胰腺癌高表達(dá)抗原MUC4 CTL表位肽的篩選與改造*

范柳笛， 劉 輝， 袁 磊， 時(shí)冉冉

(漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校醫(yī)學(xué)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 漯河 462002)

胰腺癌高表達(dá)抗原MUC4 CTL表位肽的篩選與改造*

范柳笛， 劉 輝， 袁 磊， 時(shí)冉冉△

(漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校醫(yī)學(xué)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 漯河 462002)

目的： 觀察胰腺癌高表達(dá)抗原黏蛋白4(MUC4)的改造表位是否有HLA-A2限制性抗腫瘤能力。方法: 首先運(yùn)用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)MUC4在胰腺癌細(xì)胞系CAPAN-2和ASPC-1的表達(dá)情況。通過(guò)NetCTL 1.2、BIMAS、SYFPEITHI和IEDB軟件預(yù)測(cè)打分來(lái)選取MUC4的HLA-A2限制性表位；替換MUC4抗原錨定位點(diǎn)氨基酸獲得改造肽；候選表位肽的合成方法為標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc化學(xué)合成法，結(jié)合力實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)候選表位與T2A2細(xì)胞表面HLA-A2分子的結(jié)合能力，ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)候選表位肽誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)分泌IFN-γ的能力，體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)活性檢測(cè)候選肽誘導(dǎo)CTL的能力。結(jié)果: MUC4在胰腺癌細(xì)胞系CAPAN-2和ASPC-1均有表達(dá)。P1944-1Y、P1944-2L、P1944-1Y2L、P2004和P2004-1Y9V具有較好的結(jié)合力，且P2004-1Y9V、P1944-1Y2L 等改造肽與HLA-A2的結(jié)合力高于原肽。ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示表位肽 P1944、P1944-1Y2L、P2004和P2004-1Y9V誘導(dǎo)的CTL具有分泌IFN-γ的能力。P1944-1Y2L和P2004-1Y9V誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞免疫分泌的IFN-γ略高于原肽。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示表位P1944、P1944-1Y2L、P2004和P2004-1Y9V對(duì)CAPAN-2細(xì)胞均有一定的殺傷作用。P1944-1Y2L和P2004-1Y9V特異性CTLs對(duì)CAPAN-2細(xì)胞殺傷率高于原肽特異性CTLs。結(jié)論: MUC4抗原改造表位P1944-1Y2L、P2004-1Y9V與天然表位P1944、P2004相比有更高的HLA-A2分子親和力，保留了原有的免疫原性，并且改造肽抗腫瘤免疫效應(yīng)強(qiáng)于天然表位。P1944-1Y2L和P2004-1Y9V是優(yōu)秀的MUC4抗原的HLA-A2限制性CTL候選表位，可以成為新的抗腫瘤多肽免疫治療疫苗的候選表位。

黏蛋白4； 表位； 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞

胰腺癌是一種常見(jiàn)致命的疾病[1]。近些年，隨著生活水平的提高、暴飲暴食等不良的飲食習(xí)慣以及中國(guó)人口老齡化的加劇，胰腺癌的發(fā)病率也大幅增加[2]。胰腺癌尚無(wú)有效的手術(shù)治療方式。近些年，免疫治療已經(jīng)成為一個(gè)很有發(fā)展前景的治療方法[3]。已經(jīng)有相關(guān)研究結(jié)果用于臨床[4]。癌癥免疫療法的2個(gè)主要方式是過(guò)繼性T細(xì)胞療法和疫苗接種。這種模式依賴(lài)于抗原誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞能識(shí)別存在于腫瘤中的抗原[5]，但是不能識(shí)別在正常細(xì)胞不存在或者低水平存在的抗原，從而使特異性T細(xì)胞可破壞腫瘤細(xì)胞，同時(shí)保留正常組織[6]。有研究檢測(cè)黏蛋白4(mucin 4， MUC4)在正常胰腺組織中無(wú)表達(dá)，在胰腺癌組織中明顯過(guò)表達(dá)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)沉默MUC4基因的表達(dá)明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[7-8]。MUC4 在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用，并有望成為胰腺癌潛在特異性腫瘤分子標(biāo)志物。本次研究使用NetCTL 1.2、BIMAS、SYFPEITHI和IEDB等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行綜合預(yù)測(cè)，篩選出綜合打分較高的表位，并對(duì)優(yōu)勢(shì)表位進(jìn)行適當(dāng)替換，通過(guò)鑒定篩選出MUC4 HLA-A2限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T-lymphocyte， CTL)表位。為未來(lái)構(gòu)建多表位疫苗和重組蛋白融合疫苗打下基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

T2A2細(xì)胞、CAPAN-2細(xì)胞(HLA-A2+)和ASPC-1細(xì)胞(HLA-A2-)由漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存，采用37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)條件下常規(guī)培養(yǎng)。外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)由HLA-A2+健康供者捐贈(zèng)。HLA-A2+外周血健康供者來(lái)自課題組尋找的健康供者。

2 方法

2.1 MUC4 在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá) 采用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)MUC4在胰腺癌細(xì)胞CAPAN-2和ASPC-1的表達(dá)情況。MUC4的上游引物序列為 5’-GTCAATGCCCACGCCTAT-3’，下游引物序列為5’- ACGGGTTGGAATCGTAAGTC-3’，產(chǎn)物大小為266 bp(由上海生工生物工程有限公司合成)。

2.2 HLA-A2限制性CTL表位肽的預(yù)測(cè) 結(jié)合NetCTL 1.2、BIMAS、SYFPEITHI和IEDB軟件對(duì)MUC4氨基酸序列的預(yù)測(cè)打分，分別打開(kāi)這4種預(yù)測(cè)軟件的主頁(yè)，進(jìn)入 CTL 表位預(yù)測(cè)界面，本次研究以A2超型為主，參數(shù)設(shè)定：CTL表位限制性 MHC類(lèi)型為HLA-A*0201。預(yù)測(cè)抗原肽長(zhǎng)度為9 aa。根據(jù)各個(gè)預(yù)測(cè)軟件所推選的前30個(gè)優(yōu)勢(shì)表位進(jìn)行綜合選擇，選出在各種軟件中打分較好的HLA-A2限制性表位。

2.3 HLA-A2限制性CTL表位肽的合成 候選表位肽采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方法合成，經(jīng)HPLC分析純化后，其純度大于95%，質(zhì)譜分析其相對(duì)分子質(zhì)量符合理論值。

2.4 表位肽與HLA-A2分子結(jié)合力實(shí)驗(yàn) 收集T2A2細(xì)胞，用無(wú)血清1640培養(yǎng)基洗3次，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×109/L，鋪于24孔板中(每孔1 mL)，每實(shí)驗(yàn)孔加入待測(cè)肽50 mg/L，β2-微球蛋白2.5 mg/L，37 ℃、5% CO2共孵育18 h后，冷PBS洗滌3次，加入500 μL稀釋度為1∶100的單克隆抗體，4 ℃避光靜置40 min。之后冷PBS洗滌3次，加入50 μL稀釋度為1∶50的FITC-羊抗鼠抗體溶液，4 ℃靜置40 min，PBS洗滌1次后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。其結(jié)果用熒光系數(shù)表示：熒光系數(shù)(fluorescence index，F(xiàn)I)=(表位肽平均熒光強(qiáng)度-背景平均熒光強(qiáng)度)/背景平均熒光強(qiáng)度。FI>1.0表示高等結(jié)合力，1.0>FI>0.5表示中等結(jié)合力，F(xiàn)I<0.5表示低結(jié)合力[9]。

2.5 CTL的體外誘導(dǎo) 抽取HLA-A2+健康供者的外周血，肝素鈉抗凝，經(jīng)常規(guī)聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心，獲取PBMCs，用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×109/L。第2天分別加入10 mg/L的候選肽共培養(yǎng)，第3天加入5×104U/L的rIL-2繼續(xù)培養(yǎng)。每周收集細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，除去上清，加入新鮮的10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，同時(shí)加入上述條件的候選肽和rIL-2。刺激3輪后于最后 1 次刺激的第 3天收集細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度作為效應(yīng)細(xì)胞。用無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度作為靶細(xì)胞[10]。

2.6 IFN-γ分泌水平的檢測(cè) 取出ELISPOT板條，加200 μL無(wú)血清的IMDM培養(yǎng)基進(jìn)行封閉，靜置10 min；誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞，荷肽的T2A2作為刺激細(xì)胞，細(xì)胞濃度均調(diào)整為2×109/L；設(shè)立對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)孔；37 ℃、5% CO2孵育18 h；去除孔中培養(yǎng)基，每孔加入200 μL無(wú)菌的去離子水，4 ℃ 裂解細(xì)胞10 min；去除孔內(nèi)液體，加入200 μL 1×washing buffer 洗滌6次，每次停留60 s；加入 100 μL生物素標(biāo)記的抗體，37 ℃ 孵育1 h；去除孔內(nèi)液體，加入200 μL 1×washing buffer進(jìn)行洗滌，方法同上，在吸水紙上拍干；加入100 μL酶聯(lián)親和素，37 ℃ 孵育1 h；每孔加入200 μL 1×washing buffer進(jìn)行洗滌，方法同上；加入100 μL現(xiàn)配的AEC顯色液，25 ℃避光靜置30 min；結(jié)束后置于通風(fēng)處，室溫靜置干燥；結(jié)果用 ELISPOT 圖像分析儀計(jì)數(shù) 96 孔板中每孔的斑點(diǎn)數(shù)[11]。

以純度99.99%，平均粒度37 μm的Si粉為原料，在硅化(將純硅粉置于石墨坩堝中高溫?zé)Y(jié)，使硅粉與坩堝充分反應(yīng))后的石墨坩堝內(nèi)將尺寸規(guī)格為75 mm×75 mm×10 mm的C/C塊體包埋于Si粉中，采用反應(yīng)熔滲法在不同熔滲溫度條件下制備C/C-SiC復(fù)合材料，具體工藝見(jiàn)表1。

2.7 細(xì)胞毒活性檢測(cè) 調(diào)整CTL濃度為5×109/L；調(diào)整靶細(xì)胞CAPAN-2細(xì)胞濃度為1×108/L；按50∶1、25∶1和12.5∶1的不同效靶比鋪于96孔板中，同時(shí)設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞最大釋放組、體積校正組和背景對(duì)照組，每孔終體積為100 μL。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)4 h。于孵育結(jié)束前45 min，在靶細(xì)胞最大釋放組及體積校正組中加入10 μL裂解液。1 000 r/min離心4 min，轉(zhuǎn)移50 μL上清至另一干凈96孔板中，每孔加入50 μL底物混合液，室溫避光孵育30 min；每孔再加入50 μL終止液。用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。殺傷率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放值-CTL自發(fā)釋放值)/(靶細(xì)胞值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放值)×100%[12]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。均數(shù)比較組間采用單因素方差分析比較，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MUC4在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

分別使用RT-PCR以及Western blot 法檢測(cè)MUC4在胰腺癌細(xì)胞系中的mRNA 和蛋白表達(dá)。從圖中可以看出，MUC4在CAPAN-2和ASPC-1胰腺癌細(xì)胞系中均有表達(dá)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The expression of MUC4 in pancreatic tumor cell lines. A: the mRNA expression was detected by RT-PCR. PCR products were tested by electrophoresis on 1.5% agarose gel with ethidium bromide staining. GAPDH was used as positive control. B: the protein expression was analyzed by Western blot. Each lane contains 30 μg protein extract from the cancer cells. β-actin was used as positive control.

圖1 胰腺癌細(xì)胞系中MUC4的表達(dá)

2 MUC4 HLA-A2限制性CTL表位的預(yù)測(cè)結(jié)果

表1 MUC4 HLA-A2限制性CTL表位預(yù)測(cè)結(jié)果

3 表位肽/HLA-A2分子結(jié)合力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果表明P1944-1Y、P1944-2L、P1944-1Y2L、P2004和P2004-1Y9V具有較好結(jié)合力(FI>0.5)。結(jié)合力實(shí)驗(yàn)表明，改造后的表位肽與MHC分子結(jié)合的能力得到提高，見(jiàn)表2。

表2 候選肽與HLA-A*0201分子結(jié)合力結(jié)果

Table 2.The data of the peptide binding affinity derived from MUC4

Peptides ESI-MS[M+H]+CalculatedObservedFI*P583952.1953.20.32P583-1Y1002.11003.20.32P1944907.0908.20.46P1944-1Y983.1985.10.59P1944-2L888.9889.30.66P1944-1Y2L965.1967.21.84P20041003.11002.80.62P2004-1Y1019.21020.10.37P2004-1Y9V1047.21048.61.28P2138918.1917.20.38P2138-1Y968.1969.80.47HBcAg18-271155.31155.61.2

*FI = [mean fluorescence intensity (MFI) of the peptide-MFI background]/MFI background.

4 IFN-γ分泌水平結(jié)果

根據(jù)結(jié)合力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇了較好結(jié)合力的多肽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，P1944、P1944-1Y2L、P2004和P2004-1Y9V候選肽特異性CTL分泌IFN-γ的能力見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示P1944、P1944-1Y2L、P2004和P2004-1Y9V多肽疫苗能檢測(cè)到特異性T細(xì)胞免疫，能分泌較多的IFN-γ。P1944-1Y2L和P2004-1Y9V誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞分泌的IFN-γ略高于原肽。

Figure 2.ELISPOT assay was conducted to measure IFN-γ release by CTLs induced from the PBMCs of healthy donors. CTLs induced by PBS and irrelevant peptide HBcAg18-27was taken as negative control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsPBS group.

圖2 ELISPOT法檢測(cè)MUC4候選表位肽特異性CTL分泌IFN-γ的能力

5 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)IFN-γ分泌水平結(jié)果，我們將有效果的P1944、P1944-1Y2L、P2004和P2004-1Y9V進(jìn)一步進(jìn)行免疫活性檢測(cè)；P1944、P1944-1Y2L、P2004和P2004-1Y9V 四條候選肽誘導(dǎo)得到的CTL在不同效靶比(12.5∶1、25∶1和50∶1)時(shí)對(duì)MUC4表達(dá)陽(yáng)性的胰腺癌細(xì)胞CAPAN-2(HLA-A2+)的殺傷情況見(jiàn)圖3。P1944和P1944-1Y2L兩條候選肽誘導(dǎo)得到的CTL在效靶比為50∶1時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率分別是(28.5±3.32)%和(38.3±2.88)%，P2004和P2004-1Y9V兩條候選肽誘導(dǎo)得到的CTL在效靶比為50∶1時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率分別是(22.5±3.12)%和(40.3±2.88)%，而陰性對(duì)照PBS和無(wú)關(guān)肽HBcAg18-27在效靶比為50∶1時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率分別為(2.28±1.32)%和(2.24±2.36)%。

Figure 3.Specific lysis of CAPAN-2 cells by the CTLs generated from the PBMCs of healthy donors. CTLs were induced by MUC4-derived peptides and their analogues. The effector/target (E/T) ratios were 12.5∶1, 25∶1 and 50∶1. The levels of LDH release were detected. CTLs induced by PBS and irrelevant peptide HBcAg18-27were used as negative control. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsPBS group.

圖3 P1944和P2004候選肽及其類(lèi)似物誘導(dǎo)得到的CTL在不同效靶比時(shí)對(duì)靶細(xì)胞CAPAN-2的殺傷情況

討 論

近些年來(lái)，癌癥死亡率逐漸下降。但是每年仍然有很多人死于癌癥。如果要根除這一禍害，必須努力防止癌癥的發(fā)生。腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化是一系列的步驟，機(jī)體免疫系統(tǒng)能夠攔截即將轉(zhuǎn)化為惡性的細(xì)胞并預(yù)防癌癥。在我們體內(nèi)固有的抗癌防御基礎(chǔ)之上建立新免疫功能的療法已在短期內(nèi)取得很大成果。此外，繼續(xù)開(kāi)發(fā)新的防瘤疫苗至關(guān)重要。比如，人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus， HPV)疫苗幾乎為與細(xì)菌相關(guān)的幾種惡性腫瘤提供了100%的防護(hù)作用，包括增加患癌風(fēng)險(xiǎn)的遺傳性疾病林奇綜合征、年齡相關(guān)血液腫瘤克隆性造血、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變，以及可惡化為宮頸癌的HPV引起的宮頸組織異常增生。雖然癌癥預(yù)防研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但是進(jìn)展仍局限于個(gè)別癌癥案例。如果我們的目標(biāo)是根除所有癌癥，那么科學(xué)家還需要在癌前疾病和癌癥預(yù)防中聚焦于不同的方向與途徑[3]。

腫瘤疫苗對(duì)抗癌癥是一種很有前景的方法，因?yàn)樗婕暗揭粋€(gè)人自己的免疫系統(tǒng)與癌癥作斗爭(zhēng)[13-15]。肽疫苗是癌癥治療的令人鼓舞的方法之一[16-17]。2013年腫瘤抗原數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)描述了幾種腫瘤抗原的類(lèi)型以及受限制性腫瘤抗原肽[18]。這些腫瘤抗原是癌癥疫苗的關(guān)鍵，因?yàn)樗鼈冊(cè)谡＝M織中較少表達(dá)或者不表達(dá)，并且具有誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力[19]。內(nèi)源性抗原被宿主的 APC 類(lèi)細(xì)胞加工及提呈后，以抗原肽-MHC-I 類(lèi)分子復(fù)合物的形式表達(dá)于細(xì)胞表面， 供特異性 CD8+T 細(xì)胞識(shí)別[20-21]。然而， 一些天然 CTL 表位與 MHC-I 的親和力較弱， 也容易引起機(jī)體的免疫耐受，并且在體內(nèi)易受蛋白酶的攻擊水解。針對(duì)這些不足， 國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者采用了不同的方法對(duì)天然 CTL 表位進(jìn)行改造[22]。MHC-I 類(lèi)分子限制性表位一般為 9個(gè)氨基酸，并且有數(shù)位錨點(diǎn)殘基， 一般其第 1 位、第 2 位(P2)和第 9 位 (P9) 殘基是和 MHC-I 分子結(jié)合的錨點(diǎn)殘基。1993年，Ruppert等[23]發(fā)現(xiàn)，HLA-A2.1結(jié)合基序可以被定位在位置2(P2)亮氨酸(L)或甲硫氨酸(M)和位置9(P9)的亮氨酸(L)、纈氨酸(V)或異亮氨酸(I)。Tourdot等[24]表明，酪氨酸P1的替代可以提高HLA-A2限制性表位的免疫原性。

研究T細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)的生物信息學(xué)方法很多，在本次研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了P1(Y)、P2(L)和P9(V)代替原肽P1944和P2004。野生型肽及其類(lèi)似物的免疫原性已在體外實(shí)驗(yàn)中展示，結(jié)果顯示野生型肽以及類(lèi)似物均能有效誘導(dǎo)MUC4+HLA-A2+限制性CTL，能夠識(shí)別和裂解自然遞呈野生型MUC4表位的靶細(xì)胞。有效的抗瘤疫苗必須能夠打破免疫耐受，維持CTL所需的特異性和親和力。表位的改造可以增強(qiáng)HLA的結(jié)合能力和TCR的識(shí)別能力，可以更加有效地打破免疫耐受；氨基酸替換在多肽表位中可以有效誘導(dǎo)肽特異性CTL。

[1] Siegel R, Ma J, Zou Z, et al. Cancer statistics, 2014[J]. CA Cancer J Clin, 2014, 64(1):9-29.

[2] Zheng R, Zeng H, Zhang S, et al. National estimates of cancer prevalence in China, 2011[J]. Cancer Lett, 2016, 370(1):33-38.

[3] Jimenez-Luna C, Prados J, Ortiz R, et al. Current status of immunotherapy treatments for pancreatic cancer[J]. J Clin Gastroenterol, 2016, 50(10):836-848.

[4] Sliwkowski MX, Mellman I. Antibody therapeutics in cancer[J]. Science, 2013, 341(6151):1192-1198.

[5] Kessler JH, Melief CJ. Identification of T-cell epitopes for cancer immunotherapy[J]. Leukemia, 2007, 21(9):1859-1874.

[6] Coulie PG, Van den Eynde BJ, van der Bruggen P, et al. Tumour antigens recognized by T lymphocytes: at the core of cancer immunotherapy[J]. Nat Rev Cancer, 2014, 14(2):135-146.

[7] Andrianifahanana M, Moniaux N, Schmied BM, et al. Mucin (MUC) gene expression in human pancreatic adenocarcinoma and chronic pancreatitis: a potential role ofMUC4 as a tumor marker of diagnostic significance[J]. Clin Cancer Res, 2001, 7(12):4033-4040.

[8] Mimeault M, Johansson SL, Senapati S, et al. MUC4 down-regulation reverses chemoresistance of pancreatic cancer stem/progenitor cells and their progenies[J]. Cancer Lett, 2010, 295(1):69-84.

[9] Zhu YH, Gao YF, Chen F, et al. Identification of novel T cell epitopes from efflux pumps of Mycobacterium tuberculosis[J]. Immunol Lett, 2011, 140(1-2): 68-73.

[10]Wu ZY, Gao YF, Wu YH, et al. Identification of a novel CD8+T cell epitope derived from cancer-testis antigen MAGE-4 in oesophageal carcinoma[J]. Scand J Immunol, 2011, 74(6):561-567.

[11]Liu W, Zhai M, Wu Z, et al. Identification of a novel HLA-A2-restricted cytotoxic T lymphocyte epitope from cancer-testis antigen PLAC1 in breast cancer[J]. Amino Acids, 2012, 42(6):2257-2265.

[12]Zhu B, Chen Z, Cheng X, et al. Identification of HLA-A*0201-restricted cytotoxic T lymphocyte epitope from TRAG-3 antigen[J]. Clin Cancer Res, 2003, 9(5):1850-1857.

[13]Emens LA. Cancer vaccines: on the threshold of success[J]. Expert Opin Emerg Drugs, 2008, 13(2):295-308.

[14]Guo C, Manjili MH, Subjeck JR, et al. Therapeutic cancer vaccines: past, present, and future[J]. Adv Cancer Res, 2013, 119: 421-475.

[15]Bredenbeck A, Losch FO, Sharav T, et al. Identification of noncanonical melanoma-associated T cell epitopes for cancer immunotherapy[J]. J Immunol, 2005, 174(11):6716-6724.

[16]Goonetilleke N, Moore S, Dally L, et al. Induction of multifunctional human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-specific T cells capable of proliferation in healthy subjects by using a prime-boost regimen of DNA- and modified vaccinia virus Ankara-vectored vaccines expressing HIV-1 Gag coupled to CD8+T-cell epitopes[J]. J Virol, 2006, 80(10):4717-4728.

[17]Salmon-Ceron D, Durier C, Desaint C, et al. Immunogenicity and safety of an HIV-1 lipopeptide vaccine in healthy adults: a phase 2 placebo-controlled ANRS trial[J]. AIDS, 2010, 24(14):2211-2223.

[18]Vigneron N, Stroobant V, Van den Eynde BJ, et al. Database of T cell-defined human tumor antigens: the 2013 update[J]. Cancer Immun, 2013, 13:15.

[19]Mizukoshi E, Nakamoto Y, Arai K, et al. Comparative analysis of various tumor-associated antigen-specific T-cell responses in patients with hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2011, 53(4):1206-1216.

[20]Rosenberg SA, Restifo NP, Yang JC, et al. Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy[J]. Nat Rev Cancer, 2008, 8(4): 299-308.

[21]Blattman JN, Greenberg PD. Cancer immunotherapy: a treatment for the masses[J]. Science, 2004, 305(5681):200-205.

[22]張 恒， 朱 波， 王遠(yuǎn)強(qiáng)， 等. HLA-I限制性CTL表位改造的研究進(jìn)展[J]. 免疫學(xué)雜志, 2011, 27(1):73-76, 85.

[23]Ruppert J, Sidney J, Celis E, et al. Prominent role of secondary anchor residues in peptide binding to HLA-A2.1 molecules[J]. Cell, 1993, 74(5): 929-937.

[24]Tourdot S, Scardino A, Saloustrou E, et al. A general strategy to enhance immunogenicity of low-affinity HLA-A2. 1-associated peptides: implication in the identification of cryptic tumor epitopes[J]. Eur J Immunol, 2000, 30(12): 3411-3421.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Identification and molecular modification of HLA-A2-restricted cytotoxic T-lymphocyte epitopes from pancreatic tumor antigen MUC4

FAN Liu-di, LIU Hui, YUAN Lei, SHI Ran-ran

(KeyLaboratoryofMedicalBioengineering,LuoheMedicalCollege,Luohe462002,China.E-mail:ranranpeptide@163.com)

AIM: To observe whether modified epitopes from pancreatic tumor antigen mucin 4 (MUC4) have HLA-A2-restricted antitumor ability.METHODS: RT-PCR and Western blot were used to identify the expression of MUC4 in the pancreatic tumor cell lines CAPAN-2 and ASPC-1. HLA-A2 epitopes from MUC4 protein were predicted by the software of NetCTL 1.2, BIMAS, SYFPEITHI and IEDB. The modified peptides from MUC4 containing HLA-A2 were obtained by replacing anchor residues of the binding anchor motifs. The peptides were synthesized by standard solid-phase methods. The binding affinity of the peptides to HLA-A2 molecule was evaluated by T2 binding assay. ELISPOT assay was used to investigate the ability of the peptide to induce specific restricted cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) and release of IFN-γ. The ability of the peptides to induce T-cell response was investigated by cytotoxicity assayinvitro. RESULTS: The expression of MUC4 was observed in the CAPAN-2 cells and ASPC-1 cells. The candidate peptides P1944-1Y, P1944-2L, P1944-1Y2L, P2004 and P2004-1Y9V showed moderate affinity toward HLA-A2 molecule. T2 binding assay showed that P1944-1Y2L and P2004-1Y9V had significantly higher affinity for HLA-A2 than the native peptides. ELISPOT assay showed P1944, P1944-1Y2L， P2004 and P2004-1Y9V were able to induce specific CTLs and more amounts of IFN-γ were released. ELISPOT assay showed that significantly more amounts of IFN-γ released by P1944-1Y2L and P2004-1Y9V were observed than the native peptides. The CTLs induced by P1944, P1944-1Y2L， P2004 and P2004-1Y9V lyzed the CAPAN-2 cells. P1944-1Y2L and P2004-1Y9V peptide-specific CTLs showed higher cytotoxicity against pancreatic tumor cell line CAPAN-2 than the native peptide-specific CTLs. CONCLUSION: Compared with the native peptides, modified epitopes P1944-1Y2L and P2004-1Y9V have higher binding affinity with HLA-A2 and retain immunogenecity. In addition, the anti-tumor immunity of modified epitopes P1944-1Y2L and P2004-1Y9V is stronger than that of the native peptides. The peptides P1944-1Y2L and P2004-1Y9V are excellent HLA-A2-restricted CTL epitopes from tumor antigen MUC4, which could serve as new candidates towards antitumor peptide vaccines.

Mucin 4; Epitopes; Cytotoxic T-lymphocytes

1000- 4718(2017)05- 0811- 06

2016- 10- 13

2017- 01- 13

河南省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No. 142102310203)

Q279； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.008

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△通訊作者 Tel: 0395-2964509; E-mail: ranranpeptide@163.com