小菜蛾P(guān)xALP1基因的時空表達譜分析

胡霞　徐維紅　劉佰明　鄒德玉　許靜楊　劉曉琳　白義川　谷希樹

摘要：小菜蛾是最早對Bt毒蛋白產(chǎn)生抗性的重要農(nóng)業(yè)害蟲之一，而膜結(jié)合堿性磷酸酶是小菜蛾體內(nèi)疑似Bt毒蛋白的直接受體之一。我們在之前的工作中克隆了小菜蛾堿性磷酸酶編碼基因PxALP1，本研究對該基因的時空表達譜進行了分析。在小菜蛾所有生命階段中，PxALP1基因在3齡幼蟲中表達水平最高；而在小菜蛾3齡幼蟲不同組織中，PxALP1基因在中腸中表達水平最高，這些都可能與PxALP1基因?qū)t毒蛋白產(chǎn)生抗性的生物學功能密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：小菜蛾；PxALP1；堿性磷酸酶；Bt毒蛋白受體；表達譜

中圖分類號：S436.341.2+4：Q786 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2017）04-0001-04

Analysis of Plutella xylostella ALP1 Gene Expression

Patterns at Different Time and Space

Hu Xia， Xu Weihong， Liu Baiming， Zou Deyu， Xu Jingyang， Liu Xiaolin， Bai Yichuan， Gu Xishu

（Tianjin Institute of Plant Protection， Tianjin 300384， China）

Abstract The diamondback moth， Plutella xylostella （L.）， is one of the important agricultural pests firstly producing resistances to Bt toxin. The membrane bound alkaline phosphatase is a potential direct receptor of Bt toxin in diamondback moth. We had cloned the coding ORF of Plutella xylostella alkaline phosphatase gene PxALP1 in previous works， so we analyzed the expression patterns of this gene at different time and space in this paper. Through the whole life span of Plutella xylostella， PxALP1 gene had the highest expression level in the 3rd instar larvae； and among all the tissues and organs of the 3rd instar larvae， PxALP1 gene had the highest expression level in the midgut. The expression patterns of PxALP1 gene might be closely related to the resistant function of Bt toxin.

Keywords Plutella xylostella； PxALP1； Alkaline phosphatase； Bt toxin receptor； Expression patterns

小菜蛾[Plutella xylostella （L.）]屬于鱗翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae），又被稱為菜蛾、吊絲蟲等，是一種為害十字花科蔬菜的世界性害蟲，寄主多達40種以上，在我國各地均有分布[1]。小菜蛾主要以幼蟲為害十字花科蔬菜，嚴重影響十字花科蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)?；瘜W藥劑一直是防治小菜蛾的主要手段，頻繁用藥和小菜蛾本身世代短、繁殖能力強的特點導(dǎo)致小菜蛾成為抗藥性最為嚴重的害蟲之一[2]。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）毒素蛋白是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑，在世界范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用[3-5]。編碼Bt殺蟲蛋白的基因也作為最主要的殺蟲基因轉(zhuǎn)入到多種重要糧棉作物中，在害蟲防治中起著巨大作用[6，7]。但是小菜蛾亦能對其產(chǎn)生抗藥性，并且是最早發(fā)現(xiàn)田間種群對Bt毒素產(chǎn)生抗藥性的害蟲。深入研究小菜蛾對Bt毒素的抗性機理，是有效防治害蟲的一個新思路[8，9]。

鑒定Bt毒蛋白在農(nóng)業(yè)害蟲體內(nèi)的作用靶標，明確其抗性機理是當前農(nóng)業(yè)昆蟲學領(lǐng)域的研究熱點。已有研究顯示，在多種昆蟲體內(nèi)堿性磷酸酶是Bt毒蛋白的直接受體，但在重要農(nóng)業(yè)害蟲小菜蛾中，堿性磷酸酶的編碼基因及其生物學功能尚很少有人研究[10-13]。在以往工作中，我們成功克隆了小菜蛾的堿性磷酸酶基因PxALP1，并對其進行了生物信息學分析[14]。本研究擬利用Real-Time PCR建立檢測PxALP1基因表達量的方法，并在小菜蛾不同生命階段和不同組織中檢測PxALP1基因的表達水平，以期為闡明PxALP1在小菜蛾對Bt毒素產(chǎn)生抗性的分子機理提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

本試驗所用小菜蛾為天津市植物保護研究所室內(nèi)飼養(yǎng)的敏感種群，用無蟲甘藍苗繼代飼養(yǎng)20代以上，飼養(yǎng)溫度為（25±1）℃，相對濕度為60%～70%，光周期為 16L∶8D。根據(jù)試驗需要取不同蟲態(tài)及組織供試。

1.2 主要試劑

TRIzol和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo Fisher公司，Real-Time PCR Kit購自ABI公司。引物由金唯智生物科技有限公司合成。

所用引物序列為PxALP1-qPCR-F：5′-CGGCATCGTGACGACATCAC-3′；PxALP1-qPCR-R：5′-CCGGGCTCGTTCTCCAGCAG-3′；EF1α-qPCR-F：5′-GCCTCCCTACAGCGAATC-3′；EF1α-qPCR-R：5′-CCTTGAACCAGGGCATCT3′。其中，引物PxALP1-qPCR-F和PxALP1-qPCR-R用于檢測靶基因PxALP1；引物EF1α-qPCR-F和EF1α-qPCR-R用于檢測組成型表達的延伸因子EF-1α（elongation factor-1α），為本試驗的內(nèi)參基因[15]。

1.3 小菜蛾總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

取小菜蛾幼蟲/成蟲50 mg或分離的各組織10 mg，液氮冷凍研磨后，用Trizol法提取小菜蛾總RNA，具體步驟參照Thermo Fisher公司的TRIzol試劑說明書，最后溶解于 30 μL DEPC水中，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，直接使用或-80℃保存。

取1 μg總RNA，參照Thermo Fisher公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書，以O(shè)ligo（dT）18作為逆轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA第一鏈。

1.4 Real-Time PCR方法

以cDNA樣本為模板，使用SYB Green PCR Kit試劑盒進行Real-Time PCR，檢測各樣本中PxALP1和內(nèi)參基因EF-1α的表達量，根據(jù)Real-Time PCR反應(yīng)曲線得到各樣本目的基因和內(nèi)參基因的Ct值 （threshold cycle number，域值循環(huán)數(shù)），每樣本測3次取平均值，采用ΔΔCt法進行相對定量，計算PxALP1基因的相對表達量和沉默效率。Real-Time PCR反應(yīng)程序為：50℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計分析方法

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件，對試驗結(jié)果使用χ2檢驗進行分析，P<0.05為統(tǒng)計學差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PxALP1基因在小菜蛾不同生命階段中的表達水平檢測

分別取小菜蛾卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼蟲、4齡幼蟲、蛹、雌性成蟲和雄性成蟲的全部組織提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過Real-Time PCR檢測PxALP1基因在小菜蛾不同生命階段中的相對表達水平。

Real-Time PCR的擴增曲線見圖1，熔解曲線見圖2。將Real-Time PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物均為單一目標條帶（圖3），說明Real-Time PCR能夠特異表征目標基因和內(nèi)參基因的表達水平?；诖?，我們通過ΔΔCt法進行相對定量，計算PxALP1基因在小菜蛾不同生命階段中的表達水平。結(jié)果如圖4所示，PxALP1基因在小菜蛾卵、各齡幼蟲、蛹和雌雄成蟲中均有表達，但在3齡幼蟲中表達水平最高，是其在卵中表達水平的20倍。

2.2 PxALP1基因在小菜蛾不同組織中的表達水平檢測

取PxALP1基因表達水平最高的3齡幼蟲，將其解剖為頭部、胸部、腹部、前腸、中腸、后腸、脂肪體和去腸道后表皮等不同組織，分別提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)為cDNA，同樣通過Real-Time PCR方法檢測PxALP1在小菜蛾不同組織中的表達分布情況。結(jié)果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)PxALP1基因在小菜蛾中腸表達水平最高，是其在頭部表達水平的35倍。

3 討論與結(jié)論

處于不同生命階段的小菜蛾基因表達譜差異很大，對轉(zhuǎn)Bt基因植物的敏感性也極不相同，因此有必要對PxALP1基因在小菜蛾不同生命階段中的表達分布情況進行探討。本研究通過Real-Time PCR檢測了PxALP1基因在小菜蛾卵、1齡

幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼蟲、4齡幼蟲、蛹、雌性成蟲、雄性成蟲期的表達分布情況，發(fā)現(xiàn)該基因在小菜蛾的卵、各齡幼蟲、蛹和雌雄成蟲中均有表達，但在3齡幼蟲中表達水平最高，是其在卵中表達水平的20倍。

此外，基因的表達具有極大的組織特異性，PxALP1基因在小菜蛾不同組織中的表達量也具有極大的差異。本研究通過Real-Time PCR檢測了PxALP1基因在小菜蛾3齡幼蟲頭部、胸部、腹部、前腸、中腸、后腸、脂肪體和去腸道后表皮等不同組織中的表達分布情況，發(fā)現(xiàn)該基因在小菜蛾3齡幼蟲的中腸中表達水平最高，是其在頭部表達水平的35倍。

小菜蛾低齡幼蟲一般對Bt較為敏感，高齡幼蟲具有較強的Bt抗性。我們前期工作揭示了PxALP1基因編碼的膜結(jié)合堿性磷酸酶很可能是Bt毒蛋白在小菜蛾體內(nèi)的直接受體之一[14]，本研究進一步發(fā)現(xiàn)PxALP1在3齡幼蟲中腸中表達水平最高，暗示PxALP1基因可能在小菜蛾對Bt毒素產(chǎn)生抗性過程中具有一定作用，具體機理有待進一步研究。

參 考 文 獻：

[1] 馮夏，李振宇，吳青君，等.小菜蛾抗性治理及可持續(xù)防控技術(shù)研究與示范——公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項“小菜蛾可持續(xù)防控技術(shù)研究與示范”進展[J]. 應(yīng)用昆蟲學報， 2011， 48（2）：247-253.

[2] 梁沛，高希武，鄭炳宗，等.小菜蛾對阿維菌素的抗性機制及交互抗性研究[J].農(nóng)藥學學報， 2001， 3（1）： 41-45.

[3] Li X， Schuler M A， Berenbaum M R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics [J]. Annu. Rev. Entomol. ， 2007， 52：231-253.

[4] You M， Yue Z， He W， et al. A heterozygous moth genome provides insights into herbivory and detoxification [J]. Nat. Genet. ， 2013， 45（2）：220-225.

[5] Manning G， Whyte D B， Martinez R， et al. The protein kinase complement of the human genome [J]. Science， 2002， 298（5600）：1912-1934.

[6] Gahan L J， Pauchet Y， Vogel H， et al. An ABC transporter mutation is correlated with insect resistance to Bacillus thuringiensis Cry1Ac toxin [J]. PLoS Genetics， 2010， 6（12）： 1-11.

[7] Kleter G A， Bhula R， Bodnaruk K， et al. Altered pesticide use on transgenic crops and the associated general impact from an environmental perspective[J]. Pest Manag. Sci.， 2007， 63（11）：1107-1115.

[8] Wright D J，Iqbal M，Granero F， et al. Change in a single midgut receptor in the diamondback moth （Plutella xylostella） is only in part responsible for field resistance to Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki and B. thuringiensis subsp. aizawai[J]. Appl. Environ. Microbiol.， 1997，63（5）：1814-1819.

[9] Sayyed A H， Haward R，Herrero S， et al. Genetic and biochemical approcah for characterization of resistance to Bacillus thuringiensis toxin Cry1Ac in field 57 population of the diamondback month， Plutella xylostella[J]. Appl. Environ. Microb.， 2000， 66（1）： 1509-1516.

[10]Itoh M ， Kanamori Y ，Takao M， et al. Cloning of soluble alkaline phosphatase cDNA and molecular basis of the polymorphic nature in alkaline phosphatase isozymes of Bombyx mori midgut [J]. Insect Biochem. Mol. Biol.， 1999， 29（2）：121-129.

[11]Fernandez L E， Aimanova K G， Gill S S， et al. A GPI-anchored alkaline phosphatase is a functional midgut receptor of Cry11Aa toxin in Aedes aegypti larvae [J]. Biochem. J.， 2006， 394（1）：77-84.

[12]Fernandez L E， Martinez-Anaya C， Lira E， et al. Cloning and epitope mapping of Cry11Aa-binding sites in the Cry11Aa-receptor alkaline phosphatase from Aedes aegypti [J]. Biochemistry， 2009， 48（37）：8899-8907.

[13]Dechklar M， Tiewsiri K， Angsuthanasombat C， et al. Functional expression in insect cells of glycosylphosphatidylinositol-linked alkaline phosphatase from Aedes aegypti larval midgut： a Bacillus thuringiensis Cry4Ba toxin receptor [J]. Insect Biochem. Mol. Biol.， 2011， 41（3）：159-166.

[14]胡霞，劉曉琳，白義川，等. 小菜蛾P(guān)xALP1基因克隆和生物信息學分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學， 2017， 49（1）：7-12.

[15]符偉，謝文，張卓，等. Bt毒素誘導(dǎo)下小菜蛾實時定量 PCR內(nèi)參基因的篩選[J]. 昆蟲學報， 2012， 55（12）：1406-1412.