(yǎng)物。將獲得的枯草芽孢桿菌純培養(yǎng)物的菌落采用連續(xù)劃線法連續(xù)傳代培養(yǎng)2次，得到的菌落作為后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)菌種。
1.4 發(fā)酵液的制備
1.4.1 培養(yǎng)液的制備 黑木耳粉末（過80目篩）8.00 g、氯化鈉2.80 g、葡萄糖2.00 g、蒸餾水480 mL，攪拌均勻即為培養(yǎng)液。取6個(gè)三角瓶，每個(gè)三角瓶中倒入培養(yǎng)液80 mL，包扎好，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。吸取培養(yǎng)液2 mL，作為發(fā)酵液0 h樣品，并測(cè)定總糖、還原糖含量，計(jì)算多糖含量。
1.4.2 接種 將純培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌制備成菌懸液接入培養(yǎng)液中。
1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng) 將接種好的培養(yǎng)液放入恒溫振蕩器中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，36℃及46℃往復(fù)式振搖，150～160次/min，每個(gè)溫度平行3份，12、24、36、48、60 h測(cè)定發(fā)酵液總糖、還原糖濃度，計(jì)算多糖濃度及枯草芽孢桿菌菌落數(shù)。
1.5 總糖含量測(cè)定
1.5.1 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-濃硫酸法。取干凈試管6支并編號(hào)，分別吸取0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，再用蒸餾水補(bǔ)足至1 mL，各試管分別加苯酚試劑1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，反應(yīng)液混合均勻，靜置10 min，30℃水浴鍋中反應(yīng)20 min。取適量反應(yīng)液在490 nm處測(cè)定吸光度，以葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。
1.5.2 發(fā)酵液中總糖含量測(cè)定 取0、12、24、36、48、60 h的發(fā)酵液2 mL，加水5 mL、濃鹽酸1.5 mL，100℃水浴水解3 h，蒸餾水定容至25 mL。吸取上述液0.1 mL于試管中，加蒸餾水0.9 mL，按1.5.1項(xiàng)下操作，490 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算發(fā)酵液中總糖濃度（mg/mL）?？偺菨舛?10x/2×25×10-3，式中，x：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的糖濃度（μg/mL）。
1.6 還原糖測(cè)定
1.6.1 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用DNS法。DNS試劑的配制：稱取3，5-二硝基水楊酸3.25 g溶于少量水中，移入500 mL棕色容量瓶中，加2 mol/L NaOH溶液162.5 mL，再加入丙三醇22.5 g，搖勻，定容至500 mL，置冰箱備用。取干凈試管6支并編號(hào)，分別吸取1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，蒸餾水補(bǔ)足至5 mL，各試管分別加DNS試劑1.5 mL，沸水浴5 min，540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.6.2 發(fā)酵液中還原糖含量測(cè)定 取0、12、24、36、48、60 h的發(fā)酵液2.5 mL，加水2.5 mL、DNS 1.5 mL，沸水浴5 min，吸取上述液各1 mL于試管中，分別加蒸餾水19 mL，540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算發(fā)酵液中還原糖濃度（mg/mL）。還原糖濃度=20x/2.5×10-3，式中，x：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的糖濃度（μg/mL）。
1.7 發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌菌落數(shù)
取無菌試管6只，各加入無菌生理鹽水9 mL，吸取發(fā)酵液1 mL注入第一管中，并依次作10倍遞增稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6六個(gè)濃度，用移液器分別吸取所選定的各種稀釋液0.1 mL涂布于無菌瓊脂培養(yǎng)皿中，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，36℃及46℃培養(yǎng)60 h，每12 h取出計(jì)算菌落數(shù)，菌落數(shù)乘相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即得到每毫升發(fā)酵液中所含的枯草芽孢桿菌菌落數(shù)。
2 結(jié)果與分析
2.1 總糖及還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線
測(cè)定總糖的線性回歸方程：y=0.0079x+0.119，R2=0.9937；測(cè)定還原糖的線性回歸方程：
y=0.0034x-0.0764，R2=0.9934。
2.2 總糖和多糖含量變化
圖1、圖2結(jié)果表明，以枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種分別在36、46℃發(fā)酵黑木耳培養(yǎng)液，總糖和多糖含量的變化均呈先下降后上升再下降后基本趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，且46℃發(fā)酵液的總糖及多糖含量明顯高于36℃?？偺呛投嗵呛烤?2 h時(shí)下降到最低值且低于初始發(fā)酵液，表明0～12 h菌體增殖前期大量消耗培養(yǎng)基內(nèi)速效碳源（葡萄糖），菌體細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)變成非糖物質(zhì)的速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于菌體同化成糖的速率；總糖和多糖含量均在24 h時(shí)達(dá)到高峰且為初始發(fā)酵液的兩倍左右，表明12～24 h菌體快速增殖，將發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)同化轉(zhuǎn)變?yōu)榫w糖類物質(zhì)，菌體細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)變成非糖物質(zhì)的速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于菌體同化成糖的速率；24～36 h總糖和多糖含量持續(xù)下降；發(fā)酵36 h后，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)數(shù)值基本保持恒定而略有波動(dòng)，說明菌體分解代謝消耗的糖分與同化合成糖分的速率基本持平。
2.3 還原糖含量變化
圖3結(jié)果表明，兩種溫度條件下發(fā)酵液的還原糖含量變化略有不同，兩者均在0～24 h呈直線下降趨勢(shì)，24 h時(shí)含量下降至最低峰值，此時(shí)培養(yǎng)基的葡萄糖幾乎消耗殆盡，對(duì)比上述24 h時(shí)總糖和多糖含量處于最高峰值，推測(cè)此時(shí)菌體濃度已達(dá)峰值，而此時(shí)大量增殖后的菌體細(xì)胞處于缺碳狀態(tài)。24～36 h內(nèi)發(fā)酵液中還原糖含量始終處于極低值，而36～48 h 還原糖含量逐漸升高，表明活性菌體開始降解發(fā)酵液中的木耳多糖為還原糖，即當(dāng)菌體細(xì)胞感知培養(yǎng)基內(nèi)的葡萄糖消耗完全12 h后大量的多糖降解酶開始分泌，轉(zhuǎn)向分解利用遲效碳源（木耳多糖）。46℃發(fā)酵后期，還原糖濃度在48 h達(dá)峰值后逐漸下降，但36℃發(fā)酵后期還原糖濃度逐漸上升，兩者的差別說明高溫下菌體分解代謝非常旺盛，快速消耗多糖降解后的還原糖然后進(jìn)入競(jìng)爭(zhēng)衰亡階段。
2.3 枯草芽孢桿菌菌落數(shù)變化
由圖4可見，兩種發(fā)酵溫度菌體數(shù)量的總趨勢(shì)相似，但數(shù)值變化幅度差別較大，0～36 h呈先上升后下降、36～60 h呈上升略下降的趨勢(shì)，其變化趨勢(shì)與總糖及多糖的變化趨勢(shì)大體相反。兩者發(fā)酵24 h時(shí)菌體均為高峰值，46℃發(fā)酵條件下的菌落數(shù)大約高出36℃發(fā)酵條件下的2倍，表明高溫顯著提高了菌體細(xì)胞的增殖速率，受發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的限制大量菌體因競(jìng)爭(zhēng)缺乏還原糖而死亡，菌體數(shù)量下降到一定數(shù)量后，逐漸開始分解利用木耳多糖，多糖被降解為還原糖使還原糖濃度升高，為菌體數(shù)量的第二次增殖提供碳源。由于低溫發(fā)酵條件下，活性菌體細(xì)胞對(duì)物質(zhì)的代謝
強(qiáng)度低，培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更多的分配給增殖生長(zhǎng)，因此，發(fā)酵后期36℃發(fā)酵條件下菌落數(shù)量高于46℃。
3 結(jié)論
以黑木耳子實(shí)體為主要成分，以枯草芽孢桿菌為菌種，在相同的初始發(fā)酵培養(yǎng)基情況下，分別采用36、46℃兩個(gè)溫度下進(jìn)行發(fā)酵研究。結(jié)果表明：低溫和高溫條件下枯草芽孢桿菌對(duì)黑木耳發(fā)酵液中糖類的利用及降解性能存在明顯差別，46℃高溫發(fā)酵有利于充分消耗培養(yǎng)液中的還原糖并充分降解黑木耳子實(shí)體中的多糖成分，分解子實(shí)體細(xì)胞壁中大量致密的多糖后使胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放進(jìn)入發(fā)酵液，從而提升發(fā)酵液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。黑木耳子實(shí)體蛋白質(zhì)和多糖含量高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，充分降解細(xì)胞壁上的糖類可起到破壁釋放營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的效果，通過發(fā)酵試驗(yàn)比較，從降解程度和活性菌體數(shù)量?jī)蓚€(gè)方面綜合考慮，枯草芽孢桿菌發(fā)酵黑木耳子實(shí)體培養(yǎng)液的最佳工藝為發(fā)酵溫度46℃，發(fā)酵時(shí)間24 h。由于黑木耳中還含有大量的蛋白質(zhì)，因此，今后還應(yīng)研究枯草芽孢桿菌對(duì)黑木耳子實(shí)體中蛋白質(zhì)降解規(guī)律的影響因素，來確定其最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，為開發(fā)黑木耳為原料的益生菌保健品提供更多的理論參考。
參 考 文 獻(xiàn)：
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Wang Bin， Zhang Tengxiao， Zhang Chunhua， Chen Hongyu， Su Shi， Yu Dehan， Li Li
（Department of Food and Pharmaceutical Engineering， Suihua University， Suihua 152061， China）
Abstract The effects of Bacillus subtilis on degradation rule of sugars in black fungus fermentation broth was studied in order to provide theoretical supports for the development of probiotic health care products with black fungus as raw material. The pure cultured Bacillus subtilis was inoculated into the culture liquid with black agaric fruiting body as main raw material and cultured at 36℃ and 46℃ respectively by fermentation. The total sugar and reducing sugar concentration were determined in the fermentation liquid in 0～60 hours， and the polysaccharide concentration and Bacillus subtilis colony number were calculated. The results showed that the contents of total sugars and polysaccharide decreased firstly， then increased， and then decreased to tend to stablization. The content of reducing sugars decreased firstly and then increased at 36℃， but decreased firstly， then increased and then decreased at 46℃. In most of the fermentation process， the total sugar， polysaccharide and reducing sugar contents at 46℃ were higher than those at 36℃. The change trend of colony number in the two kinds of fermentation conditions both increased firstly followed by decrease， and then increased followed by slight decrease. Comprehensively considering the sugar degradation and colony number， the optimum fermentation technology for black agaric fruiting body with Bacillus subtilis was fermented for 24 hours at 46℃.
Keywords Bacillus subtilis； Black fungus； Total sugar； Polysaccharide； Reducing sugar； Degradation rule
黑木耳是一種藥食同源的食用菌，主要分布于黑龍江、吉林等地，具有涼血、止血、補(bǔ)氣耐饑、補(bǔ)胃理氣和活血的功效[1]。黑木耳中含有多糖、腺苷類物質(zhì)、黑色素、麥角甾醇、磷脂類及多種維生素等化學(xué)成分。研究表明，黑木耳多糖是重要的活性成分，具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、降血糖、降血脂、抗凝血、抗演瘍、抗肝炎、抗生育、抗感染、促進(jìn)血清蛋白生物合成和淋巴細(xì)胞核酸生物合成等作用[2]。隨著對(duì)活性成分的深入研究，黑木耳深加工制品種類也比較豐富，一類是非發(fā)酵制品，如黑木耳粉、黑木耳醬、黑木耳果凍、黑木耳冰淇淋、黑木耳復(fù)合飲料、黑木耳膨化脆片、黑木耳軟糖、黑木耳五香干、黑木耳方便面、黑木耳威化餅、黑木耳甜羹、黑木耳蜜餞等；另一類是發(fā)酵類制品，如黑木耳發(fā)酵飲料、黑木耳果醋、黑木耳酸奶等[3-11]。利用黑木耳開發(fā)功能性食品添加劑、保健品或藥品的市場(chǎng)前景更加廣闊?？莶菅挎邨U菌是一種對(duì)人和動(dòng)物安全有益的微生物，其活菌制劑作為口服液用于治療腸炎、支氣管炎和腹瀉等多種疾病。本試驗(yàn)以黑木耳子實(shí)體為主要原料配制培養(yǎng)液，接入純培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌并進(jìn)行發(fā)酵，探究枯草芽孢桿菌對(duì)發(fā)酵液中黑木耳子實(shí)體糖類成分降解規(guī)律的影響因素，為開發(fā)以黑木耳為原料的益生菌保健品提供理論支持。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
黑木耳購于綏化市華辰超市，產(chǎn)地黑龍江省大興安嶺地區(qū)；實(shí)驗(yàn)試劑有葡萄糖、苯酚、濃鹽酸、濃硫酸、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、氫氧化鈉、枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂等，均為分析純。
1.2 主要儀器
FW100高效萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯儀器有限公司；FA2104電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHA-B水浴恒溫振蕩器，天津市泰斯儀器有限公司；HPX-9162MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；752型紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司。
1.3 枯草芽孢桿菌的分離
枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒主要成分是枯草芽孢桿菌和屎腸球菌，根據(jù)枯草芽孢桿菌可耐受60℃高溫而屎腸球菌不能耐受60℃高溫來分離枯草芽孢桿菌。采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)高溫滅菌、倒平板、連續(xù)濃度梯度稀釋處理、涂布后，一組置于60℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)50 min，再放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，一組直接置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，獲得菌落。通過顯微鏡鏡檢和菌落形態(tài)鑒定，判斷獲得菌落是否為枯草芽孢桿菌純菌落。60℃處理后培養(yǎng)獲得的菌落形態(tài)符合枯草芽孢桿菌的典型形態(tài)特征，所有菌體呈桿狀，說明獲得了枯草芽孢桿菌純培養(yǎng)物；直接37℃培養(yǎng)獲得的菌落，顯微鏡下觀察是球狀菌和桿狀菌混合體，說明沒有獲得枯草芽孢桿菌純培養(yǎng)物。將獲得的枯草芽孢桿菌純培養(yǎng)物的菌落采用連續(xù)劃線法連續(xù)傳代培養(yǎng)2次，得到的菌落作為后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)菌種。
1.4 發(fā)酵液的制備
1.4.1 培養(yǎng)液的制備 黑木耳粉末（過80目篩）8.00 g、氯化鈉2.80 g、葡萄糖2.00 g、蒸餾水480 mL，攪拌均勻即為培養(yǎng)液。取6個(gè)三角瓶，每個(gè)三角瓶中倒入培養(yǎng)液80 mL，包扎好，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。吸取培養(yǎng)液2 mL，作為發(fā)酵液0 h樣品，并測(cè)定總糖、還原糖含量，計(jì)算多糖含量。
1.4.2 接種 將純培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌制備成菌懸液接入培養(yǎng)液中。
1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng) 將接種好的培養(yǎng)液放入恒溫振蕩器中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，36℃及46℃往復(fù)式振搖，150～160次/min，每個(gè)溫度平行3份，12、24、36、48、60 h測(cè)定發(fā)酵液總糖、還原糖濃度，計(jì)算多糖濃度及枯草芽孢桿菌菌落數(shù)。
1.5 總糖含量測(cè)定
1.5.1 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-濃硫酸法。取干凈試管6支并編號(hào)，分別吸取0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，再用蒸餾水補(bǔ)足至1 mL，各試管分別加苯酚試劑1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，反應(yīng)液混合均勻，靜置10 min，30℃水浴鍋中反應(yīng)20 min。取適量反應(yīng)液在490 nm處測(cè)定吸光度，以葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。
1.5.2 發(fā)酵液中總糖含量測(cè)定 取0、12、24、36、48、60 h的發(fā)酵液2 mL，加水5 mL、濃鹽酸1.5 mL，100℃水浴水解3 h，蒸餾水定容至25 mL。吸取上述液0.1 mL于試管中，加蒸餾水0.9 mL，按1.5.1項(xiàng)下操作，490 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算發(fā)酵液中總糖濃度（mg/mL）?？偺菨舛?10x/2×25×10-3，式中，x：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的糖濃度（μg/mL）。
1.6 還原糖測(cè)定
1.6.1 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用DNS法。DNS試劑的配制：稱取3，5-二硝基水楊酸3.25 g溶于少量水中，移入500 mL棕色容量瓶中，加2 mol/L NaOH溶液162.5 mL，再加入丙三醇22.5 g，搖勻，定容至500 mL，置冰箱備用。取干凈試管6支并編號(hào)，分別吸取1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，蒸餾水補(bǔ)足至5 mL，各試管分別加DNS試劑1.5 mL，沸水浴5 min，540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.6.2 發(fā)酵液中還原糖含量測(cè)定 取0、12、24、36、48、60 h的發(fā)酵液2.5 mL，加水2.5 mL、DNS 1.5 mL，沸水浴5 min，吸取上述液各1 mL于試管中，分別加蒸餾水19 mL，540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算發(fā)酵液中還原糖濃度（mg/mL）。還原糖濃度=20x/2.5×10-3，式中，x：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的糖濃度（μg/mL）。
1.7 發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌菌落數(shù)
取無菌試管6只，各加入無菌生理鹽水9 mL，吸取發(fā)酵液1 mL注入第一管中，并依次作10倍遞增稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6六個(gè)濃度，用移液器分別吸取所選定的各種稀釋液0.1 mL涂布于無菌瓊脂培養(yǎng)皿中，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，36℃及46℃培養(yǎng)60 h，每12 h取出計(jì)算菌落數(shù)，菌落數(shù)乘相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即得到每毫升發(fā)酵液中所含的枯草芽孢桿菌菌落數(shù)。
2 結(jié)果與分析
2.1 總糖及還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線
測(cè)定總糖的線性回歸方程：y=0.0079x+0.119，R2=0.9937；測(cè)定還原糖的線性回歸方程：
y=0.0034x-0.0764，R2=0.9934。
2.2 總糖和多糖含量變化
圖1、圖2結(jié)果表明，以枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種分別在36、46℃發(fā)酵黑木耳培養(yǎng)液，總糖和多糖含量的變化均呈先下降后上升再下降后基本趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，且46℃發(fā)酵液的總糖及多糖含量明顯高于36℃?？偺呛投嗵呛烤?2 h時(shí)下降到最低值且低于初始發(fā)酵液，表明0～12 h菌體增殖前期大量消耗培養(yǎng)基內(nèi)速效碳源（葡萄糖），菌體細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)變成非糖物質(zhì)的速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于菌體同化成糖的速率；總糖和多糖含量均在24 h時(shí)達(dá)到高峰且為初始發(fā)酵液的兩倍左右，表明12～24 h菌體快速增殖，將發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)同化轉(zhuǎn)變?yōu)榫w糖類物質(zhì)，菌體細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)變成非糖物質(zhì)的速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于菌體同化成糖的速率；24～36 h總糖和多糖含量持續(xù)下降；發(fā)酵36 h后，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)數(shù)值基本保持恒定而略有波動(dòng)，說明菌體分解代謝消耗的糖分與同化合成糖分的速率基本持平。
2.3 還原糖含量變化
圖3結(jié)果表明，兩種溫度條件下發(fā)酵液的還原糖含量變化略有不同，兩者均在0～24 h呈直線下降趨勢(shì)，24 h時(shí)含量下降至最低峰值，此時(shí)培養(yǎng)基的葡萄糖幾乎消耗殆盡，對(duì)比上述24 h時(shí)總糖和多糖含量處于最高峰值，推測(cè)此時(shí)菌體濃度已達(dá)峰值，而此時(shí)大量增殖后的菌體細(xì)胞處于缺碳狀態(tài)。24～36 h內(nèi)發(fā)酵液中還原糖含量始終處于極低值，而36～48 h 還原糖含量逐漸升高，表明活性菌體開始降解發(fā)酵液中的木耳多糖為還原糖，即當(dāng)菌體細(xì)胞感知培養(yǎng)基內(nèi)的葡萄糖消耗完全12 h后大量的多糖降解酶開始分泌，轉(zhuǎn)向分解利用遲效碳源（木耳多糖）。46℃發(fā)酵后期，還原糖濃度在48 h達(dá)峰值后逐漸下降，但36℃發(fā)酵后期還原糖濃度逐漸上升，兩者的差別說明高溫下菌體分解代謝非常旺盛，快速消耗多糖降解后的還原糖然后進(jìn)入競(jìng)爭(zhēng)衰亡階段。
2.3 枯草芽孢桿菌菌落數(shù)變化
由圖4可見，兩種發(fā)酵溫度菌體數(shù)量的總趨勢(shì)相似，但數(shù)值變化幅度差別較大，0～36 h呈先上升后下降、36～60 h呈上升略下降的趨勢(shì)，其變化趨勢(shì)與總糖及多糖的變化趨勢(shì)大體相反。兩者發(fā)酵24 h時(shí)菌體均為高峰值，46℃發(fā)酵條件下的菌落數(shù)大約高出36℃發(fā)酵條件下的2倍，表明高溫顯著提高了菌體細(xì)胞的增殖速率，受發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的限制大量菌體因競(jìng)爭(zhēng)缺乏還原糖而死亡，菌體數(shù)量下降到一定數(shù)量后，逐漸開始分解利用木耳多糖，多糖被降解為還原糖使還原糖濃度升高，為菌體數(shù)量的第二次增殖提供碳源。由于低溫發(fā)酵條件下，活性菌體細(xì)胞對(duì)物質(zhì)的代謝
強(qiáng)度低，培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更多的分配給增殖生長(zhǎng)，因此，發(fā)酵后期36℃發(fā)酵條件下菌落數(shù)量高于46℃。
3 結(jié)論
以黑木耳子實(shí)體為主要成分，以枯草芽孢桿菌為菌種，在相同的初始發(fā)酵培養(yǎng)基情況下，分別采用36、46℃兩個(gè)溫度下進(jìn)行發(fā)酵研究。結(jié)果表明：低溫和高溫條件下枯草芽孢桿菌對(duì)黑木耳發(fā)酵液中糖類的利用及降解性能存在明顯差別，46℃高溫發(fā)酵有利于充分消耗培養(yǎng)液中的還原糖并充分降解黑木耳子實(shí)體中的多糖成分，分解子實(shí)體細(xì)胞壁中大量致密的多糖后使胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放進(jìn)入發(fā)酵液，從而提升發(fā)酵液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。黑木耳子實(shí)體蛋白質(zhì)和多糖含量高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，充分降解細(xì)胞壁上的糖類可起到破壁釋放營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的效果，通過發(fā)酵試驗(yàn)比較，從降解程度和活性菌體數(shù)量?jī)蓚€(gè)方面綜合考慮，枯草芽孢桿菌發(fā)酵黑木耳子實(shí)體培養(yǎng)液的最佳工藝為發(fā)酵溫度46℃，發(fā)酵時(shí)間24 h。由于黑木耳中還含有大量的蛋白質(zhì)，因此，今后還應(yīng)研究枯草芽孢桿菌對(duì)黑木耳子實(shí)體中蛋白質(zhì)降解規(guī)律的影響因素，來確定其最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，為開發(fā)黑木耳為原料的益生菌保健品提供更多的理論參考。
參 考 文 獻(xiàn)：
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