白藜蘆醇對(duì)花萼海綿誘癌素所致小鼠空間記憶障礙的預(yù)防作用*

李 穎， 向 瑤， 鄧惠萍， 朱婷婷， 趙玉蓉， 李夏春

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系， 湖北 宜昌 443002)

白藜蘆醇對(duì)花萼海綿誘癌素所致小鼠空間記憶障礙的預(yù)防作用*

李 穎， 向 瑤， 鄧惠萍， 朱婷婷， 趙玉蓉， 李夏春△

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系， 湖北 宜昌 443002)

目的： 探討腹腔注射白藜蘆醇對(duì)昆明小鼠側(cè)腦室注射花萼海綿誘癌素引起的空間記憶障是否有預(yù)防作用。方法: 2月齡昆明小鼠44只隨機(jī)分為4組，分別為生理鹽水對(duì)照組、模型組、白藜蘆醇低劑量組和白藜蘆醇高劑量組；生理鹽水對(duì)照組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水，白藜蘆醇低劑量組和白藜蘆醇高劑量組分別腹腔注射白藜蘆醇5 mg/kg和10 mg/kg共21 d，除對(duì)照組外，第22天從側(cè)腦室注射花萼海綿誘癌素4 μL, 第27天進(jìn)行Morris水迷宮定位航行訓(xùn)練，持續(xù)6 d，24 h后進(jìn)行尋找平臺(tái)潛伏期檢測(cè)。再處死小鼠，進(jìn)行灌流固定做高爾基染色觀察神經(jīng)元樹(shù)突和樹(shù)突棘，并取新鮮腦海馬勻漿后檢測(cè)SOD活性。結(jié)果: 白藜蘆醇低劑量組顯著縮短側(cè)腦室注射花萼海綿誘癌素引起的逃避潛伏期。白藜蘆醇低劑量組顯著增加側(cè)腦室注射花萼海綿誘癌素引起的CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹(shù)突的長(zhǎng)度和分枝數(shù)目。白藜蘆醇低劑量組顯著增加側(cè)腦室注射花萼海綿誘癌素引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹(shù)突棘的密度。白藜蘆醇高劑量組顯著增加花萼海綿誘癌素引起的海馬SOD活性，而低劑量組并不改變SOD活性。結(jié)論: 低劑量白藜蘆醇對(duì)側(cè)腦室注射花萼海綿誘癌素引起的空間記憶障礙具有預(yù)防作用，其機(jī)制可能與減輕花萼海綿誘癌素引起的樹(shù)突損傷有關(guān)。

白藜蘆醇； 花萼海綿誘癌素； 空間記憶； 樹(shù)突

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是具有抗腫瘤、保護(hù)心血管、防止機(jī)體老化等功效的多酚類(lèi)物質(zhì)，其主要作用機(jī)制為抗氧化應(yīng)激和抗炎癥反應(yīng)。研究報(bào)道白藜蘆醇可改善健康老人的記憶力和海馬功能及糖代謝[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)慢性白藜蘆醇處理可改善衰老大鼠的單胺神經(jīng)遞質(zhì)合成和認(rèn)知[2]。另外，也發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可顯著減輕鏈脲佐菌素引起的大鼠記憶障礙并對(duì)tau過(guò)度磷酸化有抑制作用[3-4]。蛋白磷酸酶(protein phosphatase,PP)2A活性下降在阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)患者腦內(nèi)tau蛋白過(guò)度磷酸化、Aβ過(guò)度產(chǎn)生和突觸抑制中起關(guān)鍵作用[5]。最近發(fā)現(xiàn)在11月齡AD小鼠(Tg2576)海馬和前額葉皮層沉默抑制PP2A的基因I2PP2A的表達(dá)，可減少I(mǎi)2PP2A和PP2A催化亞基的結(jié)合，從而使PP2A活性恢復(fù)，也可通過(guò)抑制APP的過(guò)度磷酸化和β-分泌酶的活性減輕淀粉樣變，還可改善小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力[6]。因此，糾正PP2A活性下降和水平下降在AD的治療中起著重要作用?；ㄝ嗪＞d誘癌素(calyculin A，CA)是PP2A和PP1的特異性抑制劑，研究報(bào)道花萼海綿誘癌素側(cè)腦室注射可引起大鼠突觸素丟失、記憶維持障礙及tau蛋白過(guò)度磷酸化[6-7]等AD樣病理變化。但大鼠的基因與人類(lèi)基因差異比小鼠與人類(lèi)的基因差異大很多；為獲得更加接近人類(lèi)AD病的研究結(jié)果，我們從小鼠側(cè)腦室注射花萼海綿誘癌素，觀察其是否引起小鼠空間記憶障礙，同時(shí)檢測(cè)白藜蘆醇是否對(duì)其有改善作用，探討在C57小鼠腹腔注射白藜蘆醇3周是否能預(yù)防側(cè)腦室注射花萼海綿誘癌素引起的空間記憶障礙。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠20～25 g，雄性，44只(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為42010200000249，常規(guī)分籠喂養(yǎng)于光照/黑暗為12 h/12 h 的恒溫環(huán)境，自由攝食和飲水。飼養(yǎng)至2月齡后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)遵循三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用相關(guān)倫理要求。

2 主要試劑藥物和儀器

花萼海綿誘癌素購(gòu)于Abcam；白藜蘆醇購(gòu)于MedChemExpress。Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)為成都泰盟產(chǎn)品。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物分組和腹腔注射 小鼠按照隨機(jī)分組原則分為生理鹽水對(duì)照(control)組、CA模型組、低劑量白藜蘆醇組(low Res組)和高劑量白藜蘆醇組(high Res組)。生理鹽水組和CA組的小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射白藜蘆醇(4 mg/kg和8 mg/kg)可升高小鼠雌激素和腦啡肽酶的水平，并減輕LPS誘導(dǎo)的工作記憶和局部運(yùn)動(dòng)障礙[8]，我們選擇了與其近似的濃度，low Res組和high Res組的小鼠分別腹腔注射5 mg/kg和10 mg/kg白藜蘆醇，連續(xù)注射21 d。

3.2 側(cè)腦室注射花萼海綿誘癌素 第22天，小鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后固定于小鼠腦立體定位儀上。顱頂備皮消毒后，切開(kāi)頭頂皮膚，暴露前囟。微量注射器針尖定位為：前后位為距前囟-0.4 mm；左右位為中線(xiàn)旁開(kāi)1.0 mm；背腹位為距顱骨表面2.3 mm。以顱骨鉆鉆孔，將10 μL微量注射器針頭經(jīng)針孔準(zhǔn)確插入側(cè)腦室停留5 min，緩慢注入終濃度為16 μmol/L的花萼海綿誘癌素(花萼海綿誘癌素儲(chǔ)備液濃度為320 μmol/L，用DMSO溶解，注射前用生理鹽水稀釋至16 μmol/L)4 μL(約1 μL/min)，注射完畢后停留5 min，緩慢退出微量注射器，迅速用骨蠟封閉針孔，嚴(yán)格消毒后縫合手術(shù)切口[7]。小鼠置于加溫平板上待其完全蘇醒后，放回籠中飼養(yǎng)。生理鹽水對(duì)照組按同樣步驟同側(cè)海馬注入同體積生理鹽水，放回籠中飼養(yǎng)。4 d后，待頭部傷口愈合后進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練。

3.3 水迷宮實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持環(huán)境安靜，空間參照物品位置不變，以排除外界干擾。各組進(jìn)行水迷宮測(cè)試。整個(gè)實(shí)驗(yàn)共計(jì)7 d，每只小鼠每天在4個(gè)象限各訓(xùn)練1次，連續(xù)6 d，每次游泳時(shí)限為90 s。潛伏期指大鼠從放入水池到找到隱藏平臺(tái)所用的時(shí)間。若超過(guò)90 s未找到平臺(tái)者停止記錄，將潛伏期記錄為90 s，由測(cè)試者引導(dǎo)其上平臺(tái)休息30 s后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。若找到平臺(tái)也在平臺(tái)上鞏固記憶5 s。第7天測(cè)試，記錄其潛伏期作為衡量大鼠學(xué)習(xí)和測(cè)試成績(jī)的指標(biāo)。

3.4 Golgi染色 各組取3只小鼠進(jìn)行灌注固定后取腦，用新鮮媒染液避光浸泡3 d，每日更換媒染液。1.5%硝酸銀水溶液充分置換媒染液，搖晃清洗3次，直至置換的液體顏色清亮，之后置暗處鍍銀3 d，每日更換新的硝酸銀水溶液。腦塊采用30%蔗糖脫水，冰凍切片機(jī)切片，厚度為35 μm，切片立即用95%乙醇和無(wú)水乙醇脫水10 min，二甲苯透明5 min后，采用中性塑膠封片。每只小鼠留含海馬的24張切片以備照相統(tǒng)計(jì)分析。

3.5 SOD活性的測(cè)定 各組取5只小鼠的兩側(cè)海馬，用生理鹽水勻漿后，按照SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定SOD抑制率。再用BSA法測(cè)定各組腦勻漿蛋白濃度，計(jì)算SOD活力。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示；采用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)樹(shù)突長(zhǎng)度、樹(shù)突分枝數(shù)目和每10 μm的樹(shù)突棘密度，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同劑量Res對(duì)花萼海綿誘癌素所致小鼠尋找平臺(tái)逃避潛伏期延長(zhǎng)的影響

各組小鼠連續(xù)7 d進(jìn)行定位航行訓(xùn)練后，分析尋找隱蔽平臺(tái)的逃避潛伏期結(jié)果顯示：生理鹽水對(duì)照組的逃避潛伏期隨著訓(xùn)練次數(shù)增加逐漸縮短，第6～7天其逃避潛伏期穩(wěn)定在最短時(shí)間?；ㄝ嗪＞d誘癌素組的逃避潛伏期第2天輕度下降后，第3天又返回第1天水平，第4～7天基本穩(wěn)定在平均40 s水平，顯著高于對(duì)照組。低劑量白藜蘆醇組與CA組相比，各天的逃避潛伏期均顯著縮短。高劑量白藜蘆醇組與CA組相比，其各天逃避潛伏期進(jìn)一步延長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。結(jié)果說(shuō)明低劑量白藜蘆醇可顯著改善CA引起的空間學(xué)習(xí)和記憶障礙，高劑量白藜蘆醇不僅對(duì)CA引起的空間學(xué)習(xí)和記憶障礙沒(méi)有改善作用，反而加重其毒性作用。

2 不同劑量白藜蘆醇對(duì)花萼海綿誘癌素所致小鼠CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹(shù)突長(zhǎng)度和分枝數(shù)目的影響

高爾基染色結(jié)果顯示：生理鹽水對(duì)照組CA1區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突分枝較多而長(zhǎng)，CA組CA1區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突數(shù)目與生理鹽水對(duì)照組相比少而短，低劑量白藜蘆醇組與CA組相比，其樹(shù)突長(zhǎng)度延長(zhǎng)且數(shù)目顯著增多，高劑量白藜蘆醇組與CA組相比樹(shù)突分枝數(shù)目和樹(shù)突長(zhǎng)度無(wú)顯著改變，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明：CA側(cè)腦室注射后引起CA1區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突發(fā)育受損，低劑量白藜蘆醇可顯著減輕 CA引起的樹(shù)突生長(zhǎng)受損，高劑量白藜蘆醇對(duì)CA引起的樹(shù)突生長(zhǎng)受損沒(méi)有保護(hù)作用。

Figure 1.Intraperitoneal injection of low-dose resveratrol (Res) attenuated space learning and memory impairment induced by intralateroventricular injection of calyculin A (CA). Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCA group.

圖1 低劑量白藜蘆醇腹腔注射減輕CA側(cè)腦室注射引起的空間學(xué)習(xí)和記憶障礙

Figure 2.Intraperitoneal injection of low-dose resveratrol (Res) attenuated dendritic length shortening and the decrease in the total number of dendritic branches induced by intralateroventricular injection of calyculin A (CA). Mean±SD.n=20～30.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCA group.

圖2 低劑量白藜蘆醇腹腔注射減輕CA側(cè)腦室注射引起的CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹(shù)突長(zhǎng)度變短和樹(shù)突分枝數(shù)目減少

3 不同劑量白藜蘆醇對(duì)花萼海綿誘癌素所致小鼠CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹(shù)突棘密度的影響

樹(shù)突棘的形態(tài)和定量分析結(jié)果顯示，生理鹽水對(duì)照組CA1區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突棘密度較高，CA組CA1區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突棘密度低；低劑量白藜蘆醇組與CA組相比，樹(shù)突棘密度顯著升高。高劑量白藜蘆醇組與CA組樹(shù)突棘密度無(wú)顯著改變，見(jiàn)圖3。結(jié)果說(shuō)明低劑量白藜蘆醇顯著改善CA誘導(dǎo)的樹(shù)突棘密度降低。

Figure 3.Intraperitoneal injection of low-dose resveratrol (Res) attenuated the decreased density of dendritic spines in the hippocampal CA1 neurons induced by intralateroventricular injection of calyculin A (CA). The scale bar=10 μm. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCA group.

圖3 腹腔注射低劑量白藜蘆醇改善CA側(cè)腦室注射引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突棘密度降低

4 不同劑量白藜蘆醇對(duì)花萼海綿誘癌素所致SOD活性的影響

SOD活性檢測(cè)結(jié)果顯示，生理鹽水組與CA組相比SOD活性顯著降低；低劑量白藜蘆醇組與CA組相比SOD活性無(wú)顯著改變；高劑量白藜蘆醇組與CA組相比SOD活性顯著升高，見(jiàn)圖4。結(jié)果說(shuō)明低劑量白藜蘆醇顯著改善CA引起的空間學(xué)習(xí)記憶力降低與SOD活性改善可能無(wú)關(guān)。

Figure 4.Intraperitoneal injection of high-dose resveratrol (Res) attenuated the decreased SOD activity in the hippocampus induced by intralateroventricular injection of calyculin A (CA). Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCA group.

圖4 腹腔注射高劑量白藜蘆醇改善CA側(cè)腦室注射引起的海馬SOD活性降低

討 論

隨著人類(lèi)平均壽命的顯著延長(zhǎng)，與增齡密切相關(guān)的AD的發(fā)病率顯著上升。AD的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，其治療也無(wú)顯著改善。喜歡喝紅酒的法國(guó)人AD患病率顯著低于西方其它高蛋白飲食為主的發(fā)達(dá)國(guó)家[9]，引起西方對(duì)于釀制紅酒中的紅葡萄中的主要成分是否具有延緩神經(jīng)退變的作用進(jìn)行研究。白藜蘆醇是紅葡萄皮中含有的高濃度的多酚。它很容易跨過(guò)血腦屏障，其活性在腦內(nèi)可持續(xù)4 h。最近的研究提示攝入白藜蘆醇可改善健康老人的記憶力，提示白藜蘆醇對(duì)增齡引起的記憶減退有改善作用[1]。AD患者腦內(nèi)過(guò)度磷酸化的tau蛋白組成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)數(shù)目與患者的癡呆程度呈正相關(guān)。而PP2A水平和活性下降是引起AD患者tau蛋白過(guò)度磷酸化的重要機(jī)制[5]。因此， PP2A活性下降是引起AD患者認(rèn)知障礙的重要原因。但PP2A活性下降引起認(rèn)知障礙的機(jī)制尚不完全清楚。

以前的研究結(jié)果顯示PP2A活性下降可引起大鼠突觸素丟失和tau蛋白過(guò)度磷酸化；小鼠的行為反應(yīng)盡管沒(méi)有大鼠豐富多變，但小鼠與人的同源性更近，其結(jié)果可能與人更相近。因此，本研究采用KM小鼠腹腔注射白藜蘆醇21 d后側(cè)腦室注射花萼海綿誘癌素降低PP2A活性，觀察腹腔注射白藜蘆醇升高外周血白藜蘆醇對(duì)PP2A活性降低引起的認(rèn)知障礙是否有預(yù)防作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度白藜蘆醇腹腔注射能顯著預(yù)防PP2A活性降低引起的空間學(xué)習(xí)記憶能力降低，顯著增加CA1區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突長(zhǎng)度和密度以及樹(shù)突棘密度，但并不增加海馬SOD活性。該結(jié)果提示：低劑量白藜蘆醇預(yù)防PP2A活性下降引起的空間記憶障礙可能與其增加CA1區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突生長(zhǎng)和樹(shù)突棘形成有關(guān)。最近的研究顯示白藜蘆醇處理可降低小鼠PGC-1α的乙酰化水平，降低海馬腦片miR-124和miR-134的表達(dá)水平，同時(shí)顯著增加海馬腦片cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達(dá)水平，而miR-134被認(rèn)為位于大鼠神經(jīng)元突觸的樹(shù)突區(qū)可負(fù)性調(diào)節(jié)興奮性突觸后樹(shù)突棘形狀。因此，白藜蘆醇改善CA引起的CA1區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突形狀可能與其降低miR-124和miR-134的表達(dá)水平有關(guān)[10-11]。我們?cè)鴪?bào)道上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞PP2A水平也可改善APP/PS1雙突變小鼠的空間記憶障礙和老年斑沉積[12]，也有報(bào)道白藜蘆醇在PC細(xì)胞和神經(jīng)元可通過(guò)阻斷鎘誘導(dǎo)的PP2A-A亞基表達(dá)下降和逆轉(zhuǎn)PP2A去甲基化和磷酸化，顯著減輕鎘誘導(dǎo)的PP2A活性抑制[13]，因此，白藜蘆醇減輕CA誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙可能與其升高PP2A-A亞基的表達(dá)和阻斷PP2A的去甲基化或磷酸化有關(guān)。其具體機(jī)制值得進(jìn)一步探討。另外，本研究發(fā)現(xiàn)高劑量白藜蘆醇對(duì)CA引起的空間記憶障礙沒(méi)有保護(hù)作用可能與其對(duì)CA引起的樹(shù)突發(fā)育中的損傷沒(méi)有預(yù)防作用有關(guān)。最近也有報(bào)道白藜蘆醇可通過(guò)激活A(yù)MP活化蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]降低海馬BDNF和CREB磷酸化的水平，影響海馬和齒狀回神經(jīng)祖細(xì)胞的生存和增殖，使小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力下降，提示高濃度白藜蘆醇可能不利于神經(jīng)祖細(xì)胞生存和增殖，進(jìn)而影響到樹(shù)突發(fā)育[14]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)低劑量白藜蘆醇腹腔注射可顯著改善CA側(cè)腦室注射引起的空間學(xué)習(xí)和記憶障礙，并顯著改善CA引起的樹(shù)突損傷。本研究為以學(xué)習(xí)記憶障礙為主要癥狀的老年性癡呆疾病的預(yù)防和治療提供了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：陳妙玲, 羅 森)

Prevention of resveratrol on spatial memory loss of mice induced by calyculin A

LI Ying, XIANG Yao, DENG Hui-ping, ZHU Ting-ting, ZHAO Yu-rong, LI Xia-chun

(DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,MedicalSchool,ThreeGorgesUniversity,Yichang443002,China.E-mail: 624275550@qq.com)

AIM: To explore the preventive effect of resveratrol on spatial memory loss of the mice induced by intralateroventricular injection of calyculin A (CA). METHODS: Kunming mice of 2 months (n=44) were divided into saline control group, CA group, low-dose resveratrol group and high-dose resveratrol group. The mice in control group and CA group were intraperitoneally injected with equal volume of saline for 21 d, while the mice in low-dose resveratrol group and high-dose resveratrol group were intraperitoneally injected with resveratrol at 5 mg/kg and 10 mg/kg, respectively. At 22 d, CA (4 μL) was injected into the lateral ventricles in CA group, low-dose resveratrol group and high-dose resveratrol group. Morris water maze test was applied to examine the changes of learning and memory abilities of the mice at 27 d. The Golgi staining was used to observe the morphological changes of dendrites and dendritic spines. The hippocampal tissues were homogenated to detect SOD activity. RESULTS: Low-dose resveratrol significantly decreased the escape latency delay induced by CA. Low-dose resveratrol attenuated the decreases in the number of dendrites and the density of dendritic spines of neurons in hippocampal CA1 region induced by CA. High-dose resveratrol but not low-dose resveratrol attenuated the decreased SOD activity induced by CA. CONCLUSION: Resveratrol at low dose attenuates memory loss in the mice induced by CA though preventing dendrite injury.

Resveratrol; Calyculin A; Spatial memory; Dendrites

1000- 4718(2017)05- 0951- 05

2016- 05- 12

2017- 03- 17

三峽大學(xué)博士啟動(dòng)基金(No. KJ2013B056)

R965； R749.2+9； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.031

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