酸中毒致大鼠離體冠狀動脈收縮的機(jī)制*

賀澤芳， 侯曉敏， 楊 蓉， 范芳文， 郭鵬美， 劉 宇， 張明升

(山西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，山西 太原 030001)

酸中毒致大鼠離體冠狀動脈收縮的機(jī)制*

賀澤芳， 侯曉敏， 楊 蓉， 范芳文， 郭鵬美， 劉 宇， 張明升△

(山西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，山西 太原 030001)

酸中毒是臨床上比較常見的病理生理改變，糖尿病酮癥、低氧血癥、休克和腎疾患等多種病因均可誘發(fā)，可誘發(fā)一系列嚴(yán)重的心血管功能紊亂[1]。冠狀動脈主要為心肌組織提供氧氣和養(yǎng)分，當(dāng)冠狀動脈酸中毒時，整個心臟的功能將受到嚴(yán)重影響[2]。

氯離子是生物體中含量最豐富的陰離子。血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的氯離子一般維持在高于平衡電位的水平，如此高濃度的細(xì)胞內(nèi)氯離子在很多功能上起重要作用，如細(xì)胞內(nèi)pH、細(xì)胞容積、細(xì)胞收縮性和膜電位，氯離子的很多細(xì)胞功能均依賴于氯離子通道的激活[7]。氯離子通道是氯離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的一個主要途徑。在血管平滑肌細(xì)胞中，氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)體和氯離子通道參與調(diào)節(jié)血管張力和維持動脈血壓[8]。本研究初步探討氯離子跨細(xì)胞膜運(yùn)動在酸中毒引起RCA收縮中的作用。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，酸中毒引起的RCA收縮可能與鉀通道、鈣通道、質(zhì)子泵、一氧化氮生成以及內(nèi)鈣釋放等有關(guān)。本研究用NHE-1選擇性抑制劑cariporide (HOE-642)和NBC抑制劑S0859進(jìn)一步探討細(xì)胞外酸中毒(pHex6.8)引起RCA收縮的機(jī)制，同時觀察氯離子跨細(xì)胞膜運(yùn)動是否參與了酸中毒引起的RCA收縮。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物

正常雄性Sprague-Dawley大鼠，7周齡左右，230～270 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號為SCXK(軍)2012-0004。受試動物在本教研室動物房喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

2 主要試劑和儀器

U46619、NPPB、NFA、HOE-642、S0859和NaBr均購自Sigma；其余為市售分析純。正常PSS液的成分為(mmol/L)：NaCl 118, KCl 4.5, CaCl22.5, KH2PO40.8, MgCl2·6H2O 1.2, NaHCO320, glucose 10。pH 6.8的PSS液成分為(mmol/L)：20 mmol/L NaHCO3用6.0 mmol/L NaHCO3和14 mmol/L NaCl等量替換，其余同上。

PowerLab生物信號采集分析系統(tǒng)及張力換能器(ADInstruments)；Multi Myograph System-610M微血管張力記錄儀(DMT)；Nikon解剖顯微鏡(Olympus)；PHS-3C精密pH計(上海雷磁公司)等。

3 主要方法

3.1 大鼠冠狀動脈環(huán)的準(zhǔn)備 大鼠斷頭處死后立即取出心臟，置于正常PSS液(4 ℃， pH 7.4， 95% O2+ 5% CO2飽和)中。在解剖顯微鏡下用顯微剪和鑷剔除周圍組織，依次分離出冠脈的室間隔支、室壁支和前降支，將其剪成約2 mm的血管環(huán)，通過2根鋼絲(直徑40 μm)固定于DMT記錄儀。具體的血管環(huán)固定方法、標(biāo)準(zhǔn)化、活性測定以及實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性檢測參照文獻(xiàn)[9]。

3.2 NHE-1和NBC抑制劑對酸中毒引起RCA收縮的影響 血管環(huán)在盛有5 mL正常PSS液、38 ℃恒溫、持續(xù)通入95% O2+ 5% CO2氣體的浴槽中穩(wěn)定60 min，期間每隔15 min換液1次。調(diào)節(jié)跨壁壓使其相當(dāng)于80 mmHg，以保證處于最適前負(fù)荷狀態(tài)。再將浴槽內(nèi)更換為同體積的KCl (60 mmol/L)刺激血管環(huán)收縮，當(dāng)連續(xù)刺激3次的收縮幅度差異小于10%，認(rèn)為血管環(huán)反應(yīng)良好，開始正式實(shí)驗(yàn)。將浴槽內(nèi)正常PSS液更換為pH 6.8的PSS液，待反應(yīng)達(dá)平臺后，用正常PSS液連續(xù)洗脫2次，使張力恢復(fù)到基礎(chǔ)狀態(tài)，穩(wěn)定30 min后，向浴槽內(nèi)加入終濃度為30 μmol/L HOE-642或100 μmol/L S0859，預(yù)孵30 min，更換為pH 6.8的PSS液，觀察酸堿轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑對pHex6.8引起RCA收縮的影響。以KCl (60 mmol/L)所致的最大收縮幅度為100%。

3.3 氯離子通道抑制劑對酸中毒引起RCA收縮的影響 同上，在觀察了pHex6.8引起冠狀動脈環(huán)收縮后，在靜息狀態(tài)下，向浴槽內(nèi)分別加入氯離子通道抑制劑5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸[5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid， NPPB； 濃度分別為10、30和100 μmol/L]或尼氟滅酸(niflunic acid， NFA; 濃度分別為10、30和100 μmol/L)預(yù)孵20 min，再更換為pH 6.8的PSS液。觀察不同濃度NPPB或NFA對pHex6.8引起RCA收縮的影響。以pHex6.8所致的最大收縮幅度為100%。

3.4 氯離子通道抑制劑對KCl或U46619引起RCA收縮的影響 在靜息狀態(tài)下，向浴槽內(nèi)加入KCl (60 mmol/L)，待血管環(huán)收縮達(dá)坪臺后，用pH 7.4的正常PSS液連續(xù)沖洗2次，恢復(fù)到靜息狀態(tài)穩(wěn)定30 min后，向浴槽內(nèi)分別加入不同濃度(10、30、100和300 μmol/L)的NPPB或NFA，預(yù)孵20 min，更換為KCl (60 mmol/L)溶液，觀察NPPB和NFA對KCl引起RCA收縮的影響。同樣，觀察100 μmol/L NPPB或NFA對U46619 (1 μmol/L)引起RCA收縮的影響。以KCl (60 mmol/L)所致的最大收縮幅度為100%。

3.5 細(xì)胞外液去除氯離子對酸中毒引起RCA收縮的影響 在靜息狀態(tài)下，將浴槽內(nèi)pH 7.4的正常PSS液更換為pH 6.8的PSS液，待反應(yīng)達(dá)坪臺后，用pH 7.4的正常PSS液連續(xù)沖洗2次，恢復(fù)到靜息狀態(tài)穩(wěn)定后，用NaBr等摩爾代替PSS液中的NaCl，穩(wěn)定20 min，更換為pH 6.8的PSS液，觀察細(xì)胞外液去除氯離子對pHex6.8引起RCA收縮的影響。以KCl (60 mmol/L)所致的最大收縮幅度為100%。

3.6 細(xì)胞外液去除氯離子對KCl或U46619引起RCA收縮的影響 在靜息狀態(tài)下，向浴槽內(nèi)加入KCl (60 mmol/L)或U46619 (1 μmol/L)，待血管環(huán)收縮達(dá)平臺后，用pH 7.4的正常PSS液連續(xù)沖洗2次，恢復(fù)到靜息狀態(tài)穩(wěn)定后，用溴化鈉代替PSS液中的NaCl，穩(wěn)定20 min，加入KCl (60 mmol/L)或U46619 (1 μmol/L)，觀察細(xì)胞外液去除氯離子對KCl或血栓素A2 的類似物U46619引起RCA收縮的影響。以KCl (60 mmol/L)所致的最大收縮幅度為100%。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用GraphPad Prism 6作圖，SPSS 19.0進(jìn)行配對t檢驗(yàn)和兩因素重復(fù)測量方差分析。通過非線性回歸計算IC50值(抑制50% 最大收縮時所需要的藥物濃度)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NHE-1和NBC抑制劑對酸中毒引起RCA收縮的影響

將pH 7.4的正常PSS液更換為pH 6.8的PSS液后，引起的RCA最大收縮幅度為(3.90±0.95)mN，相當(dāng)于KCl(60 mmol/L)最大收縮幅度的(105.07±10.65)%。30 μmol/L HOE-642可使pHex6.8引起的RCA收縮幅度降低(18.46±5.29)%(P<0.01)。100 μmol/L S0859使其收縮幅度降低(14.90±3.24)%(P<0.01)，見圖1。

2 氯離子通道抑制劑對酸中毒引起RCA收縮的影響

預(yù)孵NPPB或NFA (10、30和100 μmol/L)后，均呈濃度依賴性地抑制酸中毒引起的RCA收縮(P<0.05)。不同濃度NPPB對pHex6.8引起RCA收縮的抑制百分比分別為(15.25±8.16)%、(44.40±8.92)%和(66.61±7.07)%，IC50值為43.62 μmol/L。不同濃度NFA對pHex6.8引起RCA收縮的抑制百分比分別為(24.31±9.51)%、(33.07±14.21)%和(64.48±11.68)%，IC50值為54.77,見圖2。

Figure 1.The effects of NHE-1 inhibitor HOE-642 and NBC inhibitor S0859 on the RCA contraction induced by extracellular acidosis. Contractions were expressed as percentages of the maximal contraction induced by KCl (60 mmol/L). Mean±SD.n=6.**P<0.01vspHex6.8.

圖1 NHE-1和NBC抑制劑對酸中毒引起RCA收縮的影響

Figure 2.The effects of inhibitors of chloride channel on the RCA contraction induced by extracellular acidosis. Contractions were expressed as percentages of contraction induced by pHex6.8. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vspHex6.8.

圖2 氯離子通道抑制劑對酸中毒引起RCA收縮的影響

3 氯離子通道抑制劑對KCl或U46619引起RCA收縮的影響

預(yù)孵NPPB或NFA (10、30、100和300 μmol/L)后，均呈濃度依賴性地抑制KCl (60 mmol/L)引起的RCA收縮(P<0.05)，最大抑制百分比分別為(83.51±3.13)%和(52.37±12.31)%，IC50值分別為87.78 μmol/L和284.4 μmol/L，見圖3。100 μmol/L的NPPB或NFA對U46619引起RCA收縮的抑制百分比分別為(44.04±9.68)%和(46.23±5.24)%，見圖4。

Figure 3.The effects of inhibitors of chloride channel on the RCA contraction induced by KCl (60 mmol/L). Contractions were expressed as percentages of contraction induced by KCl (60 mmol/L). Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsKCl.

圖3 氯離子通道抑制劑對KCl引起RCA收縮的影響

4 細(xì)胞外液去除氯離子對酸中毒引起RCA收縮的影響

用NaBr代替PSS液中的NaCl后，幾乎完全抑制pHex6.8引起的RCA收縮(P<0.01)，而對KCl(60 mmol/L)或U46619 (1 μmol/L)引起的RCA收縮無顯著影響,見圖5。

Figure 4.The effects of inhibitors of chloride channel on the RCA contraction induced by U46619 (1 μmol/L). Contractions were expressed as percentages of contraction induced by KCl (60 mmol/L). Mean±SD.n=6.**P<0.01vsU46619.

圖4 氯離子通道抑制劑對U46619引起RCA收縮的影響

Figure 5.The effects of extracellular chloride ion deprivation on the RCA contraction induced by extracellular acidosis, KCl or U46619. Contractions were expressed as percentages of contraction induced by KCl (60 mmol/L). Mean±SD.n=6.**P<0.01vspHex6.8.

圖5 細(xì)胞外液去除氯離子對酸中毒、KCl和U46619引起RCA收縮的影響

討 論

本研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞外酸中毒引起的RCA收縮與激活NHE-1和NBC有關(guān)；細(xì)胞外酸中毒引起的RCA收縮與氯離子跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)有關(guān)；細(xì)胞外氯離子在細(xì)胞外酸中毒引起的RCA收縮中起重要作用。

細(xì)胞外液酸化在大多數(shù)細(xì)胞同時引起一定程度的細(xì)胞內(nèi)液酸化[10]，激活細(xì)胞膜上的酸堿轉(zhuǎn)運(yùn)體來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的酸堿狀態(tài)。NHE-1和NBCn1是生理狀態(tài)下僅有的2個控制細(xì)胞酸堿度的轉(zhuǎn)運(yùn)體[4-5]，不僅參與細(xì)胞內(nèi)pH值調(diào)節(jié)，而且影響動脈張力的調(diào)節(jié)。NBCn1和NHE1基因敲除的小鼠可出現(xiàn)心血管系統(tǒng)的紊亂，如血壓降低[5, 11]。本次研究用不同的酸化方法再次證實(shí)細(xì)胞外液酸化能夠引起RCA收縮，而且與激活NHE-1和NBC有關(guān)。

綜上所述，酸中毒能引起RCA收縮，其收縮機(jī)制可能與NHE-1、NBC和氯離子通道活性增強(qiáng)有關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Mechanisms underlying contraction of rat isolated coronary artery induced by acidosis

HE Ze-fang, HOU Xiao-min, YANG Rong, FAN Fang-wen, GUO Peng-mei, LIU Yu, ZHANG Ming-sheng

(DepartmentofPharmacology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail: 4156589@sina.com)

1000- 4718(2017)05- 0838- 05

2016- 12- 05

2017- 02- 16

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81603111); 山西省生物優(yōu)勢學(xué)科基金; 山西醫(yī)科大學(xué)博士啟動基金(No. 03201510)

R363

A

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