膠原蛋白的化學改性方法及其應用的研究進展

趙景華，吳兆明，丁宇寧，劉文文，顏 澤，柯冰冰，沈 萍，胡建恩

(大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023)

膠原蛋白的化學改性方法及其應用的研究進展

趙景華，吳兆明，丁宇寧，劉文文，顏 澤，柯冰冰，沈 萍，胡建恩*

(大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023)

膠原蛋白是動物體內(nèi)重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，因具有生物可降解性、生物相容性、無毒等特性而被廣泛應用。本文綜述了戊二醛、β-環(huán)糊精聚輪烷單醛、丙二酸等交聯(lián)劑對膠原蛋白進行化學改性的方法研究現(xiàn)狀，并介紹了膠原蛋白改性材料在止血、藥物運輸載體、組織工程支架等方面應用的研究進展。

膠原蛋白；化學改性；交聯(lián)劑

膠原蛋白(Collagen)主要存在于動物的皮、骨、軟骨、牙齒、肌腱、韌帶和血管中，約占動物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的30%，是結(jié)締組織中極重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，起著支撐器官、保護機體等作用[1]。膠原蛋白的分子量約為300 kDa，由三條分子量相近的肽鏈組成，三條肽鏈相互纏繞，通過氫鍵連接形成穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)。三條肽鏈的交聯(lián)強度高度可變，這與膠原蛋白的類型、組織、物種、年齡等因素密切相關(guān)[2-3]；膠原蛋白中含有豐富的甘氨酸(Gly)、脯氨酸和羥脯氨酸，形成典型的(Gly-X-Y)結(jié)構(gòu)(X、Y代表其他氨基酸)，在每條肽鏈上都有(Gly-X-Y)重復結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，它是形成膠原原纖維的主要結(jié)構(gòu)；其中羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸，它可以形成分子內(nèi)氫鍵，對于穩(wěn)定膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)有著重要作用[4]。膠原蛋白因具有這些獨特的結(jié)構(gòu)，而具有生物可降解性、生物相容性、無毒性、低抗原性、細胞黏附等特性[5]。但是膠原蛋白機械強度低、生物降解速率難以控制、易變性等缺點限制了其應用，對膠原蛋白進行改性不僅能提高膠原蛋白的機械強度、熱變性溫度等特性，還可以有效控制膠原蛋白的降解速率，使改性后的膠原蛋白材料被廣泛用于止血、藥物運輸載體、組織工程支架等方面[6]。本文主要總結(jié)了膠原蛋白的化學改性方法及其改性后應用的研究進展。

1 膠原蛋白的化學改性方法

與物理改性方法相比，化學改性方法在調(diào)整和控制膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，提高膠原蛋白的拉伸強度、柔韌性等機械性能，控制膠原蛋白的生物降解速率，提高膠原蛋白的熱穩(wěn)定性等方面效果更顯著[7]。膠原蛋白的化學改性以交聯(lián)改性為主，主要的交聯(lián)劑包括醛類、二羧酸類、京尼平、碳化二亞胺、檸檬酸衍生物、殼聚糖和聚乙烯醇等。

1.1 醛類

戊二醛是最早使用的一種交聯(lián)劑，它具有水溶性、雙官能團、價格低等優(yōu)點[8]。膠原蛋白中的伯氨基能與戊二醛的兩個醛基發(fā)生反應形成希夫堿，將膠原蛋白分子以五元環(huán)的形式連接起來(圖1)[9]。曹建等[10]研究了戊二醛改性膠原蛋白的最佳條件：pH8、戊二醛濃度2%、反應時間1.5 h、溫度60℃，在此條件下，膠原蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性都最好。但是將不同戊二醛濃度(0.1%～1.0%)改性的膠原蛋白植入到大鼠皮下，會對大鼠皮膚產(chǎn)生不同程度的侵蝕，大鼠皮膚會出現(xiàn)炎癥反應和細胞毒性，并且周圍組織會出現(xiàn)一定程度的鈣化[11]。因此，戊二醛常用其他醛類物質(zhì)替代。

Sa Liu等[12]成功合成了一種新型醛類交聯(lián)劑，即β-環(huán)糊精聚輪烷單醛，它能與膠原蛋白進行交聯(lián)且無顯色反應，膠原蛋白的伯氨基與β-環(huán)糊精聚輪烷單醛的醛基反應生成希夫堿。經(jīng)β-環(huán)糊精聚輪烷單醛改性后的膠原蛋白熱變性溫度為81.6℃，交聯(lián)度高達87.1%，遠高于相同濃度的戊二醛改性的膠原蛋白的熱變性溫度和交聯(lián)度。在細胞毒性研究實驗中發(fā)現(xiàn)經(jīng)β-環(huán)糊精聚輪烷單醛改性后的膠原蛋白無細胞毒性。

1.2 二羧酸類

常用的交聯(lián)劑與膠原蛋白交聯(lián)主要以共價鍵作用為主，研究表明在膠原蛋白改性時，僅共價鍵占主導地位，會限制膠原蛋白材料所需的機械強度和生物相容性等性能，二羧酸可以通過非共價鍵作用與膠原蛋白交聯(lián)，使膠原材料的拉伸強度、斷裂伸長率等機械性能顯著提高，生物相容性顯著增強[13]。

丙二酸是一種簡單的二羧酸，無毒且價格低廉，主要通過非共價鍵作用與膠原蛋白交聯(lián)[14]。Tapas Mitra等[15]研究了丙二酸與膠原蛋白的交聯(lián)機理，如圖2所示，膠原蛋白上賴氨酸的氨基與丙二酸的羧基通過質(zhì)子交換和離子間相互作用形成了一種新型三維支架材料。膠原蛋白與丙二酸交聯(lián)的最佳條件為：膠原蛋白為0.5%、丙二酸為0.2%，在此條件下制備的支架材料的拉伸強度(7.9 MPa)、斷裂伸長率(11.8%)、楊氏模量(66.0 MPa)等機械強度達到最大，交聯(lián)度為78%，變性溫度達到128℃，經(jīng)掃描電子顯微鏡(SEM)觀察其結(jié)構(gòu)高度多孔。噻唑藍(MTT)試驗結(jié)果表明該支架材料無細胞毒性且具有良好的生物相容性，適合用于組織工程研究。Tapas Mitra先后還研究了乙二酸[14]、丁二酸[16]、庚二酸[17]與膠原蛋白的交聯(lián)作用，結(jié)果表明經(jīng)二元羧酸改性后膠原蛋白的拉伸強度、斷裂伸長率等機械性能、熱穩(wěn)定性、生物相容性等都得到了顯著的改善。

1.3 京尼平

京尼平是從梔子果實中提取的化合物，它具有羥基、酯鍵等多種活性基團，可直接與氨基酸或蛋白質(zhì)反應[18-19]。膠原蛋白與京尼平的反應機理如圖3所示，京尼平先與膠原蛋白的氨基作用，生成具有環(huán)烯醚萜的氮化物，經(jīng)過脫水作用得到芳香族的單體，再經(jīng)過自由基反應的二聚作用，產(chǎn)生分子內(nèi)和分子間環(huán)狀的交聯(lián)結(jié)構(gòu)[20]。

膠原蛋白是細胞生長的支架材料，具有促進細胞黏附和誘導細胞生長分化的作用，被廣泛用于組織工程學研究[21-22]。Xiujie Zhang等[23]以京尼平作為交聯(lián)劑與Ⅰ型膠原蛋白交聯(lián)制備支架材料，并研究了兩者交聯(lián)的最佳條件：京尼平濃度為0.3%、交聯(lián)溫度為37℃，在此條件下制備的支架材料經(jīng)SEM觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)與純膠原蛋白相比發(fā)生了改變，由片狀結(jié)構(gòu)變?yōu)榫W(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；同時其溶脹率、抗壓強度、降解速率、穩(wěn)定性與純膠原蛋白相比都得到了顯著的改善；MTT實驗結(jié)果表明該支架材料具有良好的生物相容性且細胞毒性低。王剛等[24-25]將人脂肪間充質(zhì)干細胞接種于京尼平改性的膠原蛋白支架材料上，細胞在該支架上生成了成熟脂肪樣細胞，表明京尼平對人脂肪間充質(zhì)干細胞的毒性低，且京尼平交聯(lián)的膠原蛋白與該細胞具有良好的生物相容性。

1.4 碳化二亞胺

碳化二亞胺(EDC)屬于酰胺型交聯(lián)劑[26]。EDC與膠原蛋白的反應機理如圖4所示，EDC可以促進膠原蛋白的谷氨酸或天冬氨酸的羧基與氨基連接形成酰胺鍵，EDC本身不成為實際交聯(lián)的一部分，而是形成可溶于水的脲衍生物，可以通過沖洗除去，避免引入有毒物質(zhì)[27]。

為提高EDC的交聯(lián)效率，EDC常與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)聯(lián)用。王迎軍等[28]用EDC/NHS作為交聯(lián)劑，與膠原蛋白交聯(lián)，研究表明改性后膠原蛋白的熱穩(wěn)定性、形態(tài)穩(wěn)定性增強，抗酶解能力顯著提高，經(jīng)SEM觀察其結(jié)構(gòu)更加緊密有序。Gloria等[29]分別用EDC/NHS、戊二醛、京尼平作為交聯(lián)劑，制備膠原蛋白支架材料，比較不同交聯(lián)劑對膠原蛋白結(jié)構(gòu)和性能的影響。將交聯(lián)后的膠原蛋白放入磷酸鹽緩沖液(PBS)中1、2、3個月后發(fā)現(xiàn)戊二醛交聯(lián)的膠原蛋白纖維結(jié)構(gòu)很快消失，京尼平交聯(lián)的膠原蛋白在2～3個月后纖維結(jié)構(gòu)完全消失，EDC/NHS交聯(lián)的膠原蛋白在浸泡3個月后仍能保持完整的纖維結(jié)構(gòu)，說明EDC/NHS能提高膠原蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。將人骨髓間充質(zhì)干細胞植入到膠原蛋白支架上，發(fā)現(xiàn)EDC/NHS交聯(lián)的膠原蛋白支架材料無細胞毒性且具有良好的細胞相容性。

1.5 檸檬酸衍生物

Tetsushi等[30]用N-羥基琥珀酰亞胺修飾檸檬酸的三個羧基制備了一種新型交聯(lián)劑，即檸檬酸衍生物(CAD)。CAD中有三個活性酯基，可以與膠原蛋白中賴氨酸或羥基賴氨酸的氨基反應形成酰胺鍵(圖5)。細胞毒性研究結(jié)果表明，經(jīng)CAD改性后，膠原蛋白材料的細胞毒性比戊二醛低10倍；將該材料植入到老鼠皮下7 d內(nèi)被完全降解且無炎癥反應。

1.6 殼聚糖

殼聚糖是天然陽離子多糖，無毒，具有生物相容性、生物可降解性、抗菌活性和止血等性能，可應用于手術(shù)縫合線、藥物運輸載體和傷口敷料等方面[31]。膠原蛋白與殼聚糖之間通過氫鍵和靜電作用在氨基、羥基等基因之間形成交聯(lián)，使膠原-殼聚糖復合材料形成三維立體結(jié)構(gòu)[32]。

陳達佳等[33]以膠原蛋白和殼聚糖為原料制備了可食用復合膜，研究了膠原蛋白與殼聚糖的質(zhì)量比、甘油添加量、熱處理溫度及時間等工藝參數(shù)對可食用復合膜性能的影響。結(jié)果表明，在膠原蛋白與殼聚糖質(zhì)量比6∶4、甘油添加量20%、熱處理溫度70℃、熱處理時間30 min的條件下，得到的復合膜表面光滑無氣泡，拉伸強度達到22.0 MPa，斷裂伸長率達到127.4%。Mingmao Chen等[5]用冷凍干燥法制備了膠原蛋白-殼聚糖止血海綿，研究了膠原蛋白與殼聚糖的最佳比例、止血海綿的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，膠原蛋白與殼聚糖最佳比例為1∶0.25；SEM觀察止血海綿呈高度多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；MTT實驗和體外溶血實驗表明止血海綿無細胞毒性，無溶血現(xiàn)象；止血實驗表明該止血海綿與醫(yī)用紗布、純膠原蛋白相比，止血時間短且失血量少。

1.7 聚乙烯醇

聚乙烯醇是一種水溶性的高分子聚合物，對人體無毒副作用，具有生物可降解性和生物相容性，其力學性能優(yōu)良，化學性質(zhì)穩(wěn)定，常被用做軟骨移植材料、燒傷敷料、藥物運輸載體等[34]。聚乙烯醇中含有大量的羥基，可以與膠原蛋白中的氨基通過氫鍵連接形成更穩(wěn)定的大分子物質(zhì)。

李沁華等[35]以膠原蛋白、聚乙烯醇、透明質(zhì)酸為原料，制備三維多孔的復合材料，考察了三者之間的比例對復合材料性質(zhì)的影響。研究表明，三者(聚乙烯醇∶膠原蛋白∶透明質(zhì)酸)質(zhì)量比為15∶4∶0.24時，復合材料的綜合性能最佳，具有較高含水率(58.0%～81.3%)和膨脹率(1.5～4.6倍)；經(jīng)SEM觀察呈互相交錯的多孔結(jié)構(gòu)，有利于構(gòu)建組織工程支架材料。Asran等[36]以聚乙烯醇、膠原蛋白、羥基磷灰石為原料，三者之間通過氫鍵連接形成一種新型三維支架材料，該支架材料孔隙率為49.5%；具有較強的拉伸強度(1.0 MPa)和彈性模量(11.1 MPa)；透射電鏡觀察該支架材料與骨具有相似的納米結(jié)構(gòu)，有望作為骨移植材料應用于組織工程。

2 膠原蛋白在生物醫(yī)學上應用的研究進展

2.1 止血材料

膠原蛋白因具有生物相容性、血液可吸收性、低免疫原性等性能而被廣泛用作止血材料。膠原蛋白止血材料具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與出血創(chuàng)面接觸時，利用其毛細作用迅速吸附傷口處血液，促使血小板凝聚，產(chǎn)生凝血酶，而凝血酶通過再催化過程將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，使血液凝固，達到止血的目的[37]。

徐志霞等[38]以碳化二亞胺為交聯(lián)劑，制備的膠原蛋白止血海綿能有效地縮短創(chuàng)面出血時間，減少出血量，其止血效果優(yōu)于市售明膠海綿。程瑋璐等[39]利用氧化再生纖維素(ORC)作為膠原蛋白海綿中的填料，制備的止血海綿與未添加ORC的膠原海綿相比，其力學性能更好，止血時間更短，植入動物體內(nèi)28 d后被完全降解且對周圍組織無影響。Kevin等[40]用聚乙二醇修飾膠原蛋白制成膠原蛋白止血膜，發(fā)現(xiàn)該膜在豬肺動脈大量出血時具有很強的組織粘附性和止血特性。Jyh-Ping等[41]通過靜電紡絲技術(shù)制備了膠原蛋白-殼聚糖-聚環(huán)氧乙烷納米纖維膜，該纖維膜無細胞毒性，且止血效果強于醫(yī)用紗布和市售明膠海綿。

2.2 藥物釋放載體材料

膠原蛋白是一種結(jié)締組織蛋白，具有生物相容性、生物可降解性和低免疫原性，可以作為理想的藥物載體材料[42]；可以通過控制膠原蛋白的結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)對藥物的緩慢釋放，將膠原蛋白交聯(lián)成高度多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使其機械強度提高，載藥量增加，生物降解速率減慢，以此來延長藥物的釋放時間[43]。

任建東等[42]以膠原蛋白微條作為藥物釋放載體，發(fā)現(xiàn)當水分滲入到微條中時，藥物的溶解和膠原蛋白的膨脹同時進行，藥物以一種溶解狀態(tài)存在于膠原蛋白中，以擴散方式逐步釋放。丁時踽等[44]發(fā)現(xiàn)以膠原蛋白作為藥物釋放載體時，引入以殼聚糖為包囊的藥物微粒，可明顯增強其緩釋作用，更有效地延長藥物在植入部位存留的時間。

2.3 組織工程支架材料

組織、器官缺損的修復和功能的重建是人們面臨的巨大挑戰(zhàn)，組織工程學的發(fā)展為組織的再生和重建提供了一項新的技術(shù)。膠原蛋白常被作為組織工程支架材料，從體內(nèi)提取種子細胞并通過體外擴增后接種到膠原蛋白支架上，經(jīng)過體外培養(yǎng)形成功能化組織后再植入體內(nèi)，可修復相關(guān)組織缺損[45]。

2.3.1 皮膚替代物

皮膚損傷嚴重時會導致死亡，特別是燙傷或燒傷皮膚很難自發(fā)修復。膠原蛋白常被用于培養(yǎng)皮膚細胞，作為皮膚損傷治療的載體[46]。Lie Ma等[47]以膠原蛋白為原料，制備的真皮替代物不僅可以促進成纖維細胞再生、增殖和分化，還能加快體內(nèi)血管的形成，并且產(chǎn)生的皮膚結(jié)構(gòu)與真皮結(jié)構(gòu)極為相似。劉學旭等[48]以膠原蛋白、葡甘聚糖(葡萄糖和甘露糖的聚合物)和硫酸軟骨素為原料制成的復合膜具有促進皮膚結(jié)構(gòu)再生的能力，并且能防止創(chuàng)口出血和感染，機體對其無明顯的免疫排斥反應。Mehmet等[49]用膠原蛋白-彈性蛋白基質(zhì)(由天然的結(jié)構(gòu)完整的Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ型膠原原纖維和彈性蛋白組成)作為人工皮膚，對15個面部嚴重燒傷(平均燒傷面積為75%)的兒童進行皮膚移植，結(jié)果表明，移植的人工皮膚在血管分布、彈性、柔韌性、質(zhì)地和顏色等方面均接近正常皮膚。

2.3.2 骨移植材料

膠原蛋白是骨細胞外基質(zhì)的重要組成成分，骨組織工程的發(fā)展為骨缺損修復提供了新的技術(shù)，宋芹等[50]以膠原蛋白為原料，添加納米羥基磷灰石和絲素蛋白，制備的膠原蛋白復合支架材料有利于成骨細胞的黏附、生長，且對細胞、組織無毒副作用；其壓縮應變及彈性模量等指標均適于骨組織材料的構(gòu)建。Jason等[51]制備的可用于3D打印的膠原蛋白支架材料具有良好的生物相容性和生物可降解性，將其植入到股骨缺損的小鼠體內(nèi)9周后，發(fā)現(xiàn)該支架材料具有骨傳導性，并且促進了新骨的生長，有望用于大面積骨組織缺損的修復。

2.3.3 角膜移植材料

膠原蛋白約占眼角膜干重的70%，膠原纖維在眼角膜中以規(guī)整有序的結(jié)構(gòu)排列[52-53]。角膜受損后很難修復或重建，有研究發(fā)現(xiàn)將體外培養(yǎng)擴增的正常角膜干細胞植入膠原蛋白支架上，形成組織工程人工角膜，能修復受損角膜[54]。袁曉龍等[55]首次利用魚皮膠原蛋白制備三維角膜載體支架，所制備的角膜支架透明度與天然豬角膜相比無顯著差異，且結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出均勻的網(wǎng)格狀，適于非轉(zhuǎn)染人角膜基質(zhì)細胞的順利遷入且與該細胞有良好的生物相容性，有望作為載體支架用于人工角膜的體外構(gòu)建。Mehrdad等[56]將膠原蛋白-殼聚糖混合水凝膠作為角膜移植材料，該材料具有良好的細胞親和性和生物可降解性，將該材料植入到豬眼內(nèi)12個月后，成功再生了角膜上皮細胞、基質(zhì)細胞及神經(jīng)細胞，并且比人角膜的光學清晰度高，可以作為角膜的替代物修復受損角膜。

3 展望

通過改性獲得的力學強度高、生物相容性好的膠原蛋白材料已被應用于止血、藥物載體、組織工程等方面。但是目前常用的改性交聯(lián)劑如戊二醛等，存在細胞毒性等問題，會對皮膚或組織產(chǎn)生一定影響，如皮膚炎癥、組織鈣化等。所以合成新型交聯(lián)劑引起了人們的廣泛關(guān)注，通過合成無毒且具有不同活性官能團的新型交聯(lián)劑來制備膠原蛋白材料，不僅可以獲得安全且交聯(lián)效率高的膠原蛋白材料，還可以彌補膠原蛋白原有的不足。目前合成的新型交聯(lián)劑有β-環(huán)糊精二醛、β-環(huán)糊精聚輪烷多醛、檸檬酸衍生物等。雖然膠原蛋白改性材料在醫(yī)用生物材料、化妝品、食品材料等方面的研究較為成熟，但離大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)還有一定的距離，如何將成熟的理論研究與實際生產(chǎn)相結(jié)合是工業(yè)化生產(chǎn)亟待解決的問題。

此外，我國是漁業(yè)大國，在水產(chǎn)品加工中會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，而這些副產(chǎn)物中含有豐富的膠原蛋白，從水產(chǎn)品副產(chǎn)物中提取膠原蛋白，不僅安全、純度高，而且可以實現(xiàn)水產(chǎn)品的高附加值。但水產(chǎn)來源的膠原蛋白與豬、牛等來源的相比，其拉伸強度、斷裂伸長率等機械強度更低、更易變性，因此尋找合適的方法對其進行改性研究獲得力學強度高、熱穩(wěn)定性高、生物相容性好的膠原蛋白材料將是膠原蛋白研究的新方向。

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Research progress on chemical modification and application of collagen

ZHAO Jinghua，WU Zhaoming，DING Yuning，LIU Wenwen，YAN Ze，KE Bingbing，SHEN Ping，HU Jian’en*

(College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China)

Collagen is an important structural protein in animal body.It is widely used because of its biodegradability，biocompatibility and nontoxicity.In this paper，the research progress of the chemical modification of collagen by glutaraldehyde，β-cyclodextrin，polyrotaxane aldehyde，malonic acid and other crosslinking agents was reviewed，and the application of collagen modified materials in hemostatic，drug delivery carrier and tissue engineering scaffold was introduced.

collagen；chemical modification；crosslinking agent

2016-12-06

黃渤海區(qū)域主要水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物高值化利用產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)集成及示范(201505030).

趙景華(1990-)，女，河南，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程.Tel：18840937265.E-mail：lzjh90@126.com

胡建恩(1962-)，男，教授，博士，研究方向為食品科學與海洋資源利用.Tel：13898465160.E-mail：huje@dlou.edu.cn

TS254.9

A

1006-5601(2017)02-0147-10

趙景華，吳兆明，丁宇寧，等.膠原蛋白的化學改性方法及其應用的研究進展[J].漁業(yè)研究，2017，39(2)：147-156.