冬棗花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)的影響因素

段麗君　鄧青云　李國元　汪殿蓓

摘要：以冬棗花藥為試驗(yàn)材料，探討冬棗花藥離體培養(yǎng)中不同麥芽糖濃度、不同激素濃度及低溫預(yù)處理和高溫預(yù)處理對花藥培養(yǎng)效果的影響，建立一套更適合冬棗花藥培養(yǎng)技術(shù)體系。結(jié)果表明：花藥膨大率與出愈率之間有明顯的相關(guān)性；在MS+2，4-D1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+麥芽糖20/L+瓊脂4g/L培養(yǎng)基中最高花藥愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)37.2%，4℃低溫預(yù)處理3 d能顯著提高愈傷組織誘導(dǎo)率，35℃高溫預(yù)處理出愈率會顯著降低。

關(guān)鍵詞：冬棗；花藥培養(yǎng)；愈傷組織；誘導(dǎo)；技術(shù)體系；膨大率；出愈率；影響因素

中圖分類號：S665.104⁺.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002—1302（2016）01—0060—03

冬棗（Ziziphusjujuba Mill.cv.Dongzao）為鼠李科棗屬植物，別稱果子棗、雁過紅、廟上福、蘋果棗、冰糖棗，果皮薄，核小，果肉汁多、細(xì)嫩酥脆、色澤鮮艷、甜味濃，富含鈣、鐵、鋅等多種礦物質(zhì)，維生素C含量頗豐富，素有維生素C之王的稱號，其含糖量適中，味美可口，具有清理腸胃，有助于消化之功效，是美容和減肥的佳品。關(guān)于冬棗的花藥培養(yǎng)研究較少，王娜通過誘導(dǎo)胚胎愈傷組織的途徑對冬棗花藥進(jìn)行培養(yǎng)，獲得1株單倍體植株；武曉紅研究了甘露醇、不同溫度條件預(yù)處理對棗花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響；劉曉光研究了冬棗花藥愈傷組織的誘導(dǎo)，懸浮系的建立、培養(yǎng)及愈傷懸浮系原生質(zhì)體的分離。本試驗(yàn)分析了麥芽糖、激素和低溫預(yù)處理等多種因素在冬棗花藥愈傷組織誘導(dǎo)中的作用，建立一套更適合冬棗花藥培養(yǎng)的技術(shù)體系，從而推動(dòng)湖北省孝昌縣冬棗產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

冬棗花藥采自湖北省孝昌縣種植地。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1愈傷組織的誘導(dǎo) 5—6月選取直徑為0.3～0.6 cm且花萼尚未張開的未成熟的新鮮花蕾，在70%乙醇中浸泡10 s，用無菌水沖洗3次，用0.1%氯化汞溶液浸泡10 min，再用無菌水沖洗3～4次，將花蕾轉(zhuǎn)移至已經(jīng)滅過菌、鋪有濾紙的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，剝?nèi)』ɡ伲〕龌ㄋ?，接種到盛有50 mL固體培養(yǎng)基的100 mL的三角瓶中，每瓶接種30枚，每個(gè)處理接種10瓶，放在（26±1）℃培養(yǎng)室黑暗條件下培養(yǎng)，觀察不同條件下花藥愈傷組織的誘導(dǎo)。

1.2.2繼代和分化培養(yǎng) 愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時(shí)間后，營養(yǎng)物枯竭，水分散失，并已經(jīng)積累了一些代謝產(chǎn)物，此時(shí)須要將這些組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)基使用MS+6-BA 0.2 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L+麥芽糖20 g/L+瓊脂4g/L。每次繼代培養(yǎng)約20 d，1～2次繼代后，挑選脆的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基MS+NAA 0.2 mg/L+麥芽糖20g/L+瓊脂4 g/L上。

2結(jié)果與分析

2.1花藥愈傷組織的誘導(dǎo)

花藥在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，局部開始發(fā)生褐變，4～5 d后大部分的花藥開始膨脹，出現(xiàn)不同程度的卷曲，花藥在2周后逐漸開裂，3周后在花藥花絲斷裂處和藥壁上長出愈傷組織或胚。從誘導(dǎo)的愈傷組織來看，大部分是淡黃色松散型（圖1），這種愈傷組織經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)，就更加松散，顆粒小，分散性很好，很難用鑷子夾起來，而且胚性細(xì)胞多，可較長時(shí)期保持其分化能力，分化頻率高。小部分是嫩綠色松散型（圖2），一般都是從花藥開裂處長出，分化頻率較低。

2.1.1麥芽糖濃度對冬棗花藥愈傷誘導(dǎo)率的影響 將消毒后的花藥分別接種在Ms培養(yǎng)基上，附加2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+瓊脂4 g/L進(jìn)行試驗(yàn)，由表1可以看出，冬棗花藥膨大率和誘導(dǎo)率有顯著影響。沒有麥芽糖的培養(yǎng)基里，愈傷組織誘導(dǎo)率非常低，只有3.7%；愈傷誘導(dǎo)率隨著麥芽糖濃度的提高而升高，當(dāng)麥芽糖濃度達(dá)到20 g/L時(shí)，誘導(dǎo)率最高，為27.6%；當(dāng)濃度達(dá)到30g/L時(shí)，會抑制愈傷組織的誘導(dǎo)。20 g/L麥芽糖產(chǎn)生的愈傷組織較好，呈黃綠色或黃色、塊狀、質(zhì)地較硬、表面有顆粒狀突起。有利于形成胚性愈傷，當(dāng)麥芽糖濃度高于20 g/L時(shí)，絕大部分的愈傷組織容易發(fā)生褐化死亡。

2.1.2激素對冬棗花藥愈傷誘導(dǎo)率的影響 將消毒后的花藥分別接種在Ms培養(yǎng)基上，附加麥芽糖20 g/L+瓊脂4 g/L進(jìn)行不同濃度的激素組合試驗(yàn)，由表2可以看出，花藥膨大率與愈傷組織誘導(dǎo)率成正比關(guān)系，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的生長素和細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)頻率不一樣。單獨(dú)使用1種細(xì)胞分裂素6-BA很難誘導(dǎo)出愈傷組織，只有同時(shí)添加生長素2，4-D和細(xì)胞分裂素6-BA才有利于花藥愈傷組織的產(chǎn)生，在6-BA濃度一定的情況下，隨著2，4-D濃度的升高，愈傷組織誘導(dǎo)率升高，而當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/L后呈下降趨勢，且2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L培養(yǎng)基的愈傷誘導(dǎo)率最高，達(dá)37.2%。

2.1.3低溫預(yù)處理對冬棗花藥愈傷誘導(dǎo)率的影響 將冬棗的花蕾放人4℃冰箱中處理不同時(shí)間，將花藥接種在Ms+2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+麥芽糖20 g/L+瓊脂4 g/L培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，50 d后觀察低溫預(yù)處理對愈傷誘導(dǎo)率的影響，結(jié)果見表3。4℃低溫預(yù)處理對花藥的愈傷誘導(dǎo)有顯著影響，預(yù)處理3 d愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到46.6%，3 d后愈傷組織誘導(dǎo)率即顯著降低，且一直持續(xù)降低，由誘導(dǎo)后0 d的37.2%最終降為誘導(dǎo)后7 d的9.8%。

2.1.4高溫預(yù)處理對冬棗花藥愈傷誘導(dǎo)率的影響 將冬棗的花蕾放人35℃培養(yǎng)箱中處理不同時(shí)間，將花藥接種在Ms+2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+麥芽糖20 g/L+瓊脂4 g/L培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，50 d后觀察高溫預(yù)處理對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，結(jié)果見表4。高溫預(yù)處理花藥的愈傷誘導(dǎo)率顯著降低，由誘導(dǎo)后0 d的37.2%最終降為誘導(dǎo)后7 d的3.7%。

2.2繼代培養(yǎng)和分化培養(yǎng)

把直徑為0.5 mm左右的愈傷組織放人繼代培養(yǎng)基后（圖3、圖4）再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接2 d后愈傷組織體積慢慢增大，1周后愈傷組織局部變?yōu)榫G色（圖5），2周后開始出現(xiàn)綠色的芽點(diǎn)，進(jìn)一步分化成小幼苗。但大部分的愈傷組織多次分化后不能分化出小苗（圖6），開始衰敗，最后死亡（圖7、圖8）。

3結(jié)論與討論

在花藥培養(yǎng)中，糖是重要的碳源，主要功能是調(diào)節(jié)滲透壓。王娜等認(rèn)為，20 g/L麥芽糖對冬棗花藥培養(yǎng)效果最好，愈傷誘導(dǎo)率高達(dá)57.81%。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度的麥芽糖有利于愈傷誘導(dǎo)，但隨著麥芽糖濃度的增加，出愈率降低，愈傷組織生長量減少，這可能是增加培養(yǎng)中滲透壓的表現(xiàn)；激素的種類和濃度對愈傷組織的誘導(dǎo)非常重要，對大多數(shù)植物來說，如果不在基本培養(yǎng)基中添加激素，就不能誘導(dǎo)愈傷組織。一般細(xì)胞分裂素促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)的分裂，生長素促進(jìn)核的分裂（促進(jìn)DNA合成），在脫分化培養(yǎng)基中，兩者共同使用對誘導(dǎo)愈傷組織十分重要，由于植物種類的不同，基因型決定其細(xì)胞分裂素與生長素的種類和濃度均有很大差異。在本試驗(yàn)中，2，4-D 1.0 mg/L和6-BA 1.0 mg/L為最佳的激素組合，愈傷誘導(dǎo)率最高達(dá)37.2%。在棗的花藥培養(yǎng)過程中低溫預(yù)處理對啟動(dòng)雄核發(fā)育發(fā)揮了重要的作用，有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，這與武曉紅研究棗花藥培養(yǎng)中低溫預(yù)處理影響的結(jié)論一致。