IL-19及其受體與慢性鼻-鼻竇炎組織重塑的相關性研究*

李 霞， 常利紅， 黃子真， 王志遠， 陳賢珍， 王 君， 張革化

(中山大學附屬第三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科， 廣東 廣州 510630)

IL-19及其受體與慢性鼻-鼻竇炎組織重塑的相關性研究*

李 霞， 常利紅， 黃子真， 王志遠， 陳賢珍， 王 君， 張革化△

(中山大學附屬第三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科， 廣東 廣州 510630)

目的： 探討白細胞介素19(interleukin-19，IL-19)及其受體 (IL-20R1/IL-20R2)在不同類型慢性鼻-鼻竇炎[慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉 (chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)和慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP)]患者中表達的差異，并分析其與慢性鼻-鼻竇炎組織重塑的相關性。方法: 研究共分3組：CRSwNP組(30例)、CRSsNP組(15例)和對照組(鼻中隔偏曲患者15例)。實時熒光定量PCR檢測IL-19及其受體(IL-20R1/IL-20R2)和組織重塑因子基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP)-1的 mRNA相對表達量；免疫組化檢測IL-19及其受體的蛋白表達量；ELISA檢測MMP-9、TIMP-1的蛋白表達量。結果: CRSwNP組IL-19、IL-20R1、IL-20R2和MMP-9的mRNA和蛋白表達量高于CRSsNP組和對照組(P<0.05)，CRSsNP組TIMP-1的mRNA和蛋白的表達量均高于CRSwNP組和對照組 (P<0.05)； MMP-2的mRNA和蛋白的表達量在各組無顯著差異。CRSwNP組IL-19、IL-20R1和IL-20R2均與MMP-9的mRNA相對表達量呈正相關(P<0.05)；IL-19及其受體與TIMP-1的mRNA相對表達量無明顯相關。結論: IL-19及其受體的mRNA在CRSwNP中高表達，且與MMP-9 mRNA表達呈正相關，提示二者可能存在交互作用，可能參與慢性鼻-鼻竇炎的組織重塑。

慢性鼻-鼻竇炎； 組織重塑； 白細胞介素19； 基質金屬蛋白酶9； 金屬蛋白酶組織抑制物1

慢性鼻-鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)是鼻腔及鼻竇的慢性炎性疾病,其發(fā)病與多種因素相關，機制復雜。目前臨床上將CRS分為慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)和慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP) 2種類型[1]。研究認為不同類型CRS的炎癥反應類型及組織重塑特性不同：CRSwNP以假性囊腫形成、炎癥細胞浸潤和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)合成降低為特征；CRSsNP則以間質纖維化、膠原沉積和ECM合成增加為特征[2]。ECM的合成和降解失衡是決定CRS病變性質和預后的重要因素?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)是調節(jié)ECM平衡的主要因子，MMPs/TIMPs失衡可能是導致組織重塑的機制之一[3]。新近研究發(fā)現(xiàn)，IL-19在多種慢性炎癥性及自身免疫性疾病中表達，發(fā)揮調節(jié)炎癥和免疫的作用，并最終影響組織重塑[4-6]。然而目前國內外關于IL-19及其受體在CRS中的研究較少，其與組織重塑及MMPs、TIMPs間的關系亦不明確。因此，本研究旨在觀察IL-19及其受體與CRS組織重塑的關系，為進一步探討CRS發(fā)病機制提供實驗資料。

材 料 和 方 法

1 標本采集和處理

標本采自于2013年7月～2015年1月在我科住院的患者，研究組45例CRS，其中CRSwNP 30例(男21例，女9例；年齡17～75歲)，CRSsNP 15例(男9例，女6例；年齡26～71歲)；對照組15例，為同期住院行鼻中隔手術的患者(男11例，女4例；年齡19～57歲)；各組患者年齡及性別構成比差異無統(tǒng)計學意義。術中采集CRSwNP組的息肉組織，CRSsNP組的竇口鼻道復合體黏膜，對照組下鼻甲黏膜。排除標準：(1)有下列疾病患者：自身免疫性疾病、阿司匹林不耐受三聯(lián)征，原發(fā)性纖毛運動功能障礙和囊性纖維化；(2)有下列藥物近期用藥史患者：術前1個月內使用抗菌藥物、糖皮質激素類藥物治療。所有患者均簽署知情同意書。

新鮮標本離體后用生理鹽水清洗表面的黏液和血漬，分為3份，2份置于-80℃凍存；另一份用10%甲醛溶液固定。

2 主要儀器和試劑

熒光定量PCR儀(ABI7500)；生物顯微鏡(Leica)；酶標儀(Thermo)；TRIzol(Invitrogen)；逆轉錄試劑盒、SYBR定量 PCR 試劑盒(TaKaRa)；羊抗人IL-19(Santa Cruz)；鼠抗人IL-20R1(R&D)；兔抗人IL-20R2(Abcam)； HRPⅡ抗(Bioworld)；山羊血清(北京博奧森公司)；兔血清(NQBB)；二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色劑(北京中杉金橋公司)；MMP-9和TIMP-1 ELISA試劑盒(武漢華美公司)；蛋白酶抑制劑(MCE)；所用引物由英濰捷基公司合成，具體序列見表1。

表1 引物序列表

F: forward； R： reverse.

3 主要方法

3.1 RT-qPCR檢測組織中IL-19、IL-20R1、IL-20R2、MMP-9、MMP-2和TIMP-1的mRNA相對表達量 TRIzol法提取總RNA，反轉錄為cDNA。10 μL PCR反應體系：cDNA 1μL，引物0.2 μmol/L，ROX DyeⅡ，SYBR Premix Ex Taq。IL-19、IL-20R1和IL-20R2反應條件：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 15 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，45個循環(huán)；MMP-2、MMP-9和TIMP-1反應條件：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min， 72 ℃ 1 min， 45個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計算相對表達量。

3.2 免疫組織化學染色 S-P二步法進行染色。新鮮組織經10%甲醛溶液固定、石蠟包埋后連續(xù)4 μm切片。60 ℃烤片1 h，常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟復水、枸櫞酸鹽溶液高壓熱修復5 min，3% H202阻斷內源性過氧化物酶活性。Ⅰ抗4 ℃孵育過夜(羊抗人IL-19抗體1∶100，鼠抗人IL-20R1抗體1∶20，兔抗人IL-20R2抗體1∶50)，Ⅱ抗37 ℃孵育1 h， DAB顯色，顯微鏡下觀察染色至適度終止。蘇木素復染，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯溶液透明，封片。

免疫組織化學染色結果判定標準： 2位病理學專家雙盲獨立評分。100倍顯微鏡下按切片染色強度評分：無色為0分, 淡黃色為1分, 棕黃色為2分, 棕褐色為3分。400倍顯微鏡下隨機選取5個上皮細胞富集的視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性染色細胞百分比，按5個視野陽性細胞百分比的平均值計分：0為0分, 1%～25%為1分, 26%～50%為2分, 51%～75%為3分, 76%～100%為4分。將以上2項得分相加(總分0～7分)，<3分為(-)，3分為(+)，4～5分為(++)，6～7分為(+++)。

3.3 ELISA 液氮中研磨組織成粉狀，每100 mg組織干粉加1 mL蛋白提取緩沖液(含蛋白酶抑制劑的PBS)，4 ℃ 10 000 r/min 離心組織勻漿液10 min后取上清，置于-80℃冰箱保存待用。ELISA檢測組織勻漿上清中MMP-9和TIMP-1的蛋白含量，繪制標準曲線，計算被測蛋白的濃度。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0進行分析。多組比較采用Kruskal-WallisH檢驗，置信區(qū)間采用Bonferroni校正；兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗。相關性分析采用Spearman檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 IL-19及其受體(IL-20R1/IL-20R2)的mRNA及蛋白表達水平

CRSwNP組IL-19、 IL-20R1和IL-20R2的mRNA表達水平高于CRSsNP組和對照組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of IL-19, IL-20R1 and IL-20R2 in human CRS and control tissues. CRSwNP: chronic rhinosinusitis with nasal polyps (n=30); CRSsNP: chronic rhinosinusitis without nasal polyps (n=15); control：n=15.*P<0.05，**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsCRSsNP.

圖1 CRS和對照組IL-19及其受體(IL-20R1/IL-20R2)的mRNA表達水平

IL-19、IL-20R1和IL-20R2蛋白均主要表達在鼻黏膜上皮細胞和黏膜下炎癥細胞中，表達位置具有一致性。IL-19、IL-20R1和IL-20R2陽性染色主要定位于細胞質和細胞膜，且CRSwNP組陽性率高于CRSsNP組和對照組，見圖2。

2 組織重塑因子(MMP-2、MMP-9和TIMP-1)mRNA及蛋白的表達水平

CRSwNP組MMP-9的mRNA表達水平高于CRSsNP組和對照組(P<0.05)；CRSsNP組TIMP-1的mRNA表達水平高于CRSwNP組和對照組(P<0.05)；MMP-2 mRNA在3組間的表達無顯著差異，見圖3。

CRSwNP組MMP-9蛋白水平高于CRSsNP組和對照組(P<0.05)， CRSsNP組TIMP-1蛋白水平高于CRSwNP組和對照組(P<0.05)，見圖4。

3 IL-19及其受體(IL-20R1/IL-20R2)與組織重塑因子的相關性分析

在CRSwNP中，IL-19及其受體(IL-20R1/IL-20R2) mRNA表達水平與MMP-9 mRNA表達水平呈正相關(P<0.05)；CRSsNP和對照組中，IL-19及其受體與MMP-9 mRNA無明顯相關。IL-19及其受體(IL-20R1/IL-20R2)mRNA表達水平與TIMP-1 mRNA表達水平無明顯相關，見圖5。

討 論

CRS是鼻腔及鼻竇的異質性慢性炎性疾病，發(fā)病機制至今尚不明確，以往研究認為該類疾病的發(fā)生可能是多種致病因素參與、多種信號通路調節(jié)的結果[7]。組織重塑是氣道慢性炎癥的主要病理特征，是決定 CRS 病變性質和預后的重要因素。MMPs是以細胞外基質蛋白為主要底物的一組鈣離子活化鋅離子依賴的肽鏈內切酶總稱。TIMPs是MMPs的天然組織抑制物，TIMP-1可以抑制所有MMPs的活性。MMPs和TIMPs之間的平衡在細胞外基質和基底膜成分更新和穩(wěn)態(tài)維持的過程中發(fā)揮重要作用，是調節(jié)組織重塑的關鍵因素之一[3]。與以往對CRS組織上清的研究[8]一致，本研究發(fā)現(xiàn)在mRNA和蛋白水平，CRSwNP組中MMP-9表達明顯高于CRSsNP和對照組，TIMP-1在CRSsNP組中表達明顯高于CRSwNP和對照組，提示MMP-9/TIMP-1參與了CRS的組織重塑過程。

Figure 2.The expression of IL-19, IL-20R1 and IL-20R2 in human CRS and control tissues (immunohistochemical staining，×400). CRSwNP： chronic rhinosinusitis with nasal polyps (n=15)； CRSsNP： chronic rhinosinusitis without nasal polyps (n=15)； control：n=10.**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsCRSsNP.

圖2 CRS和對照組IL-19及其受體的蛋白表達水平

Figure 3.The mRNA expression of MMP-2, MMP-9 and TIMP-1 in human CRS and control tissues. CRSwNP: chronic rhinosinusitis with nasal polyps (n=30); CRSsNP: chronic rhinosinusitis without nasal polyps (n=15); control：n=15.*P<0.05,**P<0.01vscontrol；#P<0.05vsCRSsNP.

圖3 CRS和對照組組織重塑因子MMP-2、MMP-9和TIMP-1的mRNA表達水平

Figure 4.The protein expression of MMP-9 and TIMP-1 in human CRS and control tissues detected by ELISA. CRSwNP: chronic rhinosinusitis with nasal polyps (n=15); CRSsNP: chronic rhinosinusitis without nasal polyps (n=15); control：n=10.*P<0.05,**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsCRSsNP.

圖4 CRS和對照組組織重塑因子MMP-9和TIMP-1的蛋白表達水平

Figure 5.Correlations between the expression of IL-19, IL-20R1 or IL-20R2 and tissue remodeling factor MMP-9 in CRSwNP (chronic rhinosinusitis with nasal polyps). A: IL-19 was positively correlated with MMP-9 (rs=0.421，P=0.020); B: IL-20R1 was positively correlated with MMP-9 (rs=0.385，P=0.039); C: IL-20R2 was positively correlated with MMP-9 (rs=0.435，P=0.018).

圖5 CRSwNP組IL-19及其受體與組織重塑因子MMP-9的相關性分析

IL-20亞家族成員(IL-19、IL-20、IL-22、IL-24和IL-26)通過與細胞表面特異性受體的結合，在多種慢性炎癥性疾病的組織重塑中發(fā)揮重要作用[4]。本研究結果顯示：IL-19及其受體(IL-20R1/IL-20R2)主要在鼻黏膜上皮中表達；在CRS中表達高于對照組，尤其是CRSwNP組的鼻黏膜上皮中。有研究也發(fā)現(xiàn)IL-19在歐洲人群CRSwNP中高表達，但并未對IL-19受體表達進行研究[9]。本研究還發(fā)現(xiàn)CRSwNP鼻黏膜組織中IL-19和MMP-9在mRNA水平呈正相關，提示IL-19在CRSwNP鼻黏膜組織中的作用可能為與其受體結合后促進MMP-9的表達，進而導致ECM降解組織水腫。然而目前對MMP-2在CRS的表達尚存在爭議，有研究認為MMP-2在以水腫為特征的CRSwNP組增高[10]，也有研究[11]與本研究結果一致，MMP-2在各組表達無顯著差異，可能與MMP-2表達量低而樣本量有限，因此，不能真實體現(xiàn)其表達水平，或與標本的取材位置有關。

鼻黏膜與下氣道黏膜具有延續(xù)性，IL-19在CRS組織重塑中的調控機制可能與其誘導下氣道慢性炎癥具有相似的途徑。研究發(fā)現(xiàn)在哮喘患者氣道上皮細胞、在肺黏膜上皮細胞及浸潤的免疫細胞中高表達的IL-19及其受體IL-20R1、IL-20R2，可通過激活T細胞促進Th2型細胞因子產生，還可通過結合其特異性受體激活STAT1、STAT3通路提高氣道高反應性并促進哮喘的炎癥反應，而Th2細胞因子IL-4、IL-13聯(lián)合IL-17A可通過NF-κB及STAT6通路正向反饋上調IL-19的表達[12-13]。IL-20亞家族參與其它慢性炎癥性疾病的組織重塑研究中發(fā)現(xiàn)：IL-20可促進椎間盤突出患者椎間盤細胞中MMP-3的表達[14]；也有研究發(fā)現(xiàn)IL-20可以促進肝纖維化，抗IL-20、抗IL-20R1治療后小鼠肝臟TGF-β1、 TIMP-3和TIMP-4減少，同時MMP-2、MMP-3和MMP-13合成增加，進而抑制細胞外基質的募集，促進I型膠原沉積，導致肝纖維化減輕[15]。

本研究證實在國人CRSwNP中存在IL-19及其受體(IL-20R1/IL-20R2)和MMP-9的高表達及TIMP-1的低表達，且IL-19及其受體與MMP-9在mRNA水平呈正相關關系，提示IL-19及其受體可能參與了CRS組織重塑的發(fā)生發(fā)展, 其具體的分子機制還有待進一步研究。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Correlation of IL-19 and its receptors with tissue remodeling in chronic rhinosinusitis

LI Xia, CHANG Li-hong, HUANG Zi-zhen, WANG Zhi-yuan, CHEN Xian-zhen, WANG Jun, ZHANG Ge-hua

(DepartmentofOtorhinolaryngology，Head&NeckSurgery,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:gehuazh@hotmail.com.cn)

AIM: To explore the differential expression of interleukin-19 (IL-19) and its receptors (IL-20R1/IL-20R2) in the samples of chronic rhinosinusitis (CRS) with or without nasal polyps (CRSwNP and CRSsNP), and to investigate the correlation of IL-19 and its receptors with tissue remodeling factors, including matrix metalloproteinase (MMP)-2, MMP-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)-1 in CRS. METHODS: The polyps from CRSwNP patients (n=30), the sinus mucosa from CRSsNP patients (n=15) and the inferior turbinal mucosa of nasal septum de-viation patients (n=15) were collected. The expression of IL-19 and its receptors (IL-20R1/IL-20R2) in each group was detected by real-time RT-PCR and immunohistochemistry. The expression of tissue remodeling factors MMP-2, MMP-9 and TIMP-1 in different groups was detected by real-time RT-PCR and ELISA. RESULTS: Increased mRNA and protein expression levels of IL-19, IL-20R1, IL-20R2 and MMP-9 were observed in CRSwNP group compared with CRSsNP and control group (P<0.05), while elevated expression level of TIMP-1 was observed in CRSsNP group compared with CRSwNP and control group (P<0.05). The relative expression of MMP-2 among the 3 groups showed no obvious difference. The expression of IL-19 and its receptors showed significantly positive correlations with MMP-9 in CRSwNP (P<0.05). No significant correlation between IL-19 and/or its receptors with TIMP-1 in CRSwNP group was observed. CONCLUSION: The high expression levels of IL-19, IL-20R1 and IL-20R2 and their positive correlations with MMP-9 in CRSwNP indica-te that IL-19 and its receptors may be involved in the tissue remodeling of chronic rhinosinusitis.

Chronic rhinosinusitis; Tissue remodeling; Interleukin-19; Matrix metalloproteinase-9; Tissue inhibitor of metalloproteinase-1

1000- 4718(2017)05- 0919- 06

2017- 01- 09

2017- 03- 20

國家自然科學基金資助項目(No.81371073; No.81670913)； 廣東省自然科學研究計劃項目(No. 2013B021800081)

R765

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.025

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