片仔癀對肝癌干細(xì)胞增殖及凋亡的影響

魏麗慧，齊飛，彭軍，嚴(yán)茂林，邱福南，白燕南，王耀東

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350122；3.福建省立醫(yī)院，福建福州350001；4.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建福州350001）

·實(shí)驗(yàn)研究·

片仔癀對肝癌干細(xì)胞增殖及凋亡的影響

魏麗慧1，2，齊飛1，2，彭軍1，2，嚴(yán)茂林3，4，邱福南3，4，白燕南3，4，王耀東3，4

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350122；3.福建省立醫(yī)院，福建福州350001；4.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建福州350001）

目的利用克隆球培養(yǎng)法富集肝癌干細(xì)胞，研究片仔癀對肝癌干細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法采用克隆球培養(yǎng)法對肝癌干細(xì)胞進(jìn)行富集，采用RT-PCR檢測肝癌細(xì)胞及肝癌干細(xì)胞中自我更新基因Oct-4 mRNA的表達(dá)；利用流式細(xì)胞儀檢測肝癌細(xì)胞及肝癌干細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白CD133、CD90表達(dá)；采用臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)方法檢測片仔癀對肝癌干細(xì)胞增殖的影響；利用Hoechst33342染色法檢測片仔癀對肝癌干細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果采用克隆球培養(yǎng)法可富集成球生長的肝癌干細(xì)胞；與肝癌細(xì)胞比較，肝癌干細(xì)胞Oct-4、CD133、CD90高表達(dá)（P＜0.05）；片仔癀給藥后可顯著抑制肝癌干細(xì)胞的增殖（P＜0.05），并增加肝癌干細(xì)胞中凋亡的細(xì)胞。結(jié)論片仔癀具有抑制肝癌干細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡的作用。

片仔癀；肝癌；肝癌干細(xì)胞；增殖；凋亡

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位于惡性腫瘤第二位［1］。隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)制的逐步闡明，近年來在肝癌的診療方面有了較大的進(jìn)展，但由于腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、化放療的耐受性和毒副作用等問題仍然存在，總的預(yù)后改善并不明顯［2］。腫瘤干細(xì)胞（cancen stem cells，CSCs）被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的根源［3］。因此，針對腫瘤干細(xì)胞的治療是目前根除肝癌的最有效治療方法之一。

（五）職能拓展，能力素質(zhì)要求高。調(diào)整改革后的省軍區(qū)系統(tǒng)，在保留國防動員、兵員征集、國防教育、國防設(shè)施保護(hù)、雙擁工作主要職能的基礎(chǔ)上，又拓展了軍民融合協(xié)調(diào)和老干部服務(wù)管理保障兩項(xiàng)職能，職能任務(wù)更加寬泛，特別是省軍區(qū)融入戰(zhàn)區(qū)作戰(zhàn)指揮鏈后，統(tǒng)籌協(xié)調(diào)軍地力量參與信息化條件下聯(lián)合作戰(zhàn)，面向三軍搞好動員保障，組織指揮后備力量遂行應(yīng)急應(yīng)戰(zhàn)等任務(wù)更加繁重。這就要求省軍區(qū)系統(tǒng)廣大官兵，既要懂平時(shí)動員建設(shè)、又要懂戰(zhàn)時(shí)聯(lián)合指揮，既要會抓部隊(duì)管理、又要善于溝通協(xié)調(diào)，既要熟悉陸軍部隊(duì)、又要了解其他軍種，既要精通軍事業(yè)務(wù)、又要知曉地方經(jīng)濟(jì)。

對包括肝癌在內(nèi)多種惡性腫瘤有明確治療作用的片仔癀基礎(chǔ)研究［4－5］發(fā)現(xiàn)：其具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗腫瘤血管新生的作用［6-8］，但對于肝癌干細(xì)胞的研究尚未見報(bào)道。因此，為了進(jìn)一步揭示片仔癀治療肝癌的作用機(jī)制，本文以腫瘤干細(xì)胞為切入點(diǎn)，研究片仔癀對肝癌干細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1材料

1.1藥物和細(xì)胞株片仔癀粉末由漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司提供；人肝癌細(xì)胞株HepG2購自美國ATCC細(xì)胞庫。

1.2主要試劑及耗材MEM培養(yǎng)基、DMEM／F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、B-27 Supplement、Antibiotic-Antimycotic、干細(xì)胞消化酶、PCR master mix（美國Thermo Fisher Scientific公司）；human EGF、human FGF-basic（美國Peprotech

公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、青霉素-鏈霉素（美國Gibco公司）；CD133抗體（德國Miltenyi Biotec公司）；CD90抗體（美國BD公司）；Oct-4引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；Hoechst33342（美國Sigma公司）；4%臺盼藍(lán)（美國Amresco公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國寶生物工程大連有限公司）；低黏附6孔板（美國Corning公司）。

2.6臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)法檢測片仔癀對肝癌干細(xì)胞增殖的影響利用干細(xì)胞消化酶消化肝癌干細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度，以1.0×105個(gè)／mL接種于6孔板中；分成對照組、片仔癀低、中、高劑量組，每個(gè)濃度重復(fù)3孔，干預(yù)24 h后，消化收集細(xì)胞；用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后，進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到活細(xì)胞數(shù)值，并按下列公式計(jì)算：

2方法

3.2功能學(xué)驗(yàn)證采用RT-PCR檢測肝癌細(xì)胞及肝癌干細(xì)胞中Oct-4 mRNA的表達(dá)，見圖2。與肝癌細(xì)胞比較，肝癌干細(xì)胞Oct-4 mRNA明顯高表達(dá)（P＜0.05）。采用流式細(xì)胞儀檢測CD133、CD90的表達(dá)，見圖3。與肝癌細(xì)胞比較，肝癌干細(xì)胞中CD133＋CD90＋細(xì)胞所占比例明顯增高，證實(shí)了克隆球可以作為富集肝癌干細(xì)胞的方式。

2.2肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)及分組肝癌細(xì)胞（HepG2）用含10%FBS的MEM培養(yǎng)液（含100 U／mL青霉素、100 μg／mL鏈霉素），置于37℃含5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞生長至匯合度達(dá)80%左右時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，3 min后，觀察細(xì)胞變圓且部分漂浮時(shí)加入2倍體積含10% FBS的新鮮培養(yǎng)基終止消化，1 000轉(zhuǎn)／min離心5 min，棄上清收集沉淀細(xì)胞。用含10%FBS的MEM完全培養(yǎng)液重懸制成單細(xì)胞懸液后傳代或接板。

細(xì)胞存活率／%＝（片仔癀藥物組活細(xì)胞數(shù)值／對照組活細(xì)胞數(shù)值）×100%。

3.1克隆球富集肝癌干細(xì)胞肝癌細(xì)胞接種于低粘附6孔板中，用干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，10 d后，發(fā)現(xiàn)肝癌干細(xì)胞呈克隆球狀生長；肝癌細(xì)胞在含10%FBS的MEM培養(yǎng)液中則呈貼壁生長，結(jié)果見圖1。

2.4RT-PCR檢測Oct-4 mRNA的表達(dá)收集肝癌細(xì)胞、肝癌干細(xì)胞，分別加入Trizol，參照Trizol試劑（美國Invitrigen公司）說明書提取總RNA。取總RNA 1 μg，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為cDNA。進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系（20 μL體系）：cDNA 1 μL，PCR master mix 10 μL，上下游引物各1 μL，加DEPC水至20 μL，震蕩混勻，高速離心10 s后，置PCR熱循環(huán)儀擴(kuò)增；擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，58℃退火35 s，72℃延伸40 s，持續(xù)35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。Oct-4引物序列：上游5′-GGTATTCAGCCAA ACGACCATCT-3′，下游5′-TCTCACTCGGTTCTCG ATACTGG-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳后進(jìn)行光密度掃描，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，各基因的擴(kuò)增條帶的光密度值與各自內(nèi)參的光密度值之比作為衡量參數(shù)，采用Quantity one軟件分析。

2.7Hoechst33342檢測片仔癀對肝癌干細(xì)胞凋亡的影響利用干細(xì)胞消化酶消化肝癌干細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度，以1.0×105個(gè)／mL接種于6孔板中；分成對照組、片仔癀低、中、高劑量組，每個(gè)濃度重復(fù)3孔；干預(yù)24 h后，去除上清，用PBS清洗1次，用4%多聚甲醛37℃固定10 min，用PBS清洗3次，每次5 min；加入Hoechst33342，避光，在室溫孵育10 min；再用PBS清洗3次后，加入適量的PBS，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

培訓(xùn)業(yè)務(wù)單位的功能設(shè)計(jì)主要體現(xiàn)在邏輯方面，比如，培訓(xùn)業(yè)務(wù)單位的管理邏輯、控制邏輯及培訓(xùn)示范村邏輯等。其中，管理工作者在創(chuàng)建新的工程縣信息的過程中，首要工作是收到新的請求，并通過培訓(xùn)業(yè)務(wù)管理控制體系，傳達(dá)到控制調(diào)用位置，從而完成新項(xiàng)目的增添。

1.3主要儀器超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱、低速普通離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；5417R高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；熒光倒置顯微鏡系統(tǒng)（日本Olympus公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica公司）；MOFLO XDP高速分選型流式細(xì)胞儀（美國Beckman coulter公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)（美國Countstar公司）；PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

建功新時(shí)代，揚(yáng)帆新征程。當(dāng)前，蘇州正在以習(xí)近平新時(shí)代中國特色社會主義思想為指導(dǎo)，自覺用新思想定向領(lǐng)航，以新思想對標(biāo)找差，從新思想尋策問道，按照省委決策部署和對蘇州工作提出的新要求，圍繞推動高質(zhì)量發(fā)展，深化實(shí)施十二項(xiàng)“三年行動計(jì)劃”，為再創(chuàng)新輝煌夯實(shí)堅(jiān)固基礎(chǔ)、注入強(qiáng)勁活力、再添秀美氣質(zhì)、繪就艷麗華章。

2.5流式細(xì)胞儀檢測CD133、CD90的表達(dá)分別用胰酶、干細(xì)胞消化酶將肝癌細(xì)胞、肝癌干細(xì)胞消化成單細(xì)胞，用PBS清洗1次，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.0×106個(gè)／100 μL，加入CD133抗體（FITC熒光標(biāo)記）10 μL、CD90抗體（PE熒光標(biāo)記）5 μL，避光，室溫孵育15 min；再用PBS清洗1次，用500 μL PBS重懸上機(jī)進(jìn)行檢測。

其中一類調(diào)控機(jī)制是小RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，小RNA是一種非編碼單鏈RNA分子，會識別與之序列相匹配的轉(zhuǎn)錄本，并和其他蛋白一起將其降解?！暗绻?yàn)榭勺兗艚颖磉_(dá)出不含相應(yīng)識別位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本，則不會受此影響?！眲⒑＼娬f。

2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析。

3結(jié)果

2.3肝癌干細(xì)胞的培養(yǎng)和分組2.2中所獲得的肝癌單細(xì)胞懸液接種于低粘附6孔板中，每孔接種1 000個(gè)細(xì)胞，在干細(xì)胞培養(yǎng)液中富集克隆球，10 d后，將形成的克隆球細(xì)胞作為肝癌干細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分成對照組（0 mg／mL）、片仔癀低劑量組（0.25 mg／mL）、片仔癀中劑量組（0.5 mg／mL）、片仔癀高劑量組（0.75 mg／mL）。

防水涂料是一種液態(tài)或半液態(tài)的物質(zhì)，在建筑表面采用刷子或噴涂等施工技術(shù)，通過化學(xué)反應(yīng)形成一個(gè)連續(xù)的、具有一定的彈性和厚度的薄膜，這樣可以抵抗一定的水壓力，從而達(dá)到防水和防潮的目的。防水涂料是一種特殊的涂料，其特殊性在于涂層表面可以形成一個(gè)柔軟、防水、抗裂的防水結(jié)構(gòu)層，阻擋水分子從外部向基層滲透。因此，與普通建筑涂料的原材料有所不同，這種防水涂料主要采用憎水性強(qiáng)、耐水性好的有機(jī)高分子涂層如聚氨酯、氯丁橡膠、再生橡膠、SBS橡膠瀝青及其混合料，輔助材料主要采用固化劑、增韌劑、增粘劑、防腐劑、染色劑和乳化劑等，其生產(chǎn)工藝和膜的形成與普通建筑涂料的原理基本上是相同的。

圖1肝癌細(xì)胞及肝癌干細(xì)胞生長形態(tài)圖（×100）

2.1片仔癀溶液的配制將片仔癀粉末用PBS配制成20 mg／mL的溶液，放于超聲機(jī)中進(jìn)行超聲溶解，經(jīng)滅菌處理后放于-20℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

3.3片仔癀對肝癌干細(xì)胞增殖的影響采用臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)法檢測片仔癀干預(yù)后，肝癌干細(xì)胞的存活情況，見圖4。與對照組比較，片仔癀中、高劑量組肝癌干細(xì)胞的存活率明顯降低（P＜0.05），提示片仔癀具有抑制肝癌干細(xì)胞增殖的作用。

綜上所述，國內(nèi)外學(xué)者對水牛乳的理化特性都進(jìn)行了大量研究，但要充分了解我國水牛乳理化和生物學(xué)特性還需要大量研究。此外，在研究時(shí)，還需要特別注意乳水牛品種、生活地域環(huán)境、產(chǎn)乳胎次等因素，才能得出較為客觀的結(jié)論。

3.4片仔癀對肝癌干細(xì)胞凋亡的影響采用Hoechst33342檢測片仔癀對肝癌干細(xì)胞凋亡的影響，見圖5。凋亡的細(xì)胞呈高亮狀態(tài)，片仔癀干預(yù)24 h后，與對照組比較，片仔癀組肝癌干細(xì)胞凋亡的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，提示片仔癀具有誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞凋亡的作用。

4討論

圖2RT-PCR檢測Oct-4 mRNA的表達(dá)情況

圖3流式細(xì)胞儀檢測CD133+CD90+的表達(dá)情況

圖4片仔癀對肝癌干細(xì)胞增殖的影響

圖5片仔癀誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞凋亡圖（×100）

腫瘤干細(xì)胞理論的提出，更新了人們對腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的理解。認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是腫瘤形成的起始細(xì)胞并維持腫瘤的生長，而腫瘤中絕大多數(shù)細(xì)胞不能自我更新，而是經(jīng)過有限的增殖之后最終走向凋亡。因此，普通腫瘤細(xì)胞播散可能不會導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，而腫瘤干細(xì)胞才是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的根源。近年來，在多種實(shí)體瘤中證實(shí)腫瘤干細(xì)胞的存在，如乳腺癌、肝癌、大腸癌［9-11］。以手術(shù)切除為主的綜合治療是目前肝癌治療最有效的方法，但是，根治性切除后病人5 a生存率仍然低，且存在復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的問題［2］。因此，針對腫瘤干細(xì)胞的治療是目前肝癌研究的熱點(diǎn)之一［12］。

腫瘤干細(xì)胞有多種分選富集方法，在無血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)懸浮克隆球是常用的方法之一。Oct-4是目前公認(rèn)最早的干細(xì)胞調(diào)控因子，在維持干細(xì)胞自我更新及多潛能性發(fā)揮著重要的作用［13］，可用于干細(xì)胞的干性驗(yàn)證。且研究發(fā)現(xiàn)：包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中均有Oct-4的異常表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［14］。CD133、CD90是目前用于分選肝癌干細(xì)胞的重要表面標(biāo)記物［15-16］，但目前，肝癌干細(xì)胞的標(biāo)志物研究還只局限于從正常肝干／祖細(xì)胞的表面標(biāo)志物去推定，尚缺乏特異性標(biāo)志物來鑒定和分離肝癌干細(xì)胞。因此，本實(shí)驗(yàn)用克隆球富集的方式，并利用Oct-4及CD133、CD90進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：克隆球細(xì)胞中Oct-4基因及CD133+CD90+細(xì)胞顯著增高。

具有清熱解毒、消腫散結(jié)、活血化瘀功效的片仔癀，一直以來，在民間以及東南亞地區(qū)被廣泛用于包括肝癌在內(nèi)的消化道惡性腫瘤的治療，但對于肝癌干細(xì)胞的作用尚未見報(bào)道。因此，本研究通過克隆球富集肝癌干細(xì)胞，并觀察片仔癀對肝癌干細(xì)胞增殖及凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：片仔癀干預(yù)后，可顯著抑制肝癌干細(xì)胞的生存率，并顯著增加肝癌干細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的數(shù)量，揭示了片仔癀具有抑制肝癌干細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡的作用。

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R285.5

A

1000-338X（2017）02-0027-04

2016-12-22

福建省衛(wèi)生教育聯(lián)合攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（WKJ-FJ-21）；福建省教育廳科技項(xiàng)目A類（JA14162）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014J01404）

魏麗慧（1985—），女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事中西醫(yī)抗腫瘤機(jī)制研究。

王耀東（1956—），男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。

E-mail：wangyaodongch@163.com