超聲波乙醇浸提法提取橄欖葉總多酚工藝的研究

孔祥佳，劉廉榮

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

超聲波乙醇浸提法提取橄欖葉總多酚工藝的研究

孔祥佳，劉廉榮

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

目的研究橄欖葉中總多酚超聲波乙醇浸提法的最佳工藝條件。方法固定超聲波功率為500 W，選取提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度、固液比作為影響因素，以橄欖葉總多酚得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，得到超聲波乙醇浸提的優(yōu)化組合條件。結(jié)果橄欖葉總多酚的最優(yōu)提取工藝條件為提取時(shí)間50 min，提取溫度35℃，乙醇濃度60%，固液比為1∶20（g／mL），各因素影響橄欖葉總多酚得率的主次關(guān)系為乙醇濃度＞固液比＞提取時(shí)間＞提取溫度。結(jié)論橄欖葉總多酚得率高達(dá)（8.90±0.14）%。

超聲波乙醇浸提；橄欖葉；總多酚；正交試驗(yàn)

橄欖（Canarium album（Lour.）Raeusch）為橄欖科橄欖屬常綠喬木，是中國(guó)南方亞熱帶特色藥食兼用型果品［1-3］，主要分布于福建?。?-5］。橄欖含有豐富的生物活性成分和較高的藥理作用［3］。其中，多酚類物質(zhì)是橄欖主要的生物活性成分之一，主要分布于橄欖果實(shí)內(nèi)，其次集中在橄欖葉中，具有抑菌和抗氧化的作用［2-3，6-7］。由于天然植物源提取物的提取具有價(jià)低、安全、無(wú)毒等作用，從天然植物源中提取抑菌活性成分和抗氧化活性成分愈來(lái)愈受到人們的關(guān)注。因此研究橄欖果實(shí)或橄欖葉總多酚的提取工藝對(duì)藥食同源橄欖的開發(fā)和應(yīng)用具有重要意義。前人研究表明：有關(guān)橄欖果實(shí)多酚類物質(zhì)提取方法主要涉及有機(jī)溶劑浸提法［8-9］、超聲波提取法［8，10］、微波輔助提取法［8，11］等；而有關(guān)橄欖葉酚類物質(zhì)提取方法主要采用有機(jī)溶劑浸提法［6-7］、微波輔助提取法［7］等。但超聲波乙醇浸提法提取橄欖葉總多酚工藝的研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)以福建主栽橄欖品種‘檀香’橄欖葉為試材，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究超聲波乙醇浸提法提取橄欖葉總多酚的工藝，為開發(fā)利用橄欖葉資源、開展橄欖葉多酚生物活性的研發(fā)提供參考依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)材料以福建主栽橄欖品種‘檀香’橄欖葉為材料，采自福建省閩清縣安仁溪橄欖科技示范場(chǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑沒食子酸為標(biāo)樣（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110831-201204）；無(wú)水碳酸鈉、無(wú)水乙醇均為分析純；福林酚試劑為生化試劑（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3儀器與設(shè)備752型紫外分光光度計(jì)（南京科捷分析儀器有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW177型中藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；AG-CP225D型離心機(jī)（德國(guó)Sartorius公司）；AR2130型電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；Milli-Q型超純水器（德國(guó)Millipore公司）；HH-S型恒溫水浴鍋（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；SFG-02（B）型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）。

2方法

2.1橄欖葉處理橄欖葉經(jīng)清洗、晾干后，置于40℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，粉碎并過(guò)80目篩，用自封袋密封后存放于干燥器中備用。

2.2沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線按照王宗舉［6］的方法繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3橄欖葉總多酚含量測(cè)定按照王宗舉［6］的方法采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定橄欖葉總多酚含量，按照公式（1）計(jì)算橄欖葉總多酚得率，單位以%計(jì)。

式中：C為按照沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到的橄欖葉提取液總多酚含量／（mg／L）；V為提取總多酚液體積／mL；M為橄欖葉質(zhì)量／g。

2.4單因素條件對(duì)橄欖葉總多酚得率的影響①提取溫度：精確稱取1.0 g干燥橄欖葉粉末5份，分別加入4～5倍量的石油醚脫脂、脫色后，各加入60%乙醇20 mL，分別在30、40、50、60、70℃下超聲浸提60 min。②乙醇濃度：精確稱取1.0 g干燥橄欖葉粉末5份，各加入4～5倍量的石油醚脫脂、脫色后，分別加入30%、40%、50%、60%、70%乙醇20 mL，在40℃下超聲浸提60 min。③固液比：精確稱取1.0 g干燥橄欖葉粉末5份，各加入4～5倍量的石油醚脫脂、脫色后，分別加入60%乙醇10、15、20、25、30 mL，在40℃下超聲浸提60 min。④提取時(shí)間：精確稱取1.0 g干燥橄欖葉粉末5份，分別加入4～5倍量的石油醚脫脂、脫色后，各加入60%乙醇20 mL，分別在40℃下超聲浸提20、30、40、50、60 min。以上各條件均固定超聲功率為500 W。

2.5正交試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)與分析結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化超聲波乙醇浸提法提取橄欖葉總多酚的工藝條件。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用Excel處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析。

3結(jié)果與分析

3.1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制由圖1可知，以吸光度（y）與對(duì)應(yīng)的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得到?jīng)]食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.1404x＋0.0023，R2＝0.9997，在0～4.8 mg／L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2提取溫度對(duì)橄欖葉總多酚得率的影響由圖2可知，橄欖葉總多酚得率在提取溫度為40℃時(shí)達(dá)到最大值，并隨著提取溫度增加，總多酚得率降低。這是由于隨著提取溫度升高，分子的運(yùn)動(dòng)速率加快，物料的傳質(zhì)、擴(kuò)散、滲透、溶解速度提高，可使多酚類物質(zhì)更易從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到溶劑中，提高橄欖葉總多酚得率；但是提取溫度越高，性質(zhì)不穩(wěn)定的多酚類物質(zhì)越易氧化分解并發(fā)生縮合反應(yīng)［8］，從而使橄欖葉總多酚得率降低。因此，選取提取溫度為40℃。

圖2提取溫度對(duì)橄欖葉總多酚得率的影響

3.3乙醇濃度對(duì)橄欖葉總多酚得率的影響由圖3可知，橄欖葉總多酚得率在乙醇濃度為60%時(shí)達(dá)到最大值，并隨著乙醇濃度增加，總多酚得率降低。這可能由于過(guò)高的乙醇濃度會(huì)增加其它醇溶性物質(zhì)的溶出，導(dǎo)致其與多酚類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)乙醇分子，從而使橄欖葉總多酚得率降低。因此，選取乙醇濃度為60%。

圖3乙醇濃度對(duì)橄欖葉總多酚得率的影響

3.4固液比對(duì)橄欖葉總多酚得率的影響固液比是指溶質(zhì)與溶劑的混合比例，可影響固相和液相間的濃度差。由圖4可知，固液比固定在1∶20時(shí)，總多酚得率最高。這說(shuō)明溶劑用量過(guò)低，與固相間的濃度差小，傳質(zhì)推動(dòng)力小，無(wú)法充分提取橄欖葉中的總多酚；溶劑用量過(guò)多，雖可提高傳質(zhì)推動(dòng)力，但也導(dǎo)致提取物中其它雜質(zhì)的含量增加，橄欖葉總多酚的得率反而下降，影響提取效果。因此，選取固液比為1∶20。

圖4固液比對(duì)橄欖葉總多酚得率的影響

3.5提取時(shí)間對(duì)橄欖葉總多酚得率的影響由圖5可知，橄欖葉總多酚得率在50 min時(shí)出現(xiàn)最大值，并隨著提取時(shí)間的增加，總多酚得率下降。這說(shuō)明適宜的提取時(shí)間可提高橄欖葉總多酚得率；但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致多酚類物質(zhì)分解，并且增加提取物中其它雜質(zhì)的含量，從而降低橄欖葉總多酚得率［12］。因此，選取提取時(shí)間為50 min。

3.6正交試驗(yàn)與分析根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在固定超聲波功率為500 W的基礎(chǔ)上，選取提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、乙醇濃度（C）、固液比（D）四因素，進(jìn)行四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表2，

圖5提取時(shí)間對(duì)橄欖葉總多酚得率的影響

正交試驗(yàn)方差分析見表3。

表1正交試驗(yàn)因素水平

表2正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析（x±s）

表3正交試驗(yàn)方差分析

由表2可知，超聲波乙醇浸提法提取橄欖葉總多酚的最優(yōu)工藝條件組合為A2B2C2D2，即提取時(shí)間為50 min，提取溫度為35℃，乙醇濃度為60%，固液比為1∶20。利用此最優(yōu)工藝條件組合進(jìn)行超聲波乙醇浸提法提取橄欖葉總多酚的驗(yàn)證性重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得總多酚得率為（8.90±0.14）%。同時(shí)，通過(guò)極差R值可以得出，各影響因素的主次關(guān)系為乙醇濃度＞固液比＞提取時(shí)間＞提取溫度。

由表3可知，提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度、固液比這4個(gè)因素對(duì)橄欖葉總多酚得率的影響均呈非常顯著性（P＜0.01）。

4討論

超聲波作用于植物體時(shí)可引起機(jī)械振動(dòng)，通過(guò)超聲波振動(dòng)產(chǎn)生高速率、高強(qiáng)度的機(jī)械作用和空化效應(yīng)，有效破壞植物細(xì)胞。超聲波提取技術(shù)就是利用上述原理，使植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞或變形，加速溶劑向植物組織中滲透，并加快有效成分向溶劑中擴(kuò)散，從而促進(jìn)有效成分的溶解，提高有效成分的得率［13］。研究表明：超聲波提取技術(shù)具有提取溫度低、提取率高、提取時(shí)間短等特點(diǎn)，不僅能提高生產(chǎn)效率，而且能有效保持成分的活性，已廣泛應(yīng)用于多酚類物質(zhì)及其它天然植物源活性成分的提取［12-15］。本試驗(yàn)在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上，固定超聲波功率為500 W，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度、固液比進(jìn)行優(yōu)化，得出最優(yōu)工藝條件為提取時(shí)間50 min，提取溫度35℃，乙醇濃度60%，固液比為1∶20，各因素影響橄欖葉總多酚得率的主次關(guān)系為乙醇濃度＞固液比＞提取時(shí)間＞提取溫度。在此最優(yōu)工藝條件下，橄欖葉總多酚得率高達(dá)（8.90±0.14）%，要高于王宗舉［6］報(bào)道的采用均勻設(shè)計(jì)法提取橄欖葉多酚的得率，但低于鄭賢明［7］報(bào)道的采用微波強(qiáng)化提取橄欖葉多酚的得率，這可能是實(shí)驗(yàn)材料及提取方法的差異造成的。

綜上所述，采用正交試驗(yàn)方法對(duì)橄欖葉中總多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，可獲得最佳工藝條件，增強(qiáng)工藝的可操作性。

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R284.2

A

1000-338X（2017）02-0034-04

2016-12-23

孔祥佳（1983—），女，博士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物提取及活性研究。