片仔癀對肝癌干細胞增殖及凋亡的影響

魏麗慧，齊飛，彭軍，嚴茂林，邱福南，白燕南，王耀東

（1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122；3.福建省立醫(yī)院，福建福州350001；4.福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院，福建福州350001）

·實驗研究·

片仔癀對肝癌干細胞增殖及凋亡的影響

魏麗慧1，2，齊飛1，2，彭軍1，2，嚴茂林3，4，邱福南3，4，白燕南3，4，王耀東3，4

（1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122；3.福建省立醫(yī)院，福建福州350001；4.福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院，福建福州350001）

目的利用克隆球培養(yǎng)法富集肝癌干細胞，研究片仔癀對肝癌干細胞增殖及凋亡的影響。方法采用克隆球培養(yǎng)法對肝癌干細胞進行富集，采用RT-PCR檢測肝癌細胞及肝癌干細胞中自我更新基因Oct-4 mRNA的表達；利用流式細胞儀檢測肝癌細胞及肝癌干細胞表面標記蛋白CD133、CD90表達；采用臺盼藍計數方法檢測片仔癀對肝癌干細胞增殖的影響；利用Hoechst33342染色法檢測片仔癀對肝癌干細胞凋亡的影響。結果采用克隆球培養(yǎng)法可富集成球生長的肝癌干細胞；與肝癌細胞比較，肝癌干細胞Oct-4、CD133、CD90高表達（P＜0.05）；片仔癀給藥后可顯著抑制肝癌干細胞的增殖（P＜0.05），并增加肝癌干細胞中凋亡的細胞。結論片仔癀具有抑制肝癌干細胞增殖及誘導其凋亡的作用。

片仔癀；肝癌；肝癌干細胞；增殖；凋亡

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位于惡性腫瘤第二位［1］。隨著對腫瘤發(fā)病機制的逐步闡明，近年來在肝癌的診療方面有了較大的進展，但由于腫瘤轉移、復發(fā)、化放療的耐受性和毒副作用等問題仍然存在，總的預后改善并不明顯［2］。腫瘤干細胞（cancen stem cells，CSCs）被認為是腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉移、復發(fā)的根源［3］。因此，針對腫瘤干細胞的治療是目前根除肝癌的最有效治療方法之一。

（五）職能拓展，能力素質要求高。調整改革后的省軍區(qū)系統(tǒng)，在保留國防動員、兵員征集、國防教育、國防設施保護、雙擁工作主要職能的基礎上，又拓展了軍民融合協(xié)調和老干部服務管理保障兩項職能，職能任務更加寬泛，特別是省軍區(qū)融入戰(zhàn)區(qū)作戰(zhàn)指揮鏈后，統(tǒng)籌協(xié)調軍地力量參與信息化條件下聯合作戰(zhàn)，面向三軍搞好動員保障，組織指揮后備力量遂行應急應戰(zhàn)等任務更加繁重。這就要求省軍區(qū)系統(tǒng)廣大官兵，既要懂平時動員建設、又要懂戰(zhàn)時聯合指揮，既要會抓部隊管理、又要善于溝通協(xié)調，既要熟悉陸軍部隊、又要了解其他軍種，既要精通軍事業(yè)務、又要知曉地方經濟。

對包括肝癌在內多種惡性腫瘤有明確治療作用的片仔癀基礎研究［4－5］發(fā)現：其具有誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、抗腫瘤血管新生的作用［6-8］，但對于肝癌干細胞的研究尚未見報道。因此，為了進一步揭示片仔癀治療肝癌的作用機制，本文以腫瘤干細胞為切入點，研究片仔癀對肝癌干細胞增殖及凋亡的影響。

1材料

1.1藥物和細胞株片仔癀粉末由漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司提供；人肝癌細胞株HepG2購自美國ATCC細胞庫。

1.2主要試劑及耗材MEM培養(yǎng)基、DMEM／F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、B-27 Supplement、Antibiotic-Antimycotic、干細胞消化酶、PCR master mix（美國Thermo Fisher Scientific公司）；human EGF、human FGF-basic（美國Peprotech

公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、青霉素-鏈霉素（美國Gibco公司）；CD133抗體（德國Miltenyi Biotec公司）；CD90抗體（美國BD公司）；Oct-4引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；Hoechst33342（美國Sigma公司）；4%臺盼藍（美國Amresco公司）；逆轉錄試劑盒（中國寶生物工程大連有限公司）；低黏附6孔板（美國Corning公司）。

2.6臺盼藍計數法檢測片仔癀對肝癌干細胞增殖的影響利用干細胞消化酶消化肝癌干細胞，計數并調整細胞密度，以1.0×105個／mL接種于6孔板中；分成對照組、片仔癀低、中、高劑量組，每個濃度重復3孔，干預24 h后，消化收集細胞；用培養(yǎng)液重懸細胞后，進行計數，得到活細胞數值，并按下列公式計算：

2方法

3.2功能學驗證采用RT-PCR檢測肝癌細胞及肝癌干細胞中Oct-4 mRNA的表達，見圖2。與肝癌細胞比較，肝癌干細胞Oct-4 mRNA明顯高表達（P＜0.05）。采用流式細胞儀檢測CD133、CD90的表達，見圖3。與肝癌細胞比較，肝癌干細胞中CD133＋CD90＋細胞所占比例明顯增高，證實了克隆球可以作為富集肝癌干細胞的方式。

2.2肝癌細胞的培養(yǎng)及分組肝癌細胞（HepG2）用含10%FBS的MEM培養(yǎng)液（含100 U／mL青霉素、100 μg／mL鏈霉素），置于37℃含5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細胞生長至匯合度達80%左右時，加入0.25%胰蛋白酶進行消化，3 min后，觀察細胞變圓且部分漂浮時加入2倍體積含10% FBS的新鮮培養(yǎng)基終止消化，1 000轉／min離心5 min，棄上清收集沉淀細胞。用含10%FBS的MEM完全培養(yǎng)液重懸制成單細胞懸液后傳代或接板。

細胞存活率／%＝（片仔癀藥物組活細胞數值／對照組活細胞數值）×100%。

3.1克隆球富集肝癌干細胞肝癌細胞接種于低粘附6孔板中，用干細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，10 d后，發(fā)現肝癌干細胞呈克隆球狀生長；肝癌細胞在含10%FBS的MEM培養(yǎng)液中則呈貼壁生長，結果見圖1。

2.4RT-PCR檢測Oct-4 mRNA的表達收集肝癌細胞、肝癌干細胞，分別加入Trizol，參照Trizol試劑（美國Invitrigen公司）說明書提取總RNA。取總RNA 1 μg，應用逆轉錄（RT）試劑盒進行逆轉錄反應為cDNA。進行PCR反應，PCR反應體系（20 μL體系）：cDNA 1 μL，PCR master mix 10 μL，上下游引物各1 μL，加DEPC水至20 μL，震蕩混勻，高速離心10 s后，置PCR熱循環(huán)儀擴增；擴增條件為：95℃預變性4 min，94℃變性30 s，58℃退火35 s，72℃延伸40 s，持續(xù)35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。Oct-4引物序列：上游5′-GGTATTCAGCCAA ACGACCATCT-3′，下游5′-TCTCACTCGGTTCTCG ATACTGG-3′。PCR產物經在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳后進行光密度掃描，以GAPDH基因為內參，各基因的擴增條帶的光密度值與各自內參的光密度值之比作為衡量參數，采用Quantity one軟件分析。

2.7Hoechst33342檢測片仔癀對肝癌干細胞凋亡的影響利用干細胞消化酶消化肝癌干細胞，計數并調整細胞密度，以1.0×105個／mL接種于6孔板中；分成對照組、片仔癀低、中、高劑量組，每個濃度重復3孔；干預24 h后，去除上清，用PBS清洗1次，用4%多聚甲醛37℃固定10 min，用PBS清洗3次，每次5 min；加入Hoechst33342，避光，在室溫孵育10 min；再用PBS清洗3次后，加入適量的PBS，在熒光顯微鏡下進行觀察并拍照。

培訓業(yè)務單位的功能設計主要體現在邏輯方面，比如，培訓業(yè)務單位的管理邏輯、控制邏輯及培訓示范村邏輯等。其中，管理工作者在創(chuàng)建新的工程縣信息的過程中，首要工作是收到新的請求，并通過培訓業(yè)務管理控制體系，傳達到控制調用位置，從而完成新項目的增添。

1.3主要儀器超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱、低速普通離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；5417R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；熒光倒置顯微鏡系統(tǒng)（日本Olympus公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica公司）；MOFLO XDP高速分選型流式細胞儀（美國Beckman coulter公司）；細胞計數系統(tǒng)（美國Countstar公司）；PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

建功新時代，揚帆新征程。當前，蘇州正在以習近平新時代中國特色社會主義思想為指導，自覺用新思想定向領航，以新思想對標找差，從新思想尋策問道，按照省委決策部署和對蘇州工作提出的新要求，圍繞推動高質量發(fā)展，深化實施十二項“三年行動計劃”，為再創(chuàng)新輝煌夯實堅固基礎、注入強勁活力、再添秀美氣質、繪就艷麗華章。

2.5流式細胞儀檢測CD133、CD90的表達分別用胰酶、干細胞消化酶將肝癌細胞、肝癌干細胞消化成單細胞，用PBS清洗1次，重懸細胞，調整細胞數為1.0×106個／100 μL，加入CD133抗體（FITC熒光標記）10 μL、CD90抗體（PE熒光標記）5 μL，避光，室溫孵育15 min；再用PBS清洗1次，用500 μL PBS重懸上機進行檢測。

其中一類調控機制是小RNA介導的轉錄調控，小RNA是一種非編碼單鏈RNA分子，會識別與之序列相匹配的轉錄本，并和其他蛋白一起將其降解?！暗绻驗榭勺兗艚颖磉_出不含相應識別位點的轉錄本，則不會受此影響?！眲⒑＼娬f。

2.8統(tǒng)計學方法實驗數據采用SPSS17.0版統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料采用t檢驗，多個樣本均數比較采用方差分析。

3結果

2.3肝癌干細胞的培養(yǎng)和分組2.2中所獲得的肝癌單細胞懸液接種于低粘附6孔板中，每孔接種1 000個細胞，在干細胞培養(yǎng)液中富集克隆球，10 d后，將形成的克隆球細胞作為肝癌干細胞用于后續(xù)實驗。分成對照組（0 mg／mL）、片仔癀低劑量組（0.25 mg／mL）、片仔癀中劑量組（0.5 mg／mL）、片仔癀高劑量組（0.75 mg／mL）。

防水涂料是一種液態(tài)或半液態(tài)的物質，在建筑表面采用刷子或噴涂等施工技術，通過化學反應形成一個連續(xù)的、具有一定的彈性和厚度的薄膜，這樣可以抵抗一定的水壓力，從而達到防水和防潮的目的。防水涂料是一種特殊的涂料，其特殊性在于涂層表面可以形成一個柔軟、防水、抗裂的防水結構層，阻擋水分子從外部向基層滲透。因此，與普通建筑涂料的原材料有所不同，這種防水涂料主要采用憎水性強、耐水性好的有機高分子涂層如聚氨酯、氯丁橡膠、再生橡膠、SBS橡膠瀝青及其混合料，輔助材料主要采用固化劑、增韌劑、增粘劑、防腐劑、染色劑和乳化劑等，其生產工藝和膜的形成與普通建筑涂料的原理基本上是相同的。

圖1肝癌細胞及肝癌干細胞生長形態(tài)圖（×100）

2.1片仔癀溶液的配制將片仔癀粉末用PBS配制成20 mg／mL的溶液，放于超聲機中進行超聲溶解，經滅菌處理后放于-20℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

3.3片仔癀對肝癌干細胞增殖的影響采用臺盼藍計數法檢測片仔癀干預后，肝癌干細胞的存活情況，見圖4。與對照組比較，片仔癀中、高劑量組肝癌干細胞的存活率明顯降低（P＜0.05），提示片仔癀具有抑制肝癌干細胞增殖的作用。

綜上所述，國內外學者對水牛乳的理化特性都進行了大量研究，但要充分了解我國水牛乳理化和生物學特性還需要大量研究。此外，在研究時，還需要特別注意乳水牛品種、生活地域環(huán)境、產乳胎次等因素，才能得出較為客觀的結論。

3.4片仔癀對肝癌干細胞凋亡的影響采用Hoechst33342檢測片仔癀對肝癌干細胞凋亡的影響，見圖5。凋亡的細胞呈高亮狀態(tài)，片仔癀干預24 h后，與對照組比較，片仔癀組肝癌干細胞凋亡的細胞數量明顯增多，提示片仔癀具有誘導肝癌干細胞凋亡的作用。

4討論

圖2RT-PCR檢測Oct-4 mRNA的表達情況

圖3流式細胞儀檢測CD133+CD90+的表達情況

圖4片仔癀對肝癌干細胞增殖的影響

圖5片仔癀誘導肝癌干細胞凋亡圖（×100）

腫瘤干細胞理論的提出，更新了人們對腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移、復發(fā)的理解。認為腫瘤干細胞是腫瘤形成的起始細胞并維持腫瘤的生長，而腫瘤中絕大多數細胞不能自我更新，而是經過有限的增殖之后最終走向凋亡。因此，普通腫瘤細胞播散可能不會導致腫瘤的轉移、復發(fā)，而腫瘤干細胞才是導致腫瘤轉移、復發(fā)的根源。近年來，在多種實體瘤中證實腫瘤干細胞的存在，如乳腺癌、肝癌、大腸癌［9-11］。以手術切除為主的綜合治療是目前肝癌治療最有效的方法，但是，根治性切除后病人5 a生存率仍然低，且存在復發(fā)及轉移的問題［2］。因此，針對腫瘤干細胞的治療是目前肝癌研究的熱點之一［12］。

腫瘤干細胞有多種分選富集方法，在無血清的干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)懸浮克隆球是常用的方法之一。Oct-4是目前公認最早的干細胞調控因子，在維持干細胞自我更新及多潛能性發(fā)揮著重要的作用［13］，可用于干細胞的干性驗證。且研究發(fā)現：包括肝癌在內的多種惡性腫瘤中均有Oct-4的異常表達，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關［14］。CD133、CD90是目前用于分選肝癌干細胞的重要表面標記物［15-16］，但目前，肝癌干細胞的標志物研究還只局限于從正常肝干／祖細胞的表面標志物去推定，尚缺乏特異性標志物來鑒定和分離肝癌干細胞。因此，本實驗用克隆球富集的方式，并利用Oct-4及CD133、CD90進行驗證。實驗結果證實：克隆球細胞中Oct-4基因及CD133+CD90+細胞顯著增高。

具有清熱解毒、消腫散結、活血化瘀功效的片仔癀，一直以來，在民間以及東南亞地區(qū)被廣泛用于包括肝癌在內的消化道惡性腫瘤的治療，但對于肝癌干細胞的作用尚未見報道。因此，本研究通過克隆球富集肝癌干細胞，并觀察片仔癀對肝癌干細胞增殖及凋亡的影響。實驗結果顯示：片仔癀干預后，可顯著抑制肝癌干細胞的生存率，并顯著增加肝癌干細胞中凋亡細胞的數量，揭示了片仔癀具有抑制肝癌干細胞增殖及誘導其凋亡的作用。

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R285.5

A

1000-338X（2017）02-0027-04

2016-12-22

福建省衛(wèi)生教育聯合攻關計劃項目（WKJ-FJ-21）；福建省教育廳科技項目A類（JA14162）；福建省自然科學基金項目（2014J01404）

魏麗慧（1985—），女，實驗師，主要從事中西醫(yī)抗腫瘤機制研究。

王耀東（1956—），男，主任醫(yī)師，碩士生導師。

E-mail：wangyaodongch@163.com