不同基因型馬鈴薯的花藥培養(yǎng)研究

摘要：針對青海省馬鈴薯資源庫中的20個資源進行花藥培養(yǎng)研究，結(jié)果表明：不同基因型的馬鈴薯愈傷組織誘導(dǎo)率存在很大差異，其中，下寨65愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為25.1%；其次是青薯9號，為16.8%，紫云、紅云、冀張薯12號沒有誘導(dǎo)出愈傷組織；青薯2號、高原4號、青05-12-6的愈傷組織分別分化出再生植株，其余品種均未分化出再生植株。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；花藥培養(yǎng)；基因型

中圖分類號：S532.03文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0090-02

收稿日期：2014-05-22

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金（編號：CARS-10）；青海省科學(xué)技術(shù)廳資助項目（編號：2011-N-506）；青海省農(nóng)林科學(xué)院創(chuàng)新基金（編號：2010-NKY-05）

作者簡介：賀苗苗（1983—），女，碩士，助理研究員，主要從事馬鈴薯遺傳育種研究。Tel：（0971）5310129；E-mail：hemm0505@126.com。馬鈴薯育種存在遺傳基礎(chǔ)狹窄、品種間親緣關(guān)系近等問題。馬鈴薯花藥培養(yǎng)是產(chǎn)生單倍體的主要方法，在馬鈴薯育種、基礎(chǔ)遺傳學(xué)研究中具有重要意義。自然界中可利用的馬鈴薯野生種及近緣栽培種中大部分為二倍體，限制了野生馬鈴薯種質(zhì)中優(yōu)良基因的開發(fā)利用[1]。因此，通過誘導(dǎo)獲得馬鈴薯單倍體是馬鈴薯育種成功的關(guān)鍵[2-3]。我國馬鈴薯花藥培養(yǎng)研究始于20世紀80年代初期，戴朝曦等以馬鈴薯四倍體普通栽培種為材料，附加不同濃度及種類的植物生長調(diào)節(jié)劑，成功誘導(dǎo)了再生植株[4]。朱明凱等[5]、王蒂等[6]、冉毅東等[7-8]、賀苗苗[9-10]對馬鈴薯花藥培養(yǎng)中高溫前處理、培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度等因素進行了研究。梁彥濤等[11]、李鳳云等[12]發(fā)現(xiàn)馬鈴薯花藥培養(yǎng)對基因型依賴性很大。由于花藥培養(yǎng)受植物基因型、培養(yǎng)基、花藥發(fā)育時期、植物激素配比等多種因素的影響，花藥培養(yǎng)存在誘導(dǎo)頻率低、植株再生率低的問題，導(dǎo)致花藥培養(yǎng)很少應(yīng)用于育種實踐。本研究針對青海省馬鈴薯資源庫中的20個資源進行花藥培養(yǎng)研究，旨在為馬鈴薯育種提供較多的單倍體材料。

1材料與方法

1.1材料

青薯2號、高原4號、青05-12-6等20個馬鈴薯資源由青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

1.2方法

1.2.1資源種植、花藥采集將供試材料分別種植于青海省海東市樂都區(qū)、青海省西寧市湟源縣2個試驗點，海拔不同，開花期也不同。6月中旬至9月中旬都可以采集花藥。通常08：00—10：00采集花藥，將花藥置于冰壺中帶回實驗室，在40倍顯微鏡下觀察小孢子的育性、發(fā)育時期，取小孢子處于單核中后期的花蕾備用（圖1）。

1.2.2花藥預(yù)處理將花藥放在4 ℃冰箱中低溫預(yù)處理 24～48 h，接種后放在35 ℃高溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下熱激處理24～48 h，之后轉(zhuǎn)入22～25 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。

1.2.3消毒接種先用流水沖洗花蕾30 min，再用蒸餾水沖洗3次，轉(zhuǎn)入超凈工作臺用無菌水沖洗3次，再用75%乙醇滅菌30 s，0.1% HgCl2浸泡7～10 min，無菌水洗3～4次，置于已滅菌的培養(yǎng)皿上用鑷子剝開花蕾，取出花藥，去除花絲，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每皿接種25～30枚花藥。

1.2.4培養(yǎng)基配方誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+10 mg/L AgNO3+ 1 g/L 活性炭+30 g/L蔗糖+0.7%瓊脂，pH值為5.8。分化培養(yǎng)基：MS+2.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+1 g/L 活性炭+30 g/L蔗糖+0.7%瓊脂，pH值為5.8。

1.2.5培養(yǎng)條件接種后的花藥經(jīng)高溫?zé)崽幚砗螅D(zhuǎn)入 22～25 ℃ 培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，待誘導(dǎo)出愈傷組織或胚狀體后（約20 d），轉(zhuǎn)入光照條件下（日光燈光強為2 500 lx，光照 16 h/d、黑暗8 h/d ）溫度為22 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將愈傷組織或胚狀體轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，待分化成苗后，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中繼代繁殖。愈傷組織誘導(dǎo)率、再生植株分化率計算公式如下。

愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的花藥數(shù)/接種花藥數(shù)×100%；（1）

再生植株分化率=分化再生植株數(shù)/愈傷組織數(shù)×100%。（2）

2結(jié)果與分析

2.1不同基因型對馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

從表1可以看出，下寨65愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達251%（圖2），其次是青薯9號，為16.8%。紫云、紅云及冀張薯12號可能由于基因型及培養(yǎng)基不太適宜，始終沒有誘導(dǎo)出愈傷組織。

2.2基因型對花藥培養(yǎng)分化再生植株的影響

不同基因型花藥培養(yǎng)愈傷組織分化率差異很大，20份資源中，只有青薯2號、高原4號、青05-12-6分化出了再生植株，其余品種均未分化出再生植株。將下寨65愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上20 d后，一部分慢慢褐化，有根產(chǎn)生，且根生長健壯，隨著時間的推移，整個愈傷組織連同根逐步變褐，最后死亡。青薯9號（圖3）愈傷組織表面逐漸變綠、變硬、呈菜花狀，隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織不斷增大，經(jīng)過幾次繼代培養(yǎng)，更換不同的分化培養(yǎng)基，但是均沒有分化出根或芽。脫毒175愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基后迅速增大，但愈傷組織較松散，隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織不斷增大，最后變褐死亡。青薯2號愈傷組織在分化培養(yǎng)基上表面逐漸呈深綠色、變硬，分化出了再生植株，且植株健壯（圖4）。

表1不同基因型對花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

3結(jié)論與討論

馬鈴薯花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)的雙單倍體植株在馬鈴薯育種中發(fā)揮重要的作用，由于馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷組織的形成受多種因素限制，植物生長調(diào)節(jié)劑、接種密度、活性炭、熱激處理時間等因子都對愈傷率有影響。本研究表明，不同基因型馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)率、分化率存在很大差異，這與前人研究結(jié)果[11]一致，這可能是由于基因組內(nèi)存在著某種基因，該基因可調(diào)控小孢子的發(fā)育方向，也可能是因為不同基因型的花粉小孢子對離體培養(yǎng)的敏感度不同。相同基因型馬鈴薯種植區(qū)域及采集時間不同，愈傷組織誘導(dǎo)率也存在明顯的差異。因此，在馬鈴薯育種過程中，可根據(jù)育種目標先選定基因型，再根據(jù)不同的基因型篩選適宜的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基、添加物，以便獲得更多的單倍體植株。

參考文獻：

[1]呂文河，梁吉利. 馬鈴薯4x×2x雜種無性一代產(chǎn)量及產(chǎn)量性狀的表現(xiàn)[J]. 中國馬鈴薯，1997，11（3）：11-16.

[2]金黎平，屈冬玉，謝開云，等. 我國馬鈴薯種質(zhì)資源和育種技術(shù)研究進展[J]. 種子，2003（5）：98-100.

[3]李克萊. 馬鈴薯育種方法研究進展（一）[J]. 內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2000，31（3）：333-337.

[4]戴朝曦.用花藥培養(yǎng)法誘導(dǎo)馬鈴薯產(chǎn)生雙單倍體植株的研究[J]. 科學(xué)通報，1982，27（24）：1529-1532.

[5]朱明凱，程天慶，高湘玲，等. 早熟馬鈴薯四倍體栽培種花藥誘導(dǎo)成株[J]. 園藝學(xué)報，1985，12（3）：177-180，218.

[6]王蒂，冉毅東，戴朝曦. 馬鈴薯花藥培養(yǎng)中高溫前處理的作用及不同基因型的反應(yīng)[J]. 中國馬鈴薯，1990，4（3）：139-143.

[7]冉毅東，戴朝曦. 馬鈴薯花藥培養(yǎng)硝酸銀對誘導(dǎo)雙單倍體及一單倍體的效果[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，1993，2（4）：43-47.

[8]冉毅東，王蒂，戴朝曦. 提高馬鈴薯雙單倍體花藥培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體及再生植株頻率的研究[J]. 馬鈴薯雜志，1996，10（2）：74-78.

[9]賀苗苗. 溫度預(yù)處理對不同品種馬鈴薯花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（9）：32-33.

[10]賀苗苗. 培養(yǎng)基中添加硝酸銀對馬鈴薯花藥培養(yǎng)的影響[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，60（1）：21-23.

[11]梁彥濤，邸宏，盧翠華，等. 馬鈴薯花藥培養(yǎng)影響因素的研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，37（5）：604-609.

[12]李鳳云，盛萬民，田國奎，等. 不同基因型馬鈴薯的花藥培養(yǎng)[J]. 中國馬鈴薯，2008，22（3）：140-143. 符勇，周忠發(fā)，王昆，等. 基于貴州喀斯特高原山區(qū)的煙草種植適宜性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：92-95.

摘要：針對青海省馬鈴薯資源庫中的20個資源進行花藥培養(yǎng)研究，結(jié)果表明：不同基因型的馬鈴薯愈傷組織誘導(dǎo)率存在很大差異，其中，下寨65愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為25.1%；其次是青薯9號，為16.8%，紫云、紅云、冀張薯12號沒有誘導(dǎo)出愈傷組織；青薯2號、高原4號、青05-12-6的愈傷組織分別分化出再生植株，其余品種均未分化出再生植株。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；花藥培養(yǎng)；基因型

中圖分類號：S532.03文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0090-02

收稿日期：2014-05-22

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金（編號：CARS-10）；青海省科學(xué)技術(shù)廳資助項目（編號：2011-N-506）；青海省農(nóng)林科學(xué)院創(chuàng)新基金（編號：2010-NKY-05）

作者簡介：賀苗苗（1983—），女，碩士，助理研究員，主要從事馬鈴薯遺傳育種研究。Tel：（0971）5310129；E-mail：hemm0505@126.com。馬鈴薯育種存在遺傳基礎(chǔ)狹窄、品種間親緣關(guān)系近等問題。馬鈴薯花藥培養(yǎng)是產(chǎn)生單倍體的主要方法，在馬鈴薯育種、基礎(chǔ)遺傳學(xué)研究中具有重要意義。自然界中可利用的馬鈴薯野生種及近緣栽培種中大部分為二倍體，限制了野生馬鈴薯種質(zhì)中優(yōu)良基因的開發(fā)利用[1]。因此，通過誘導(dǎo)獲得馬鈴薯單倍體是馬鈴薯育種成功的關(guān)鍵[2-3]。我國馬鈴薯花藥培養(yǎng)研究始于20世紀80年代初期，戴朝曦等以馬鈴薯四倍體普通栽培種為材料，附加不同濃度及種類的植物生長調(diào)節(jié)劑，成功誘導(dǎo)了再生植株[4]。朱明凱等[5]、王蒂等[6]、冉毅東等[7-8]、賀苗苗[9-10]對馬鈴薯花藥培養(yǎng)中高溫前處理、培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度等因素進行了研究。梁彥濤等[11]、李鳳云等[12]發(fā)現(xiàn)馬鈴薯花藥培養(yǎng)對基因型依賴性很大。由于花藥培養(yǎng)受植物基因型、培養(yǎng)基、花藥發(fā)育時期、植物激素配比等多種因素的影響，花藥培養(yǎng)存在誘導(dǎo)頻率低、植株再生率低的問題，導(dǎo)致花藥培養(yǎng)很少應(yīng)用于育種實踐。本研究針對青海省馬鈴薯資源庫中的20個資源進行花藥培養(yǎng)研究，旨在為馬鈴薯育種提供較多的單倍體材料。

1材料與方法

1.1材料

青薯2號、高原4號、青05-12-6等20個馬鈴薯資源由青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

1.2方法

1.2.1資源種植、花藥采集將供試材料分別種植于青海省海東市樂都區(qū)、青海省西寧市湟源縣2個試驗點，海拔不同，開花期也不同。6月中旬至9月中旬都可以采集花藥。通常08：00—10：00采集花藥，將花藥置于冰壺中帶回實驗室，在40倍顯微鏡下觀察小孢子的育性、發(fā)育時期，取小孢子處于單核中后期的花蕾備用（圖1）。

1.2.2花藥預(yù)處理將花藥放在4 ℃冰箱中低溫預(yù)處理 24～48 h，接種后放在35 ℃高溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下熱激處理24～48 h，之后轉(zhuǎn)入22～25 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。

1.2.3消毒接種先用流水沖洗花蕾30 min，再用蒸餾水沖洗3次，轉(zhuǎn)入超凈工作臺用無菌水沖洗3次，再用75%乙醇滅菌30 s，0.1% HgCl2浸泡7～10 min，無菌水洗3～4次，置于已滅菌的培養(yǎng)皿上用鑷子剝開花蕾，取出花藥，去除花絲，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每皿接種25～30枚花藥。

1.2.4培養(yǎng)基配方誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+10 mg/L AgNO3+ 1 g/L 活性炭+30 g/L蔗糖+0.7%瓊脂，pH值為5.8。分化培養(yǎng)基：MS+2.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+1 g/L 活性炭+30 g/L蔗糖+0.7%瓊脂，pH值為5.8。

1.2.5培養(yǎng)條件接種后的花藥經(jīng)高溫?zé)崽幚砗?，轉(zhuǎn)入 22～25 ℃ 培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，待誘導(dǎo)出愈傷組織或胚狀體后（約20 d），轉(zhuǎn)入光照條件下（日光燈光強為2 500 lx，光照 16 h/d、黑暗8 h/d ）溫度為22 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將愈傷組織或胚狀體轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，待分化成苗后，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中繼代繁殖。愈傷組織誘導(dǎo)率、再生植株分化率計算公式如下。

愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的花藥數(shù)/接種花藥數(shù)×100%；（1）

再生植株分化率=分化再生植株數(shù)/愈傷組織數(shù)×100%。（2）

2結(jié)果與分析

2.1不同基因型對馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

從表1可以看出，下寨65愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達251%（圖2），其次是青薯9號，為16.8%。紫云、紅云及冀張薯12號可能由于基因型及培養(yǎng)基不太適宜，始終沒有誘導(dǎo)出愈傷組織。

2.2基因型對花藥培養(yǎng)分化再生植株的影響

不同基因型花藥培養(yǎng)愈傷組織分化率差異很大，20份資源中，只有青薯2號、高原4號、青05-12-6分化出了再生植株，其余品種均未分化出再生植株。將下寨65愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上20 d后，一部分慢慢褐化，有根產(chǎn)生，且根生長健壯，隨著時間的推移，整個愈傷組織連同根逐步變褐，最后死亡。青薯9號（圖3）愈傷組織表面逐漸變綠、變硬、呈菜花狀，隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織不斷增大，經(jīng)過幾次繼代培養(yǎng)，更換不同的分化培養(yǎng)基，但是均沒有分化出根或芽。脫毒175愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基后迅速增大，但愈傷組織較松散，隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織不斷增大，最后變褐死亡。青薯2號愈傷組織在分化培養(yǎng)基上表面逐漸呈深綠色、變硬，分化出了再生植株，且植株健壯（圖4）。

表1不同基因型對花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

3結(jié)論與討論

馬鈴薯花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)的雙單倍體植株在馬鈴薯育種中發(fā)揮重要的作用，由于馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷組織的形成受多種因素限制，植物生長調(diào)節(jié)劑、接種密度、活性炭、熱激處理時間等因子都對愈傷率有影響。本研究表明，不同基因型馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)率、分化率存在很大差異，這與前人研究結(jié)果[11]一致，這可能是由于基因組內(nèi)存在著某種基因，該基因可調(diào)控小孢子的發(fā)育方向，也可能是因為不同基因型的花粉小孢子對離體培養(yǎng)的敏感度不同。相同基因型馬鈴薯種植區(qū)域及采集時間不同，愈傷組織誘導(dǎo)率也存在明顯的差異。因此，在馬鈴薯育種過程中，可根據(jù)育種目標先選定基因型，再根據(jù)不同的基因型篩選適宜的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基、添加物，以便獲得更多的單倍體植株。

參考文獻：

[1]呂文河，梁吉利. 馬鈴薯4x×2x雜種無性一代產(chǎn)量及產(chǎn)量性狀的表現(xiàn)[J]. 中國馬鈴薯，1997，11（3）：11-16.

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[6]王蒂，冉毅東，戴朝曦. 馬鈴薯花藥培養(yǎng)中高溫前處理的作用及不同基因型的反應(yīng)[J]. 中國馬鈴薯，1990，4（3）：139-143.

[7]冉毅東，戴朝曦. 馬鈴薯花藥培養(yǎng)硝酸銀對誘導(dǎo)雙單倍體及一單倍體的效果[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，1993，2（4）：43-47.

[8]冉毅東，王蒂，戴朝曦. 提高馬鈴薯雙單倍體花藥培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體及再生植株頻率的研究[J]. 馬鈴薯雜志，1996，10（2）：74-78.

[9]賀苗苗. 溫度預(yù)處理對不同品種馬鈴薯花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（9）：32-33.

[10]賀苗苗. 培養(yǎng)基中添加硝酸銀對馬鈴薯花藥培養(yǎng)的影響[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，60（1）：21-23.

[11]梁彥濤，邸宏，盧翠華，等. 馬鈴薯花藥培養(yǎng)影響因素的研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，37（5）：604-609.

[12]李鳳云，盛萬民，田國奎，等. 不同基因型馬鈴薯的花藥培養(yǎng)[J]. 中國馬鈴薯，2008，22（3）：140-143. 符勇，周忠發(fā)，王昆，等. 基于貴州喀斯特高原山區(qū)的煙草種植適宜性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：92-95.

摘要：針對青海省馬鈴薯資源庫中的20個資源進行花藥培養(yǎng)研究，結(jié)果表明：不同基因型的馬鈴薯愈傷組織誘導(dǎo)率存在很大差異，其中，下寨65愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為25.1%；其次是青薯9號，為16.8%，紫云、紅云、冀張薯12號沒有誘導(dǎo)出愈傷組織；青薯2號、高原4號、青05-12-6的愈傷組織分別分化出再生植株，其余品種均未分化出再生植株。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；花藥培養(yǎng)；基因型

中圖分類號：S532.03文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0090-02

收稿日期：2014-05-22

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金（編號：CARS-10）；青海省科學(xué)技術(shù)廳資助項目（編號：2011-N-506）；青海省農(nóng)林科學(xué)院創(chuàng)新基金（編號：2010-NKY-05）

作者簡介：賀苗苗（1983—），女，碩士，助理研究員，主要從事馬鈴薯遺傳育種研究。Tel：（0971）5310129；E-mail：hemm0505@126.com。馬鈴薯育種存在遺傳基礎(chǔ)狹窄、品種間親緣關(guān)系近等問題。馬鈴薯花藥培養(yǎng)是產(chǎn)生單倍體的主要方法，在馬鈴薯育種、基礎(chǔ)遺傳學(xué)研究中具有重要意義。自然界中可利用的馬鈴薯野生種及近緣栽培種中大部分為二倍體，限制了野生馬鈴薯種質(zhì)中優(yōu)良基因的開發(fā)利用[1]。因此，通過誘導(dǎo)獲得馬鈴薯單倍體是馬鈴薯育種成功的關(guān)鍵[2-3]。我國馬鈴薯花藥培養(yǎng)研究始于20世紀80年代初期，戴朝曦等以馬鈴薯四倍體普通栽培種為材料，附加不同濃度及種類的植物生長調(diào)節(jié)劑，成功誘導(dǎo)了再生植株[4]。朱明凱等[5]、王蒂等[6]、冉毅東等[7-8]、賀苗苗[9-10]對馬鈴薯花藥培養(yǎng)中高溫前處理、培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度等因素進行了研究。梁彥濤等[11]、李鳳云等[12]發(fā)現(xiàn)馬鈴薯花藥培養(yǎng)對基因型依賴性很大。由于花藥培養(yǎng)受植物基因型、培養(yǎng)基、花藥發(fā)育時期、植物激素配比等多種因素的影響，花藥培養(yǎng)存在誘導(dǎo)頻率低、植株再生率低的問題，導(dǎo)致花藥培養(yǎng)很少應(yīng)用于育種實踐。本研究針對青海省馬鈴薯資源庫中的20個資源進行花藥培養(yǎng)研究，旨在為馬鈴薯育種提供較多的單倍體材料。

1材料與方法

1.1材料

青薯2號、高原4號、青05-12-6等20個馬鈴薯資源由青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

1.2方法

1.2.1資源種植、花藥采集將供試材料分別種植于青海省海東市樂都區(qū)、青海省西寧市湟源縣2個試驗點，海拔不同，開花期也不同。6月中旬至9月中旬都可以采集花藥。通常08：00—10：00采集花藥，將花藥置于冰壺中帶回實驗室，在40倍顯微鏡下觀察小孢子的育性、發(fā)育時期，取小孢子處于單核中后期的花蕾備用（圖1）。

1.2.2花藥預(yù)處理將花藥放在4 ℃冰箱中低溫預(yù)處理 24～48 h，接種后放在35 ℃高溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下熱激處理24～48 h，之后轉(zhuǎn)入22～25 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。

1.2.3消毒接種先用流水沖洗花蕾30 min，再用蒸餾水沖洗3次，轉(zhuǎn)入超凈工作臺用無菌水沖洗3次，再用75%乙醇滅菌30 s，0.1% HgCl2浸泡7～10 min，無菌水洗3～4次，置于已滅菌的培養(yǎng)皿上用鑷子剝開花蕾，取出花藥，去除花絲，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每皿接種25～30枚花藥。

1.2.4培養(yǎng)基配方誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+10 mg/L AgNO3+ 1 g/L 活性炭+30 g/L蔗糖+0.7%瓊脂，pH值為5.8。分化培養(yǎng)基：MS+2.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+1 g/L 活性炭+30 g/L蔗糖+0.7%瓊脂，pH值為5.8。

1.2.5培養(yǎng)條件接種后的花藥經(jīng)高溫?zé)崽幚砗螅D(zhuǎn)入 22～25 ℃ 培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，待誘導(dǎo)出愈傷組織或胚狀體后（約20 d），轉(zhuǎn)入光照條件下（日光燈光強為2 500 lx，光照 16 h/d、黑暗8 h/d ）溫度為22 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將愈傷組織或胚狀體轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，待分化成苗后，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中繼代繁殖。愈傷組織誘導(dǎo)率、再生植株分化率計算公式如下。

愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的花藥數(shù)/接種花藥數(shù)×100%；（1）

再生植株分化率=分化再生植株數(shù)/愈傷組織數(shù)×100%。（2）

2結(jié)果與分析

2.1不同基因型對馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

從表1可以看出，下寨65愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達251%（圖2），其次是青薯9號，為16.8%。紫云、紅云及冀張薯12號可能由于基因型及培養(yǎng)基不太適宜，始終沒有誘導(dǎo)出愈傷組織。

2.2基因型對花藥培養(yǎng)分化再生植株的影響

不同基因型花藥培養(yǎng)愈傷組織分化率差異很大，20份資源中，只有青薯2號、高原4號、青05-12-6分化出了再生植株，其余品種均未分化出再生植株。將下寨65愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上20 d后，一部分慢慢褐化，有根產(chǎn)生，且根生長健壯，隨著時間的推移，整個愈傷組織連同根逐步變褐，最后死亡。青薯9號（圖3）愈傷組織表面逐漸變綠、變硬、呈菜花狀，隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織不斷增大，經(jīng)過幾次繼代培養(yǎng)，更換不同的分化培養(yǎng)基，但是均沒有分化出根或芽。脫毒175愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基后迅速增大，但愈傷組織較松散，隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織不斷增大，最后變褐死亡。青薯2號愈傷組織在分化培養(yǎng)基上表面逐漸呈深綠色、變硬，分化出了再生植株，且植株健壯（圖4）。

表1不同基因型對花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

3結(jié)論與討論

馬鈴薯花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)的雙單倍體植株在馬鈴薯育種中發(fā)揮重要的作用，由于馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷組織的形成受多種因素限制，植物生長調(diào)節(jié)劑、接種密度、活性炭、熱激處理時間等因子都對愈傷率有影響。本研究表明，不同基因型馬鈴薯花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)率、分化率存在很大差異，這與前人研究結(jié)果[11]一致，這可能是由于基因組內(nèi)存在著某種基因，該基因可調(diào)控小孢子的發(fā)育方向，也可能是因為不同基因型的花粉小孢子對離體培養(yǎng)的敏感度不同。相同基因型馬鈴薯種植區(qū)域及采集時間不同，愈傷組織誘導(dǎo)率也存在明顯的差異。因此，在馬鈴薯育種過程中，可根據(jù)育種目標先選定基因型，再根據(jù)不同的基因型篩選適宜的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基、添加物，以便獲得更多的單倍體植株。

參考文獻：

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