左歸丸水煎液對衰老MSCs的影響

丁富平，張 晨，張玉卓，覃星奎，詹 菲，李杰斌，許獻(xiàn)光，陳光佩，黃 進(jìn)，張 進(jìn)

（1廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006；2陜西省安康市中醫(yī)院，陜西安康725000；3廣州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東廣州510450；4廣東黃埔衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東廣州510720）

·基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

左歸丸水煎液對衰老MSCs的影響

丁富平1，張 晨2，張玉卓1，覃星奎1，詹 菲3，李杰斌4，許獻(xiàn)光1，陳光佩1，黃 進(jìn)1，張 進(jìn)1

（1廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006；2陜西省安康市中醫(yī)院，陜西安康725000；3廣州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東廣州510450；4廣東黃埔衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東廣州510720）

目的：探討左歸丸水煎液對D?半乳糖誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）衰老模型的影響.方法：分離、培養(yǎng)大鼠MSCs，D?半乳糖誘導(dǎo)MSCs建立衰老模型.MTT法檢測衰老MSCs活性；流式細(xì)胞術(shù)比較細(xì)胞增殖周期的變化；細(xì)胞衰老β?半乳糖苷酶染色和吉姆薩染色比較細(xì)胞衰老情況.結(jié)果：模型組MSCs增殖能力顯著低于正常組和左歸丸中劑量組，模型組停滯在G1期細(xì)胞數(shù)目顯著高于正常組和左歸丸中劑量組，進(jìn)入DNA快速復(fù)制期的細(xì)胞顯著低于正常組和左歸丸中劑量組，模型組細(xì)胞衰老β?半乳糖苷酶染色陽性率顯著高于正常組和左歸丸中劑量組.結(jié)論：左歸丸水煎液在一定程度上可促進(jìn)衰老MSCs增殖，減少衰老細(xì)胞，提示左歸丸水煎液對體外培養(yǎng)誘導(dǎo)的衰老MSCs有一定的抗衰老作用.

衰老；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；左歸丸；增殖

0 引言

衰老指機(jī)體各器官功能普遍的、逐漸降低的過程.衰老有兩種不同情況，一種是正常情況下出現(xiàn)的生理性衰老；另一種是疾病引起的病理性衰老.近年來學(xué)術(shù)界認(rèn)為，干細(xì)胞衰老是衰老的重要機(jī)制，許多研究從干細(xì)胞及其微環(huán)境角度來進(jìn)行抗衰老［1－2］.

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎精虧虛是衰老的主要原因，而衰老最根本的治療原則是補(bǔ)腎益精.本團(tuán)隊前期提出假說認(rèn)為“干細(xì)胞具先天之精屬性，是先天之精在細(xì)胞層次的存在形式”［3－7］.據(jù)此，補(bǔ)腎益精方法有可能促進(jìn)大鼠體外衰老MSCs的增殖能力，從而改善衰老狀態(tài).基于干細(xì)胞與先天之精的關(guān)系，前期研究從中醫(yī)補(bǔ)腎益精的經(jīng)典方左歸丸入手，結(jié)果表明，左歸丸可促進(jìn)衰老大鼠MSCs的增殖［6］，并且能夠促進(jìn)衰老大鼠MSCs的遷移［8］.本研究擬繼續(xù)探索左歸丸水煎劑對MSCs衰老模型的直接作用，以細(xì)胞增殖能力顯示其抗衰老作用.本研究采用左歸丸的水煎液，過濾除菌后直接作用于細(xì)胞，觀察其對體外培養(yǎng)的MSCs增殖的影響，探索左歸丸水煎劑直接作用MSCs抗衰老的影響.把中醫(yī)藥延緩衰老與干細(xì)胞研究相結(jié)合，從干細(xì)胞角度研究補(bǔ)腎益精法抗衰老的作用機(jī)理.為深入揭示中醫(yī)藥延緩衰老的機(jī)制研究提供創(chuàng)新性思路，為左歸丸應(yīng)用于臨床抗衰老的保健與治療提供有力的實驗依據(jù).

1 材料和方法

1.1 動物成年SPF級SD大鼠，雌雄各30只，體質(zhì)量約300 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（粵）2013－0020.

1.2 藥物按照《景岳全書》左歸丸原方：熟地黃、山藥、枸杞子、山茱萸、鹿角膠、龜板膠、菟絲子、川牛膝依次按8∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶3比例稱量，每份100 g藥材.左歸丸水提液制備：以上中藥加入10倍量的水煎煮2次，90 min／次.將水煎液過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，最終濃縮為生藥濃度為1 g／mL的左歸丸水煎液，調(diào)整pH7.2，過0.22 μm濾膜除菌，4℃保存?zhèn)溆?用完全培養(yǎng)液［含10%FBS的DMEM（L）培養(yǎng)液］稀釋到所需濃度.

1.3 試劑和儀器DMEM（L）培養(yǎng)基（Hyclone，NYH0954）；澳洲特級胎牛血清（Gibco，1478702）；雙抗（Gibco，15140122）；胰蛋白酶（Solarbio，20131128），MTT（美國Biomedicals，M6163）；DMSO（美國Biomedicals，61591C）；吉姆薩染色液（廣州威佳生物公司，20130608）；細(xì)胞衰老β?半乳糖染色試劑盒（碧云天生物工程研究所，CO602?1）；細(xì)胞周期檢測試劑盒（碧云天生物工程研究所，C1052）.酶標(biāo)儀（Bio?Rad，美國）；二氧化碳孵育箱（Thermo?Fisher，美國）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；倒置相差顯微鏡（重慶奧特斯）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）.

1.4 方法

1.4.1 實驗分組和細(xì)胞衰老模型 實驗分為正常組、衰老模型組和左歸丸水煎液的不同劑量組（低、中、高）.細(xì)胞培養(yǎng)到P3代，正常組采用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，其他各組以含D?半乳糖（濃度為10 g／L）的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)建立細(xì)胞的體外衰老模型［5］.造模成功后，正常組和模型組保持同樣的方法培養(yǎng)，左歸丸水煎液組（低、中、高）依次采用含0.5、1、2 g／L濃度的左歸丸水提取液完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)［9］.

1.4.2 MSCs的培養(yǎng) 將SD大鼠采用頸椎脫臼法處死，無菌條件下取雙下肢，去除骨外的各組織，咬斷兩端的骨骺，用含10%FBS的完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔.以4號針頭注射液反復(fù)抽吸成單細(xì)胞懸液，然后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng).2 d后進(jìn)行首次全換液，以后每3天半換液1次.待細(xì)胞鋪底達(dá)80%～90%，常規(guī)按1∶3比例傳代培養(yǎng).采用倒置顯微鏡密切觀察MSCs生長情況及形態(tài)變化.

1.4.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力 取生長狀態(tài)良好的P5代MSCs，消化后重懸，制備單細(xì)胞懸液，以1×104個／mL密度接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔以完全培養(yǎng)基加滿至200 μL.左歸丸低、中、高劑量組依次加入配好的不同濃度含左歸丸水煎液培養(yǎng)基，空白組加含10%FBS完全培養(yǎng)基.各組同時培養(yǎng)1、2、3、4、5天，以后每隔一天取出一個96孔板，每孔加入MTT溶液20 μL（5 mg／mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去液體，每孔重新加入DMSO 150 μL，振蕩溶解10 min，以490 nm波長測定各孔吸光度值，繪制細(xì)胞增殖曲線，每組實驗設(shè)8個復(fù)孔.

1.4.4 細(xì)胞Giemsa染色 取各組P5代細(xì)胞，將1×104／mL單細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔2 mL，待細(xì)胞融合約80%～90%，取出各組6孔板，棄培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定10 min，棄固定液，PBS洗3次，棄PBS，每孔滴加Giemsa染色工作液1 mL進(jìn)行染色5 min，水洗30 s，待干后高倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài).

1.4.5 細(xì)胞衰老β?半乳糖苷酶染色 取各組P5代細(xì)胞，將1×104／mL單細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔2 mL，待細(xì)胞融合約80%～90%，取出各組6孔板，棄培養(yǎng)基，PBS清洗3次，加入l mL β?半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min，棄固定液，PBS洗3次，每次3 min，棄PBS，每孔加入β?半乳糖苷酶染色工作液（β?半乳糖苷酶染色A液10 μL，β半乳糖苷酶染色B液10 μL，β半乳糖苷酶染色C液930 μL，X?Gal溶液50 μL），封口膜封邊，37℃孵育過夜.普通光學(xué)顯微鏡下觀察.

1.4.6 各組MSCs細(xì)胞周期分析 收集各組P5代MSCs約2×106個，PBS洗2次，離心，棄上清液，緩慢向細(xì)胞沉淀中滴加1 mL、－20℃預(yù)冷的70%冰乙醇，4℃固定過夜，離心，去上清液，PBS洗滌2次，0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，加入1 mg／mL RNaseA 200 μL，37℃水浴30 min，離心去上清，加入5 mg／L的碘化丙啶1 mL，4℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測.

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖生長曲線連續(xù)6 d測每組細(xì)胞吸光度OD值，并繪制生長曲線（圖1）.細(xì)胞衰老模型組，平均OD值顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）.第1天各組吸光度無顯著差異；第2天，左歸丸高劑量組OD值顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；第3天，中劑量組吸光度OD值均顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；第4、5、6天，中劑量組吸光度OD值顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖1）.

圖1 細(xì)胞生長曲線

2.2 Giemsa染色觀察細(xì)胞形態(tài)給予成年大鼠腹腔注射10%D?半乳糖60 d，建立亞急性衰老大鼠模型.倒置熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài).正常組細(xì)胞生長良好，細(xì)胞呈梭形漩渦狀生長，胞核呈規(guī)則圓形；與正常組比較，模型組細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞較大，胞核不規(guī)則，胞質(zhì)可見顆粒狀物質(zhì)，并見不同程度的細(xì)胞膜破裂；與模型組比較，左歸丸中劑量組細(xì)胞生長較好，胞核大部分呈規(guī)則分布，胞核可見少量顆粒狀物質(zhì)，未見明顯細(xì)胞膜破裂（圖2）.

圖2 細(xì)胞吉姆薩染色

2.3 細(xì)胞衰老β?半乳糖苷酶染色衰老模型組細(xì)胞染色陽性率明顯高于正常組和左歸丸低、中、高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1、圖3）.

表1 細(xì)胞衰老β?半乳糖苷酶染色陽性率（%）

表1 細(xì)胞衰老β?半乳糖苷酶染色陽性率（%）

aP＜0.05 vs正常組；cP＜0.05 vs模型組.

圖3 細(xì)胞衰老β?半乳糖苷酶染色

2.4 各組細(xì)胞周期分析衰老模型組細(xì)胞在G1期占百分率顯著高于正常組和左歸丸中劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；衰老模型組細(xì)胞在S和G2期占百分率顯著低于正常組和左歸丸中劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4）.

圖4 各組細(xì)胞增殖周期

3 討論

干細(xì)胞（stem cell，SC），是一種在人體生長、發(fā)育和生殖過程中起始動作用的原始細(xì)胞，它具備高度的自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞群體［10］.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種來源于中胚層的多能干細(xì)胞，具備極強(qiáng)的自我更新和多向分化潛能，普遍存在于全身各組織器官中，以骨髓中數(shù)量較為豐富.但是，MSCs在骨髓中的數(shù)量也很有限，大約每10－4～10－5個單核細(xì)胞中只含有1個MSCs.MSCs雖然數(shù)量極少，但是其易于分離、培養(yǎng)，且增殖能力極強(qiáng).現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，干細(xì)胞的生存狀態(tài)決定著機(jī)體的生長、發(fā)育和生殖狀態(tài).干細(xì)胞調(diào)控機(jī)體的生、長、壯、已，決定了機(jī)體的生長狀態(tài).回顧性研究［11］表明，干細(xì)胞數(shù)量減少、周圍微環(huán)境的變化以及定向分化能力的改變都可能導(dǎo)致機(jī)體功能狀態(tài)逐漸衰減，誘發(fā)機(jī)體衰老.通過藥物誘導(dǎo)干預(yù)，調(diào)節(jié)干細(xì)胞生存的微環(huán)境，有可能減緩或逆轉(zhuǎn)衰老的進(jìn)程.干細(xì)胞移植、靜脈輸注，可以增加干細(xì)胞的數(shù)量；尚有研究表明［12］，尾靜脈注射干細(xì)胞能夠增強(qiáng)衰老大鼠抗氧化能力和免疫活性，從而逆轉(zhuǎn)衰老.崔淵博等［13］發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植能夠改善衰老模型大鼠腎、肺組織中衰老蛋白的表達(dá)，這些研究提示，干細(xì)胞可能是防止衰老的重要屏障，是決定人體衰老與否的重要因素.

研究發(fā)現(xiàn)［14－16］補(bǔ)腎類方能夠促進(jìn)MSCs增殖和遷移，動員自身MSCs，提高外周血MSCs數(shù)量.綜上研究說明，補(bǔ)腎益精法能夠促進(jìn)MSCs增殖，抑制MSCs的衰老進(jìn)程，延緩衰老的發(fā)展.本研究選擇左歸丸水煎液進(jìn)行體外干預(yù)MSCs，觀察對衰老MSCs的增殖效應(yīng)，并初步探討抗衰老的機(jī)制.譚峰等［8］用左歸丸和右歸丸的水提取液分別對rMSCs進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)左歸丸的促增殖作用最強(qiáng).補(bǔ)腎益精作用較弱的六味地黃丸、腎氣丸也有促進(jìn)MSCs增殖的趨勢.左歸丸作用強(qiáng)于右歸丸，說明對衰老的干細(xì)胞，補(bǔ)腎精作用強(qiáng)于補(bǔ)腎陽的作用，這就反證了MSCs是先天之精的一種表現(xiàn)形式，為“干細(xì)胞具先天之精的屬性”理論假說提供了證據(jù).

MSCs雖然具備強(qiáng)大的增殖潛能，但是通常情況下處于靜息狀態(tài)，只有受信號因子刺激，細(xì)胞才能被活化，進(jìn)入細(xì)胞周期，參與細(xì)胞周期，影響細(xì)胞的增殖、分化、遷移和歸巢等.本實驗表明，左歸丸促進(jìn)衰老MSCs增殖，延緩衰老.通過MTT法觀察細(xì)胞增殖效應(yīng)，細(xì)胞培養(yǎng)第2天開始，衰老組的吸光度增加幅度不及正常組，增殖呈現(xiàn)抑制狀態(tài).左歸丸干預(yù)后，MSCs的活性明顯增加，尤其是中劑量組的吸光度較其它給藥組大，細(xì)胞數(shù)量顯著增多.隨后的連續(xù)4天，左歸丸對衰老細(xì)胞呈現(xiàn)促增殖狀態(tài).而且低和高劑量組明顯不及中劑量，考慮低劑量的濃度太小，只表現(xiàn)增殖的趨勢，高劑量濃度過高，可能產(chǎn)生了細(xì)胞毒性，因此促增殖作用不明顯.

D?半乳糖誘導(dǎo)衰老模型在體內(nèi)［17］或者體外［18］均是比較公認(rèn)的造模方式，正常組大鼠MSCs多呈梭形，胞漿豐富，染成紫藍(lán)色，細(xì)胞核染成深藍(lán)色，有一兩個核仁，核仁明顯.造模成功后，模型組MSCs見多邊形、方形，胞漿內(nèi)部顆粒物質(zhì)增多，細(xì)胞核染成深藍(lán)色，有一兩個核仁，核仁明顯.經(jīng)左歸丸干預(yù)治療后MSCs呈梭形，胞漿豐富，染成紫藍(lán)色，細(xì)胞核染成深藍(lán)色，有一兩個核仁，核仁明顯.且左歸丸水煎劑中劑量組細(xì)胞接近正常組細(xì)胞形態(tài)，效果最好.這表明左歸丸水煎劑在一定劑量及時間內(nèi)有抗衰老的作用.

有研究表明衰老細(xì)胞通常體積變大，表達(dá)pH 6.0時有高酶活性的β?半乳糖苷酶［19］.細(xì)胞衰老β?半乳糖苷酶染色試劑盒僅染色衰老細(xì)胞，因此，本研究選β?半乳糖苷酶染色試劑盒比較各組大鼠MSC細(xì)胞衰老的情況.結(jié)果顯示：模型組衰老細(xì)胞陽性率最高，明顯高于正常組和左歸丸中劑量組.這表明衰老細(xì)胞模型成立，經(jīng)左歸丸水煎液干預(yù)治療后，衰老細(xì)胞數(shù)量明顯減少，左歸丸水煎液在一定濃度有抗衰老的作用.

細(xì)胞周期結(jié)果反映細(xì)胞增殖周期中DNA的復(fù)制和蛋白的表達(dá)狀態(tài).已有研究表明［20］，衰老大鼠中處于G1期的BMSCs比例增高、S期細(xì)胞比例降低.本實驗采用D?半乳糖直接干預(yù)MSCs，衰老細(xì)胞增殖周期停滯于G1期，DNA復(fù)制和蛋白表達(dá)受到明顯的限制.左歸丸刺激細(xì)胞后，細(xì)胞周期被激活，快速進(jìn)入DNA復(fù)制和蛋白的表達(dá)，完成細(xì)胞有絲分裂過程，表現(xiàn)出促增殖效應(yīng).MSCs衰老在形態(tài)學(xué)觀察顯示，衰老細(xì)胞形態(tài)不同于正常組，細(xì)胞呈扁平、核大、顆粒物質(zhì)增多、容易被半乳糖苷酶染色.通過抗衰老干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)接近正常.綜上所述，補(bǔ)益腎精經(jīng)典方左歸丸能夠緩解MSCs的衰老狀態(tài)，這表現(xiàn)在細(xì)胞數(shù)量的增加、細(xì)胞形態(tài)趨于正常改變、細(xì)胞快速進(jìn)入DNA對數(shù)復(fù)制期以及蛋白高表達(dá).

本次探索性實驗研究表明，體外誘導(dǎo)的衰老MSCs增殖能力減弱，左歸丸水煎劑能夠促進(jìn)衰老MSCs的增殖能力，結(jié)果顯示左歸丸水煎劑中劑量組具有較好的干預(yù)效果.研究結(jié)果在一定程度上佐證了“干細(xì)胞與先天之精相關(guān)的理論假說以及進(jìn)一步提出腎精虧虛即為干細(xì)胞衰老是人類衰老的根本所在”理論假說的科學(xué)性.

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Effects of Zuogui Pill water decoction on ag?ing bone marrow mesenchymal stem cells

DING Fu?Ping1，ZHANG Chen2，ZHANG Yu?Zhuo1，TAN Xing?Kui1，ZHAN Fei3，LI Jin?Bin4，XU Xian?Guang1，CHEN Guang?Pei1，HUANG Jin1，ZHANG Jin1

1Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；2Hospital Of Traditional Chinese Medicine of Ankang，Ankang 725000，China；3Health Science College of Guangzhou，Guangzhou 510405，China；4Health Science College of Huangpu，Guangzhou 510720，China

AIM：To investigate the effect of Zuogui Pill water decoction on bone marrow mesenchymal stem cell（MSCs）aging model induced by D?galactose.METHODS：MSCs was isolated and cultured，and ageing cell model was builded by D?galactose induced MSCs.Activity of MSCs was observed by MTT，and change of cell proliferate cycle was compare by flow cytometry.Condition of cell aging was compared by β－galactosidase staining and giemsa staining of senescent cells.RESULTS：The prolifera?tion capacity of MSCs in model group was significantly lower than those of Zuogui Pill groups and normal group；Cell number of MSCs stagnated in the G1 phase in model group was significantly higher than those of Zuogui Pill groups and normal group；Cell number of MSCs entering the period of DNA rapid replication was lower than those of Zuogui Pill groups and normal group；Positive rate of β?galactosidase staining aging cells in model group was higher than Zuogui Pill groups and normal group.CONCLU?SION：Zuogui Pill water decoction can improve the proliferation ability of ageing rat MSCs and reduce the number of aging MSCs in some degree，which shows Zuogui Pill water has the effect of anti?aging.

aging；MSCs；Zuogui Pill；proliferation

R285.5

A

2095?6894（2017）04?11?04

2016－12－05；接受日期：2016－12－22

國家自然科學(xué)基金項目（81202732）；廣州中醫(yī)藥大學(xué)科研創(chuàng)新團(tuán)隊項目（2016KYTD10）

丁富平.碩士，副教授.研究方向：女性衰老的生理、心理及

中醫(yī)藥防治.Tel：020?39358373 E?mail：hldfp＠gzucm.edu.cn

張 晨.碩士.研究方向：干細(xì)胞與中醫(yī)再生醫(yī)學(xué).E?mail：904686561＠qq.com（共同第一作者）

張 進(jìn).博士，副教授.研究方向：干細(xì)胞與中醫(yī)再生醫(yī)學(xué).

Tel：020?39358001 E?mail：zhjin＠gzucm.edu.cn