凡納濱對蝦越冬親蝦黑鰓病癥的初步研究

楊求華，楊章武，曹英昆，林 琪，陸 振，何麗斌，周 宸*

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066003；3.汕頭大學(xué)生物系，廣東 汕頭 515063)

凡納濱對蝦越冬親蝦黑鰓病癥的初步研究

楊求華1，楊章武1，曹英昆2，林 琪1，陸 振3，何麗斌1，周 宸1*

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066003；3.汕頭大學(xué)生物系，廣東 汕頭 515063)

為確定越冬凡納濱對蝦親蝦黑鰓病癥病因，對患病親蝦病因進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，越冬后患病親蝦鰓部觀察到大量線蟲。蟲體特征顯微結(jié)構(gòu)顯示，雌、雄性線蟲的平均體長分別為(983.6±16.69)μm和(956.9±12.14)μm，蟲體表皮不均質(zhì)，具有2縱列側(cè)分化、4根頭剛毛、3個口腔實齒、5個杯形肛前附器，化感器橫向扁橢圓形，食道不形成食道球；經(jīng)鑒定，確定該線蟲隸屬于色矛科(Chromadoridae)、色矛屬(Chromadorella)。組織病理觀察結(jié)果表明，線蟲感染后親蝦鰓組織壞死、溶解，黑色素沉積，游泳足基部出現(xiàn)黑化層。本文報道了一種由色矛線蟲引起的越冬親蝦黑鰓病癥。

凡納濱對蝦；黑鰓病癥；線蟲；病理觀察

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)，又稱南美白對蝦，是當(dāng)前世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大品種之一，具有生長快、抗病力強(qiáng)等特點，自1988年引入我國后[1]，相繼攻克了集約化養(yǎng)殖技術(shù)和全人工繁育技術(shù)，在我國沿海各地實現(xiàn)大規(guī)模養(yǎng)殖，產(chǎn)生了良好的經(jīng)濟(jì)和社會效益。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，疾病也時有發(fā)生，包括白斑綜合征[2]、桃拉綜合征[3]、傳染性皮下和造血器官壞死病[4]、細(xì)菌性肌肉白濁病[5]、紅體病[6]等。

海洋線蟲(Nematodes)，屬于小型底棲動物的一種，是池塘蝦池養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，廣泛分布于蝦池環(huán)境中[7]，已有研究報道了簡單異尖線蟲幼蟲(Anisakissimplex)、灰海鰻對盲囊線蟲幼蟲(Contracaecummuraenesoxi)、帶魚針晶蛔線蟲幼蟲(Raphidascaristrichiur)和對盲囊線蟲幼蟲(Contracaecumsp.)可感染海水魚類引發(fā)線蟲病[8]。2014年4月，福建晉江某凡納濱對蝦親蝦培育基地越冬后親體蝦出現(xiàn)患病癥狀。本文對患病親蝦進(jìn)行檢查，做病癥分析及病理觀察，為親蝦疾病的防治提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 患病親蝦

患病凡納濱對蝦取自福建晉江某對蝦養(yǎng)殖場室內(nèi)越冬親蝦，體長為13～15 cm，體重為28～40 g。

1.2 病原分析

1.2.1 樣品觀察

取典型發(fā)病癥狀的瀕死親蝦，剪取發(fā)黑部分鰓片于培養(yǎng)皿中，加干凈海水并剪取鰓絲做成水浸片，分別在Olympus體視顯微鏡和Nikon 80i顯微鏡下觀察。

1.2.2 標(biāo)本的收集與固定

剪取親蝦發(fā)黑鰓片及游泳足基部黑斑部分至一干凈培育皿中，在解剖鏡下用解剖針從鰓絲上逐片尋找蟲體，挑出蟲體移入另一裝有生理鹽水的培養(yǎng)皿中。輕輕搖動，將蟲體上的污物洗凈后用冷巴氏液(甲醛30 mL，NaCl 5.67 g，蒸餾水937 mL，-4℃保存)固定和保存[9]。

1.2.3 線蟲鑒定

載玻片和蓋玻片用洗滌劑清洗，浸泡在75%的酒精中，制片前取出擦干備用。用石蠟在載玻片上做好直徑為1.5 cm的蠟圈，在蠟圈中間滴一滴甘油，挑取大小較為一致的蟲體5～10條到甘油里，在解剖鏡下將其分散，避免重疊，然后加蓋玻片，在50℃加熱板上加熱到蠟圈融化，待石蠟冷卻凝固后即可觀察。在Nikon 80i顯微鏡下進(jìn)行觀察、測量和拍照。根據(jù)Platt和Warwick等的描述，將海洋線蟲鑒定到分類實體單元或?qū)俚乃絒10]。

1.3 顯微病理分析

取典型發(fā)病癥狀瀕死親蝦的鰓及游泳足基部組織，用預(yù)冷至4℃左右的Bouin’s[11]固定液固定24 h，切片后H.E染色，在Olympus顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 癥狀

此次發(fā)病的室內(nèi)越冬親蝦，病癥出現(xiàn)于越冬后4—5月?；疾∥r攝食減少、活力減弱，上浮于水面，游動緩慢，死亡率在10%左右。肉眼觀察可見患病蝦空胃、游泳足發(fā)紅，鰓部發(fā)黃或有黑色斑點(圖1a)；游泳足基部亦可見黑色斑點(圖1c)。鏡檢結(jié)果顯示，在發(fā)病蝦鰓絲和游泳足基部黑色組織上有大量細(xì)長蟲體(圖1b)。在放大100倍的單個視野中，蟲體數(shù)量為10～16只。經(jīng)初步鑒定該蟲體為線蟲，隸屬于袋形動物門(Aschelminthes)，線蟲綱(Nematoda)。

2.2 鑒定結(jié)果

顯微形態(tài)觀察結(jié)果顯示，該線蟲雄性平均體長為(956.9±12.14)μm，平均最大體直徑為(25.8±0.82)μm；雌性平均體長為(983.6±16.69)μm，平均最大體直徑(36.3±1.05)μm；蟲體表皮不均質(zhì)，具有2縱列的側(cè)分化；頭剛毛4根，口腔實齒3個，化感器橫向呈扁橢圓形、不清晰；食道不形成食道球；具有5個杯形肛前附器；交合器為彎曲的弧形，平均弧長(53.8±1.66)μm、弦長(32.3±1.22)μm，雌性雙子宮、陰門所處位置V=0.46，所在體直徑平均為(33.2±0.99)μm，肛門所在體直徑平均為(24.7±0.86)μm；引帶較為明顯(圖2)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[10，12]對線蟲分類特征的表述，確定該線蟲隸屬于泄腺綱(無尾感器綱，Adenophorea)，色矛亞綱(Chromadoria)，色矛目(Chromadorida)，色矛亞目(Chromadorina)，色矛科(Chromadoridae)，色矛屬(Chromadorella)。

注：a：雄性整體；b：雌性整體；c：雌性陰門；d：口器；e：化感器；f：食道；g：肛前附器；h：交合器；i：側(cè)分化。

Notes：a：Male overall；b：Female overall；c：Vulva of female nematodes；d：Mouthparts；e：Amphids；f：Esophagus；g：Precloacal supplements；h：Cross-linking device；i：Lateral differentiation.

2.3 組織病理

組織病理觀察結(jié)果顯示，患病親蝦鰓組織壞死、組織結(jié)構(gòu)崩解，黑色素呈點狀沉積(圖3a)，游泳足基部組織壞死、黑化層明顯(圖3b紅色箭頭)；不過在病理組織切片中未觀察到線蟲結(jié)構(gòu)，懷疑為線蟲體太大且與鰓組織未實質(zhì)性黏連，在固定及酒精脫色過程中線蟲與鰓組織分離，故而線蟲未包埋至蠟塊。

注：a：鰓組織壞死，黑色素沉積，H.E染色(400×)；b：游泳足基部黑化層，H.E染色(400×)。

Notes：a：Gill tissue necrosis，melanin deposition，H.E staining(400×)；b：Black layer of swim foot base，H.E staining(400×).

3 討論

對蝦“黑鰓病”的由來，最早見于1968年日本石川雄介對日本對蝦(Penaeusjaponicus)鐮刀菌病的報道。此后的研究中發(fā)現(xiàn)引起對蝦黑鰓病的病原種類很多，如細(xì)菌中的弧菌、絲狀細(xì)菌、假單胞菌[13-14]；真菌中的鐮刀菌、鏈格孢、鏈壺菌、地霉、水霉等[15-16]；原生動物中的聚縮蟲、擬阿腦蟲等[17]；此外病毒和水質(zhì)不良也有可能引起對蝦黑鰓癥狀。黑鰓病是親蝦越冬期間常見的疾病之一，常造成親蝦死亡，影響親蝦越冬成活率，其中線蟲感染是引起越冬期親蝦黑鰓病加重的病因之一[18-19]，此外，在張秋陽、陳朝暉等[13，20]的調(diào)查報告中也顯示了線蟲可感染福建、溫州地區(qū)斑節(jié)對蝦(P.monodon)、中國對蝦(P.chinensis)、長毛對蝦(P.penicillatus)和日本對蝦，但這些線蟲均未鑒定至種。本文的研究中，筆者將引起越冬凡納濱對蝦親蝦黑鰓病癥的線蟲鑒定為色矛科、色矛屬的色矛線蟲。

有報道指出，線蟲本為營自由生活，廣泛存在于蝦池底泥和水環(huán)境中[7]，在適宜的條件下才臨時生活于對蝦鰓、眼窩等部位[13]。關(guān)于線蟲引起對蝦死亡的病因，鄧歡等[19]分析為當(dāng)線蟲生活于鰓絲部位后，它從蝦體內(nèi)汲取營養(yǎng)、分泌排泄物，致使蝦呼吸能力減弱，窒息死亡；而張勤等[18]指出，即使線蟲不直接引起對蝦死亡，但其在對蝦鰓部的來回穿梭，易造成蝦鰓黏液分泌增加，從而引起細(xì)菌等繼發(fā)感染，造成對蝦患病死亡。與其他蟲體感染相似，當(dāng)蝦體受到線蟲感染刺激時，機(jī)體將通過一系列反應(yīng)來制止或減輕蟲體對機(jī)體造成的損傷，據(jù)報道黑色素沉積是對蝦對異物刺激所作的積極防御反應(yīng)[21]。本文組織病理觀察結(jié)果表明，大量線蟲生活于對蝦鰓和游泳足基部后，可能造成其他病原的繼發(fā)感染，從而引起對蝦鰓組織和游泳足基部均出現(xiàn)黑色素沉積，這與細(xì)菌性引起的黑鰓病癥狀相似[21]，病變的鰓絲變黑、肥厚，影響蝦體正常呼吸，這可能是此次凡納濱對蝦親蝦越冬后出現(xiàn)上浮、死亡的病因所在。

[1]李鋒，劉楚吾，黃雅麗.凡納對蝦引進(jìn)親本及其子代RFLP分析[J].海洋通報，2005，24(1)：31-34.

[2]王奕玲，李卓佳，張家松，等.高位池養(yǎng)殖過程凡納濱對蝦攜帶WSSV情況的動態(tài)變化[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2012，19(2)：301-309.

[3]龐耀珊，謝芝勛，何競銘，等.二溫式RT-PCR檢測對蝦Taura綜合征病毒的研究[J].海洋科學(xué)，2004，28(2)：54-57.

[4]張娜，劉驍，莊廣儒.對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒檢測及各基因型分析[J].檢驗檢疫學(xué)刊，2004，(3)：68-70.

[5]紀(jì)榮興，鄒文政，鄢慶枇，等.凡納濱對蝦“肌肉白濁病”病原的初步研究[J].集美大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2008，13(3)：210-214.

[6]陳健舜，朱凝瑜，孫蕾，等.凡納濱對蝦細(xì)菌性紅體病病原的分子特征和耐藥性[J].水產(chǎn)學(xué)報，2012，36(12)：1891-1900.

[7]郭玉清，葉兆弘.蝦池小型底棲動物類群組成和數(shù)量分布[J].集美大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2008，13(1)：18-23.

[8]羅大民，方文珍.異尖線蟲病病原線蟲在臺灣海峽魚類中的分布及動態(tài)[J].臺灣海峽，2000，19(2)：218-222.

[9]曹英昆.廈門島海灘自由生活海洋線蟲多樣性與分類學(xué)研究[D].廈門：集美大學(xué)，2012.

[10]Platt H M，Warwick R M.Free-living Marine Nematodes，Part II：British Chromadorids[M].Cambridge：Cambridge UniversityBath Press，1988：114-117.

[11]Wang X，Zhang Y，Qin G，et al.A novel pathogenic bacteria(Vibriofortis)causing enteritis in cultured seahorses，HippocampuserectusPerry，1810[J].Journal of Fish Diseases，2015，39(6)：765-769.

[13]張秋陽.福建沿海養(yǎng)殖對蝦病害的調(diào)查研究[J].廈門水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報，1986，(1)：36-44.

[14]陶保華，石和榮，黃俊文，等.假單胞菌引起羅氏沼蝦黃鰓、黑鰓病的研究[J].中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2000，39(S1)：255-259.

[15]孟慶顯，俞開康.關(guān)于對蝦的“黑鰓病”[J].山東海洋學(xué)院學(xué)報，1982，12(4)：95-99.

[16]王茜，劉鳳岐.中國對蝦黑鰓病病原及病變機(jī)理的研究[J].動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)，2000，17(5)：48-50.

[17]周麗，宮慶禮，俞開康.人工越冬對蝦擬阿腦蟲病病理組織觀察[J].海洋湖沼通報，1997，(1)：33-37.

[18]張勤，馮守明，劉宗豹.越冬親蝦黑鰓病的防治研究[J].天津水產(chǎn)，1990，(1)：41-43.

[19]鄧歡，郭平.線蟲對越冬親蝦危害的初步試驗[J].海洋科學(xué)，1991，(4)：65.

[20]陳朝暉.溫州四種越冬親蝦疾病的調(diào)查研究[J].溫州師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版)，2000，21(3)：49-51.

[21]周凱，鄭國興，曹直.中國對蝦細(xì)菌性黑鰓病的組織病理觀察[J].水產(chǎn)學(xué)報，1997，21(3)：303-307.

A preliminary study on overwinter diseased broodstock ofLitopenaeusvannameiwith black-gill

YANG Qiuhua1，YANG Zhangwu1，CAO Yingkun2，LIN Qi1，LU Zhen3，HE Libin1，ZHOU Chen1

(1.Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province，F(xiàn)isheries Research Institute of Fujian，Xiamen 361013，China；2.Ocean College of Hebei Agricultural University，Qinhuangdao 066003，China；3.Department of Biology，Shantou University，Shantou 515063，China)

To determine the etiology of broodstock ofLitopenaeusvannameiwith black-gill disease，the etiology were analyzed in sick broodstock.The results showed that a large number of nematodes were observed in the gill filament of sick broodstockLitopenaeusvannamei.The characteristics of nematodes micro-structure showed that the length of female and male of nematode were(983.6±16.69)μm and(956.9±12.14)μm，respectively.The features were cuticle heterogeneous with lateral differentiation of two longitudinal rows of dots，buccal cavity with three solid teeth，four cephalic setae，five cup-shaped precloacal supplements，amphids transversely oval and curved，and posterior oesophageal bulb not distinctly set off.According to the morphological analysis，the nematodes were identified as Chromadoridae，Chromadorella.Pathological observation showed that after the nematode parasitization，the gill tissues of broodstock were necrosis，dissolution and melanin deposition，while the swim foot base appears black layer.In conclusion，a black-gill disease in broodstock ofLitopenaeusvannameicaused by nematode of genusChromadorellawas reported in this paper.

Litopenaeusvannamei；black-gill disease symptoms；nematodes；pathological observation

2016-11-04

福建省科技廳公益專項(2015R1003-6)；福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項〔閩海洋高新(2014)18號〕；福建省海洋與漁業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整專項(2015白蝦生態(tài)育苗)；閩臺重要海洋生物資源高值化開發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺(2014FJPT01)；福建重要海洋經(jīng)濟(jì)生物種質(zhì)庫與資源高效開發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺(14PZY017NF17).

楊求華(1988-)，男，碩士，工程師/執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師， 研究方向：水產(chǎn)動植物病害防治. E-mail：qhyang1314@163.com

周 宸(1961-)，男，教授級高工，從事水產(chǎn)病害防治技術(shù)研究. E-mail：ccdafj@fjscs.ac.cn

S945.1

A

1006-5601(2017)02-0085-05

楊求華，楊章武，曹英昆，等.凡納濱對蝦越冬親蝦黑鰓病癥的初步研究[J].漁業(yè)研究，2017，39(2)：85-89.