基于核酸適配子的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測研究進(jìn)展*

周建明 王 婷 張焜和

·國家基金研究進(jìn)展綜述·

基于核酸適配子的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測研究進(jìn)展*

周建明 王 婷 張焜和

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）是從腫瘤病灶脫落后進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，在腫瘤的微轉(zhuǎn)移檢測、病情評估、療效及預(yù)后評判等方面具有重要價值，但因其在血液中數(shù)量極少，難以檢測，臨床應(yīng)用進(jìn)展緩慢。近年來，隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，CTC的富集及檢測新方法不斷進(jìn)步，其中基于核酸適配子的富集及檢測方法不但能快速高效捕獲和無損釋放CTC，還能定性、定量分析CTC，甚至能檢測出血液中的單個CTC和不同亞群的腫瘤細(xì)胞，具有良好的應(yīng)用前景。

適配子循環(huán)腫瘤細(xì)胞無損捕獲高效檢測可視分析

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）是從腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶中脫落并進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。CTC檢測在腫瘤的微轉(zhuǎn)移發(fā)現(xiàn)、病情評估、個體化治療及術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測等方面具有重要價值。CTC在外周血中含量稀少，106～107個有核細(xì)胞中僅有1個［1］。近年來隨著生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，CTC的富集及檢測技術(shù)不斷進(jìn)步，其中基于抗體的CTC檢測已較成熟，同時抗體聯(lián)合納米材料、微流體裝置等檢測新技術(shù)不斷發(fā)展。核酸適配子（簡稱適配子）是生物分子的人工單鏈寡核苷酸配體，通過體外篩選獲得，以構(gòu)象適配機(jī)制與靶分子高特異性、高親和力結(jié)合，相較于抗體具有獨(dú)特優(yōu)勢。基于適配子的CTC捕獲與分析顯示出良好的應(yīng)用前景，本文就這一領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 適配子及其分子識別特性

適配子是長度為25～80個堿基的單鏈寡核苷酸。1990年，建立指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)，通過該項技術(shù)，可在人工合成的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫中篩選、擴(kuò)增和富集能與靶分子高特異性、高親和力結(jié)合的特定核酸序列，即適配子［2-3］。

單鏈寡核苷酸可自然形成發(fā)夾（hairpin）、凸環(huán)（bulge）、假結(jié)（pseudoknot）、G-四分體（G-quartet）等二級結(jié)構(gòu)，從而使適配子具有特定的分子構(gòu)象。當(dāng)適配子與生物分子的分子構(gòu)象相互匹配形成“鎖鑰”關(guān)系時，即可特異性識別靶分子，并通過分子之間的作用力而結(jié)合靶分子，其親和力能達(dá)到納摩爾甚至皮摩爾水平。

適配子與靶分子的特異性結(jié)合類似于抗體與抗原的結(jié)合，但與抗體相比，適配子具有如下優(yōu)勢：1）適配子的靶分子比抗體范圍廣，小分子如腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、毒性分子均可作為靶標(biāo)篩選相應(yīng)的適配子；2）適配子為核酸分子，具有熱穩(wěn)定性、可人工合成、易于修飾改造、無免疫原性、可通過PCR擴(kuò)增、可被核酸酶降解等優(yōu)點(diǎn)。

2 基于適配子的CTC捕獲與分析

2.1 適配子可捕獲并無損釋放CTC

適配子不僅能識別蛋白質(zhì)等生物分子，也能通過細(xì)胞表面分子特異性識別細(xì)胞［4-5］。將適配子與磁珠偶聯(lián)，通過磁選分離可從血細(xì)胞中分離出相應(yīng)的靶細(xì)胞，聯(lián)合表面增強(qiáng)拉曼光譜顯像技術(shù)，可對靶細(xì)胞進(jìn)行富集、分離和檢測，且具有簡便、快速的優(yōu)點(diǎn)［6］。但其捕獲率在緩沖液和血樣中分別為73%、55%，尚有提升的空間。

將捕獲到的CTC無損釋放有利于后續(xù)進(jìn)行細(xì)胞表型及功能分析，對惡性腫瘤的診斷及個體化治療有重要價值。利用適配子的互補(bǔ)序列，將適配子的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，使捕獲到的靶細(xì)胞脫落，可實現(xiàn)適配子與靶細(xì)胞的無損分離［7］，其不足之處是其釋放率不高。Li等［8］通過修飾有特異性適配子的水凝膠捕獲靶細(xì)胞后，利用限制性內(nèi)切酶BamH I切割特定的位點(diǎn)，使靶細(xì)胞釋放，釋放率可達(dá)到99%，細(xì)胞活力可達(dá)到98%。

2.2 應(yīng)用適配子直接檢測CTC

基于抗原-抗體特異結(jié)合的CTC檢測，必須了解腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物后才能應(yīng)用相應(yīng)的抗體進(jìn)行檢測，以適配子代替抗體可以彌補(bǔ)這一缺陷。以腫瘤細(xì)胞為靶標(biāo)直接進(jìn)行SELEX篩選，在不了解腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物的情況下也能篩到特異性適配子用于CTC捕獲。Zhang等［9］篩選到適配子BC15用于捕獲外周血中的胰腺癌細(xì)胞，與抗細(xì)胞角蛋白抗體的捕獲結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（陽性率73%vs. 80%），具有顯著相關(guān)性（r=0.810）。Zamay等［10］篩選到的適配子LC18捕獲外周血中的肺癌細(xì)胞，敏感性為86%，特異性為76%。

2.3 適配子聯(lián)合納米材料可高效檢測CTC

納米粒子具有小尺寸效應(yīng)、高比表面積等諸多優(yōu)點(diǎn)，使之能夠用于檢測CTC［11］。Wan等［12］設(shè)計的具有納米紋理的聚二甲硅氧烷基板，由于納米紋理增加了基板表面的粗糙程度，有利于適配子與靶細(xì)胞的特異結(jié)合，捕獲效率增強(qiáng)了約5.5倍。也有研究通過引入表面粗糙程度不同的金納米層，發(fā)現(xiàn)對靶細(xì)胞的捕獲效率比對照組高19倍［13］。這類方法在增加受檢樣品停留時間的同時，也增加了適配子與非特異性細(xì)胞接觸的機(jī)會，捕獲的特異性有所下降。

適配子本身帶有一定的負(fù)電荷，如果反應(yīng)表面引入的適配子數(shù)量越多，所產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)也越大，真正發(fā)揮有效作用的適配子反而減少。一些高分子化合物，如POEGMA［13］、樹狀分子［14］，由于有很多的分支結(jié)構(gòu)，適配子可以通過羥基或酰胺基結(jié)合到這些分支的末端，通過這些“連接器”的作用，納米材料所能固化的適配子數(shù)量將擴(kuò)展成一個立體的空間結(jié)構(gòu)，極大增加了檢測能力。

2.4 適配子聯(lián)合微流體裝置可快速檢測CTC

以適配子構(gòu)建適配子微流體裝置，特別是將不同適配子固化于同一微流體，可以達(dá)到對不同類型靶細(xì)胞的特異性捕獲，不論是敏感性還是捕獲靶細(xì)胞的純度都與傳統(tǒng)的抗體微流體無顯著性差異［15］。

許多研究致力于優(yōu)化適配子聯(lián)合微流體裝置對靶細(xì)胞的捕獲，包括速率的精準(zhǔn)控制［16］、裝置結(jié)構(gòu)的優(yōu)化［17］、空間位阻效應(yīng)的減輕等。Sheng等［17］通過引入金納米粒子增加固化的適配子數(shù)量，并用聚乙二醇對適配子進(jìn)行修飾以減少空間位阻效應(yīng)，將S形通道改裝成納米級別的“人”字形凹槽以增加血樣與適配子接觸的時間。發(fā)現(xiàn)以1.5 μL/s的速率通過時，捕獲效率可達(dá)到93%，而用已知的蛋白酪氨酸激酶抗體進(jìn)行對照，捕獲率不足80%；值得注意的是，利用此裝置聯(lián)合適配子對7.5 mL血液標(biāo)本進(jìn)行檢測，只需42 min就可完成，相對于CellSearch系統(tǒng)需要3～4 h，極大縮短了檢測時間［18］。由于適配子與血液標(biāo)本接觸的時間決定了該方法的特異性及檢測效率，故需要精準(zhǔn)的速率控制裝置，增加了制作難度及成本。

2.5 適配子聯(lián)合熒光標(biāo)記技術(shù)對CTC的可視性分析

由于熒光能更直觀、形象地觀察，在眾多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。Zeng等［19］在適配子的5'端和3'端分別連接熒光物質(zhì)和淬滅劑，當(dāng)適配子與靶細(xì)胞結(jié)合并被靶細(xì)胞內(nèi)化，溶酶體核酸酶將適配子降解，熒光基團(tuán)和淬滅劑分離，發(fā)出熒光，從而可視性檢測到CTC。該項技術(shù)簡單、方便，而且檢測的細(xì)胞仍保持一定的活力，可進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定和功能分析等后續(xù)研究。不僅熒光，化學(xué)發(fā)光法也可用于檢測CTC。Bi等［20］采用雙適配子識別靶細(xì)胞，以魯米諾-過氧化氫-對碘苯酚發(fā)光系統(tǒng)放大信號，可直觀地觀察到靶細(xì)胞，不僅可定性還可定量分析檢測到的腫瘤細(xì)胞。2.6適配子聯(lián)合電化學(xué)方法可突破單個CTC的檢測

近年來，基于適配子的電化學(xué)方法檢測腫瘤細(xì)胞被廣泛研究。Qu等［21］通過酰胺結(jié)合將兩個肝癌特異適配子TLS1c和TLS11a引入到玻璃碳電極上，兩個適配子分別通過單鏈和雙鏈的核酸“連接器”與玻璃碳電極相連，其中單鏈連接的適配子具有更大的自由度，使得整個裝置在特異性和敏感性上都有很大提高，能在109個血細(xì)胞中檢測到單個腫瘤細(xì)胞。Wang等［22］使用涂有二氧化硅層的微電極，其上面固化有表皮生長因子受體的適配子，待檢樣品通過時，通過測量捕獲靶細(xì)胞后電壓及電阻的變化實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的計數(shù)。適配子聯(lián)合電化學(xué)方法檢測CTC技術(shù)已突顯出其敏感性優(yōu)勢，但需要優(yōu)化檢測背景值及減少空間位阻效應(yīng)才能發(fā)揮最佳檢測效果。

2.7 多種適配子聯(lián)合應(yīng)用可實現(xiàn)CTC的亞型分析

氧化石墨烯是在石墨烯的基礎(chǔ)上引入氧官能基團(tuán)，使之不僅保留了石墨烯的層狀結(jié)構(gòu)，還表現(xiàn)出了膠體、薄膜以及兩性分子等諸多石墨烯沒有的特性［23］。Viraka等［24］在多微孔的氧化石墨烯膜上固化不同的適配子，能捕獲不同類型的靶細(xì)胞，捕獲率可達(dá)到95%；聯(lián)合多重?zé)晒怙@像技術(shù)可對捕獲的靶細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)分析。但該方法對適配子的特異性要求較高，且適配子之間是否會形成新的二級結(jié)構(gòu)尚不明確。Zhao等［25］利用細(xì)胞SELEX技術(shù)篩選到一些與非小細(xì)胞肺癌特異結(jié)合的適配子，利用適配子之間的協(xié)同效應(yīng)，可加強(qiáng)適配子對血液中的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞部分亞型的捕獲，明顯優(yōu)于利用抗體對CTC的檢測。Labib等［26］創(chuàng)新性地利用適配子及反義核酸介導(dǎo)的二維分離法根據(jù)細(xì)胞表面抗原表達(dá)量的不同而分離出多種亞型，并證明了各種亞型具有不同的性能，為CTC的亞型精準(zhǔn)分析提供了有效的方法。

3 結(jié)語

CTC檢測對腫瘤的診斷、病情評估、預(yù)后及個體化治療都有著重要的作用。適配子作為一種具有獨(dú)特優(yōu)勢的“化學(xué)抗體”，在醫(yī)學(xué)檢測具有良好的應(yīng)用前景。基于適配子的CTC檢測技術(shù)具有良好的特異性及敏感性，使之成為更有效的CTC檢測方法?；谶m配子的檢測工具可重復(fù)使用［27］，較傳統(tǒng)抗體節(jié)省了成本。同時由于適配子精準(zhǔn)的識別能力，可以區(qū)分細(xì)胞亞型，若能篩選出特異性較好的適配子，有助于解決腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性的檢測問題，更有利于癌癥的個體化治療。生物醫(yī)學(xué)、材料學(xué)等多學(xué)科的參與可更有效地發(fā)揮適配子的作用，特別是納米技術(shù)及微流體技術(shù)的引入，對實現(xiàn)更快、更簡單、更經(jīng)濟(jì)的CTC檢測起到了重要的推動作用?；谶m配子的CTC捕獲作為一項新技術(shù)，尚處于研究階段，在捕獲效率等方面存在一些不足，通過篩選性能良好的適配子、優(yōu)化捕獲過程和捕獲條件等將有助于克服這些缺陷。

[1]Sakurai F,Narii N,Tomita K,et al.Efficient detection of human cir‐culating tumor cells without significant production of false‐positive cells by a novel conditionally replicating adenovirus[J].Mol Ther Methods Clin Dev,2016,3:16001.

[2]Tuerk C,Gold L.Systematic evolution of ligands by exponential en‐richment:RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase[J].Sci‐ence,1990,249(4968):505‐510.

[3]Ellington AD,Szostak JW.In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands[J].Nature,1990,346(6287):818‐822.

[4]Li J,Lei P,Ding S,et al.An enzyme‐free surface plasmon resonance biosensor for real‐time detecting microRNA based on allosteric ef‐fect of mismatched catalytic hairpin assembly[J].Biosens Bioelec‐tron,2016,77:435‐441.

[5]Taghdisi SM,Danesh NM,Ramezani M,et al.A novel electrochemi‐cal aptasensor based on Y‐shape structure of dual‐aptamer‐com‐plementary strand conjugate for ultrasensitive detection of myoglo‐bin[J].Biosens Bioelectron,2016,80:532‐537.

[6]Sun C,Zhang R,Gao M,et al.A rapid and simple method for effi‐cient capture and accurate discrimination of circulating tumor cells using aptamer conjugated magnetic beads and surface‐enhanced Raman scattering imaging[J].Anal Bioanal Chem,2015,407(29): 8883‐8892.

[7]Wan Y,Liu Y,Allen PB,et al.Capture,isolation and release of can‐cer cells with aptamer‐functionalized glass bead array[J].Lab Chip, 2012,12(22):4693‐4701.

[8]Li S,Chen N,Zhang Z,et al.Endonuclease‐responsive aptamer‐functionalized hydrogel coating for sequential catch and release of cancer cells[J].Biomaterials,2013,34(2):460‐469.

[9]Zhang J,Li S,Liu F,et al.SELEX aptamer used as a probe to detect circulating tumor cells in peripheral blood of pancreatic cancer pa‐tients[J].PLoS One,2015,10(3):e0121920.

[10]Zamay GS,Kolovskaya OS,Zamay TN,et al.Aptamers selected to postoperative lung adenocarcinoma detect circulating tumor cells in human blood[J].Mol Ther,2015,23(9):1486‐1496.

[11]Bai LL,Yang YL,Wang C.Nanotechnology of circulating tumor cell enrichment and detection[J].Progr Biochem Biophysics,2013,40 (10):955‐962.[白林靈,楊延蓮,王琛.循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集和檢測的納米技術(shù)[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2013,40(10):955‐962.]

[12]Wan Y,Mahmood MA,Li N,et al.Nanotextured substrates with im‐mobilized aptamers for cancer cell isolation and cytology[J].Can‐cer,2012,118(4):1145‐1154.

[13]Wang Y,Zhou F,Liu X,et al.Aptamer‐modified micro/nanostruc‐tured surfaces:efficient capture of Ramos cells in serum environ‐ment[J].ACS Appl Mater Interfaces,2013,5(9):3816‐3823.

[14]Zheng F,Cheng Y,Wang J,et al.Aptamer‐functionalized barcode particles for the capture and detection of multiple types of circulat‐ing tumor cells[J].Adv Mater,2014,26(43):7333‐7338.

[15]Xu Y,Phillips JA,Yan J,et al.Aptamer‐based microfluidic device for enrichment,sorting,and detection of multiple cancer cells[J].Anal Chem,2009,81(17):7436‐7442.

[16]Wan Y,Tan J,Asghar W,et al.Velocity effect on aptamer‐based cir‐culating tumor cell isolation in microfluidic devices[J].J Phys Chem B,2011,115(47):13891‐13896.

[17]Sheng W,Chen T,Tan W,et al.Multivalent DNA nanospheres for en‐hanced capture of cancer cells in microfluidic devices[J].ACS Nano, 2013,7(8):7067‐7076.

[18]Liu XQ,Liu WJ,Liu Y.Advances in detection of circulating tumorcells and molecular markers by CellSearch system[J].Chin Clin On‐col,2012,17(2):182‐186.[劉曉晴,劉文靜,劉毅.CellSearch系統(tǒng)檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞及其分子標(biāo)記的研究進(jìn)展[J].臨床腫瘤學(xué)雜志, 2012,17(2):182‐186.]

[19]Zeng Z,Tung CH,Zu Y.A cancer cell‐activatable aptamer‐reporter system for one‐step assay of circulating tumor cells[J].Mol Ther Nucleic Acids,2014,3:e184.

[20]Bi S,Ji B,Zhang Z,et al.A chemiluminescence imaging array for the detection of cancer cells by dual‐aptamer recognition and bio‐bar‐code nanoprobe‐based rolling circle amplification[J].Chem Com‐mun(Camb),2013,49(33):3452‐3454.

[21]Qu L,Xu J,Tan X,et al.Dual‐aptamer modification generates a unique interface for highly sensitive and specific electrochemical detection of tumor cells[J].ACS Appl Mater Interfaces,2014,6(10): 7309‐7315.

[22]Wang L,Zheng Q,Zhang Q,et al.Detection of single tumor cell re‐sistance with aptamer biochip[J].Oncol Lett,2012,4(5):935‐940.

[23]Hu B,Lin YF,Liu YY,et al.Application progress of graphene oxide and aptamer in detection[J].Chin Biological Pharms,2015,35(8): 186‐188.[胡波,林彥鋒,劉宇洋,等.氧化石墨烯與核酸適配體在檢測方面應(yīng)用的進(jìn)展[J].中國生化藥物雜志,2015,35(8):186‐188.]

[24]Viraka Nellore BP,Kanchanapally R,Pramanik A,et al.Aptamer‐con‐ jugated graphene oxide membranes for highly efficient capture and accurate identification of multiple types of circulating tumor cells[J].Bioconjug Chem,2015,26(2):235‐242.

[25]Zhao L,Tang C,Xu L,et al.Enhanced and differential capture of cir‐culating tumor cells from lung cancer patients by microfluidic as‐says using aptamer cocktail[J].Small,2016,12(8):1072‐1081.

[26]Labib M,Green B,Mohamadi RM,et al.Aptamer and antisense‐me‐diated two‐dimensional isolation of specific cancer cell subpopula‐tions[J].J Am Chem Soc,2016,138(8):2476‐2479.

[27]Shen H,Yang J,Chen Z,et al.A novel label‐free and reusable elec‐trochemical cytosensor for highly sensitive detection and specific collection of CTCs[J].Biosens Bioelectron,2016,81:495‐502.

（2016‐08‐05收稿）

（2017‐04‐01修回）

（編輯：武斌校對：鄭莉）

Advancement of aptamer-based detection for circulating tumor cells

Jianming ZHOU,Ting WANG,Kunhe ZHANG

Kunhe ZHANG;E‐mail:yfyzkh@sina.com

Department of Gastroenterology,The First Affiliated Hospital of Nanchang University Jiangxi Institute for Digestive Diseases,Nanchang 330006,China

Circulating tumor cells(CTCs)are cancer cells shed from tumor into blood circulation.These cells are valuable in micrometa‐static detection,disease assessment,and therapy and prognosis prediction of tumors.However,the clinical application of CTCs pro‐gresses slowly due to its rarity in the blood and difficulty for detection.Given the development of biological techniques,scholars have developed several new methods for enrichment and detection of CTCs.Aptamer‐based method shows a good prospect in CTC applica‐tion.In this method,CTCs can be rapidly and efficiently captured,nondestructively released,and qualitatively and quantitatively ana‐lyzed.This method can also be used to detect single and sub‐groups of CTCs.

aptamer,circulating tumor cell,nondestructive capture,efficient detection,visible analysis

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.08.918

周建明專業(yè)方向為消化道腫瘤的分子診斷。E-mail：zjmlml666@163.com

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西省消化疾病研究所（南昌市330006）

*本文課題受國家自然科學(xué)基金項目（編號：81560479）、江西省科技支撐計劃（編號：20133BBG70025）和江西省教育廳科技落地計劃（編號：KJLD13014）資助

張焜和yfyzkh@sina.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81560479),the Science and Technology Pillar Pro‐gram of Jiangxi Province(No.20133BBG70025),and the Science and Technology Landing Program of the Department of Education of Jiangxi Province(No.KJLD13014)