團(tuán)頭魴MSTN 基因cDNA 結(jié)構(gòu)、表達(dá)及過表達(dá)對(duì)胚胎發(fā)育的影響

杜尚可 沈睿杰 陳 杰 蔣霞云 鄒曙明

(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

團(tuán)頭魴MSTN 基因cDNA 結(jié)構(gòu)、表達(dá)及過表達(dá)對(duì)胚胎發(fā)育的影響

杜尚可 沈睿杰 陳 杰 蔣霞云 鄒曙明

(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

研究通過cDNA末端快速擴(kuò)增法(RACE)克隆得到團(tuán)頭魴生長(zhǎng)抑制素(MSTN)基因的cDNA全長(zhǎng)并分析了MSTN基因在團(tuán)頭魴胚胎、成魚組織中表達(dá)以及MSTN基因在胚胎中過表達(dá)情況。結(jié)果表明團(tuán)頭魴MSTN基因的cDNA全長(zhǎng)為2187 bp, ORF(開放閱讀框)大小為1128 bp, 編碼376個(gè)氨基酸。組織逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)結(jié)果顯示, MSTN基因在肌肉、腦和精巢組織中大量表達(dá), 肝臟、脾臟和卵巢組織中的少量表達(dá), 腸、腮、心、眼和腎組織中的微量表達(dá)。胚胎逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)結(jié)果顯示, 在0—44 hpf胚胎發(fā)育階段, MSTN基因表達(dá)量較低; 而在48—52 hpf胚胎發(fā)育階段, MSTN基因表達(dá)量逐漸升高。整胚原位雜交(WISH)結(jié)果顯示, 胚胎發(fā)育的16 hpf時(shí)期MSTN基因主要在脊索中表達(dá), 胚胎發(fā)育的28 hpf和55 hpf時(shí)期MSTN基因在腦中表達(dá)。MSTN基因過表達(dá)結(jié)果顯示, 胚胎在體節(jié)發(fā)生期出現(xiàn)前-后軸拉長(zhǎng), 背-腹軸變短; 脊索發(fā)生扭曲, 強(qiáng)烈抑制體節(jié)發(fā)育而導(dǎo)致不分化等現(xiàn)象。研究為后續(xù)團(tuán)頭魴MSTN基因的功能研究及團(tuán)頭魴分子育種提供相關(guān)參考依據(jù)。

MSTN基因; 團(tuán)頭魴; 原位雜交; 過表達(dá)

肌肉生長(zhǎng)抑制素(Myostatin, MSTN), 又稱GDF8 (Growth differentiation factor 8, 生長(zhǎng)分化因子 8),屬于TGF-β (Transforming growth factor β, 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β)家族的成員[1]。該基因抑制骨骼肌的生長(zhǎng)、發(fā)育。1997年, MSTN首次在小鼠中被發(fā)現(xiàn), 之后鳥類[2]和牛、豬等哺乳動(dòng)物中[3,4]也克隆得到了該基因。截止目前為止, 魚類中斑馬魚[5]、刀鱭[6]、牙鲆[7]、草魚[8]等十多個(gè)物種的MSTN基因已被克隆[9—12]。但關(guān)于團(tuán)頭魴MSTN基因功能、表達(dá)的研究卻鮮有報(bào)道。

蛋白酶酶切MSTN前體蛋白, 形成N端前肽和C端活性成熟肽, 酶切之后的N端前肽與C端活性成熟肽仍以非共價(jià)結(jié)合方式存在[13]。有研究表明, MSTN前肽不僅對(duì)MSTN成熟肽二聚體的準(zhǔn)確形成有重要的作用, 還能夠通過與成熟肽結(jié)合, 抑制MSTN基因與其受體結(jié)合, 阻斷MSTN基因功能[14]。MSTN成熟肽二聚體與受體結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)Smad2/ 3蛋白磷酸化, 并與Smad4蛋白形成復(fù)合體, 再與靶基因的DNA調(diào)控序列結(jié)合, 進(jìn)而促進(jìn)或抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[15]。利用轉(zhuǎn)基因[16]、Morpholino[17]或RNAi[18]等技術(shù), 已證實(shí)MSTN的突變或轉(zhuǎn)錄表達(dá)降低能促進(jìn)斑馬魚肌肉的生長(zhǎng)和發(fā)育。

團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)草食性, 從20世紀(jì)60年代開始, 團(tuán)頭魴就作為我國重要的淡水養(yǎng)殖種類[19], 2014年的總產(chǎn)量達(dá)7.8×108kg[20]。本研究克隆得到團(tuán)頭魴MSTN基因全長(zhǎng)cDNA的序列,并采用RT-PCR研究分析MSTN mRNA在組織、胚胎中的表達(dá)情況; 采用整胚原位雜交(WISH)方法研究MSTN mRNA在胚胎中的空間分布、表達(dá)情況; MSTN mRNA過表達(dá)對(duì)團(tuán)頭魴胚胎發(fā)育的影響通過胚胎顯微注射的方法來研究。本研究可為團(tuán)頭魴MSTN基因的功能研究及團(tuán)頭魴分子育種提供相關(guān)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚、胚胎

本研究所需的團(tuán)頭魴雌雄親魚為上海海洋大學(xué)濱?；貓F(tuán)頭魴遺傳育種中心培育的“浦江1號(hào)”。所用胚胎為開展人工授精所得, 胚胎發(fā)育過程中, 每隔2—3h換水1次。受精卵置于室溫下人工培養(yǎng)、孵化, 每隔一段時(shí)間取成活胚胎50個(gè), 在顯微鏡下觀察發(fā)育時(shí)相, 然后將其放置于有RNA store保存液中以備后續(xù)提取總RNA。提取組織所需團(tuán)頭魴成魚為2齡魚, 體重約500 g。

1.2 不同發(fā)育時(shí)期胚胎和成魚不同組織總RNA的提取

活體剖殺團(tuán)頭魴成魚提取組織, 迅速置于液氮中快速冷凍。使用Trizol (Invitrogen)法提取經(jīng)高速組織研磨儀研磨過的胚胎和成魚組織中總RNA。使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總RNA的質(zhì)量, 使用紫外分光光度計(jì)(Bio-Rad, 美國)檢測(cè)提取的總RNA的濃度, 胚胎及各組織總RNA置于–80℃冰箱中低溫保存。

1.3 MSTN基因全長(zhǎng)cDNA的獲得

根據(jù)斑馬魚(Danio rerio)MSTN基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(mstn-F和mstn-R, 表 1)。以團(tuán)頭魴肌肉組織總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板, PCR擴(kuò)增MSTN基因小片段。3′-和5′-RACE擴(kuò)增使用SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech公司), 按試劑盒說明設(shè)計(jì)RACE和巢式引物(3′-mstn、3′-mstn nest、5′-mstn和 5′-mstn nest, 表 1), PCR擴(kuò)增3′-和5′-RACE目的片段[21], 所用引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成。

巢式擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過割膠回收(使用凝膠回收膠試劑盒割膠回收目的片段PCR產(chǎn)物)、連接[將上述PCR產(chǎn)物與pMD19-T (TaKaRa) 載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒]、轉(zhuǎn)化(將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中)、克隆(含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng))、測(cè)序(使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)插入特定片段的重組子, 所獲得的陽性克隆由上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序)[8]。測(cè)序結(jié)果用BioEdit7.0 軟件中的Clustal W程序比對(duì), 去掉重疊、序列兩端引物部分, 拼接得到團(tuán)頭魴MSTN基因cDNA全長(zhǎng)序列。

1.4 序列比較及進(jìn)化樹分析

采用BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST)、Clustal W軟件進(jìn)行核苷酸序列驗(yàn)證、翻譯及氨基酸序列相似性分析。尋找正確的開放閱讀框使用ORF (Open reading frame) finder程序(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf)。應(yīng)用Compute pI-Mw程序預(yù)測(cè)氨基酸序列等電點(diǎn)、Sigal P 3.0 server預(yù)測(cè)氨基酸序列相對(duì)分子質(zhì)量和信號(hào)肽[21]。用Expasy在線軟件進(jìn)行蛋白翻譯。用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域。運(yùn)用Clustal W[22]比對(duì)序列, 用MEGA 5.05軟件構(gòu)建NJ (Neighbor- joining)系統(tǒng)進(jìn)化樹[23]。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)分析

根據(jù)已克隆出的團(tuán)頭魴MSTN和魚類18s基因序列信息, 設(shè)計(jì)團(tuán)頭魴MSTN RT-PCR引物(MSTN RT-F和MSTN RT-R, 表 1)和18sRT-PCR引物(18sRTF和18s RT-R, 表 1)。以18s基因?yàn)閮?nèi)參, 對(duì)團(tuán)頭魴不同時(shí)期胚胎和成魚不同組織進(jìn)行RT-PCR分析MSTN基因mRNA在團(tuán)頭魴組織、胚胎中的表達(dá)。

1.6 整胚原位雜交(WISH)

根據(jù)已克隆出的團(tuán)頭魴MSTN基因序列, 跨越ORF和3′-UTR區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物, 表 1 中引物(mstn-in situ F/R)。擴(kuò)增出大小為877 bp的目的片段, 將目的片段與pGM-T (TaKaRa) 載體連接。使用特定限制性內(nèi)切酶(SacⅡ)37℃體外進(jìn)行線性化酶切, 回收的酶切產(chǎn)物體外經(jīng)RNA聚合酶(Promega)轉(zhuǎn)錄獲得WISH所需RNA探針。

WISH所需胚胎, 使用3%的胰蛋白酶浸泡去除卵膜并將其置于4%的PFA中, 4℃保存24h。固定好的胚胎使用含有0.1% Tween-20的磷酸緩沖液(PBS)進(jìn)行沖洗, 再轉(zhuǎn)移到100%的甲醇中, 于–20℃放置1d以上, 4℃長(zhǎng)期保存。WISH所使用的RNA核糖核酸探針采用地高辛標(biāo)記, 胚胎與探針在60℃雜交超過16h, 與PBST-SB抗(抗地高辛抗體)與AP (堿性磷酸酶)偶聯(lián), 通過羅氏BM染料產(chǎn)生紫色不溶沉淀。顯色完成后的胚胎在尼康SMZ1500顯微鏡下進(jìn)行拍照。

1.7 團(tuán)頭魴胚胎顯微注射

依據(jù)克隆出的團(tuán)頭魴MSTN基因全長(zhǎng)序列, 設(shè)計(jì)過表達(dá)引物(表 1, mstn cds-F和mstn cds-R), 以團(tuán)頭魴肌肉組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用TIAN quick Maxi Purification Kit回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物, 用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ (Promega)體外進(jìn)行酶切, 將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入pCS2載體中(本實(shí)驗(yàn)室保存中)。經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)合適的重組pCS2-MSTN質(zhì)粒送由生工生物技術(shù)公司測(cè)序、檢測(cè)。使用限制性內(nèi)切酶NotⅠ對(duì)檢測(cè)合適的重組pCS2-MSTN質(zhì)粒進(jìn)行酶切, 酶切產(chǎn)物采用mMessage mMachine kit (Ambion, TX, USA)體外轉(zhuǎn)錄獲得5′端加帽mRNA[24]。

顯微注射裝置由PV830 Pneumatic PicoPump顯微注射器和SMZ-445體式顯微鏡(Nikon)組成, 裝置由氮?dú)鈿鈮候?qū)動(dòng), 過轉(zhuǎn)錄表達(dá)MSTN mRNA濃度為500 pg/nL, 每次注射團(tuán)頭魴1—2細(xì)胞期胚胎卵黃(靠近細(xì)胞部分)的量為1 nL。注射好的胚胎置于胚胎培養(yǎng)液中室溫下孵化, 顯微鏡下觀察胚胎的發(fā)育情況并拍照[24]。

2 結(jié)果

2.1 團(tuán)頭魴MSTN基因cDNA序列分析

本研究克隆獲得團(tuán)頭魴MSTN基因全長(zhǎng)cDNA序列(KY072939)。其cDNA序列全長(zhǎng)2187 bp, 包括88 bp的5′ UTR (非編碼區(qū)), 971 bp的3′ UTR (非編碼區(qū))。ORF大小為1128 bp, 可編碼375個(gè)氨基酸,推測(cè)的MSTN前體蛋白等電點(diǎn)為5.02, 相對(duì)分子質(zhì)量為92.34 kD。團(tuán)頭魴MSTN基因編碼蛋白包含有兩大TGF-β蛋白結(jié)構(gòu)域, 也有RXXR蛋白酶水解位點(diǎn)RIRR; 還有9個(gè)保守的半胱氨酸殘基(圖 1)。

2.2 同源性及分子進(jìn)化分析

利用CLUSTAL W比對(duì)團(tuán)頭魴、斑馬魚、草魚和人類氨基酸序列分析(圖 1), 團(tuán)頭魴氨基酸序列與草魚和斑馬魚MSTN1氨基酸序列的相似度分別為99%和97%, 而與草魚和斑馬魚MSTN2氨基酸序列的相似度分別為68%和70%, 與人類氨基酸序列的相似度為68%。氨基酸序列分析結(jié)果表明, 克隆得到的團(tuán)頭魴MSTN與草魚、斑馬魚MSTN 1具有較高的相似度。Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖 2)結(jié)果表明, 克隆得到的團(tuán)頭魴MSTN與草魚、斑馬魚MSTN 1和鯉MSTN 1a, 1b型緊密聚為一支, 由此可以得知克得到的團(tuán)頭魴MSTN基因?yàn)?型MSTN基因。

2.3 團(tuán)頭魴MSTN mRNA在不同時(shí)期胚胎和成魚不同組織中的表達(dá)分析

以18s基因?yàn)閮?nèi)參, 用表 1中引物(MSTN RTF/R和18s F/R)對(duì)團(tuán)頭魴成魚腦、腸、肝胰臟、鰓、心臟、眼睛、腎臟、肌肉、脾臟、精巢和卵巢等11個(gè)組織進(jìn)行RT-PCR分析。結(jié)果顯示MSTN mRNA在所有11個(gè)組織中均有表達(dá), 但組織間表達(dá)量存在差異。肌肉、腦和精巢中的大量表達(dá), 肝胰臟、脾臟和卵巢少量表達(dá), 而在其他組織中微量表達(dá)(圖 3A)。

以18s基因?yàn)閮?nèi)參, 用表 1中引物(MSTN RTF/R和18s F/R)對(duì)團(tuán)頭魴0—52 hpf不同時(shí)期胚胎進(jìn)行RT-PCR分析。結(jié)果顯示團(tuán)頭魴MSTN mRNA在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá), 0—44 hpf微量表達(dá), 4—52 hpf表達(dá)量逐漸升高(圖 3B)。

2.4 WISH (整胚原位雜交)結(jié)果分析

團(tuán)頭魴胚胎WISH (整胚原位雜交)結(jié)果(圖 4)表明: 在16 hpf時(shí), MSTN mRNA在16 hpf在脊索中表達(dá)(圖 4A); 在28 hpf時(shí), MSTN mRNA在眼睛和整個(gè)腦部(前腦、間腦、中腦、中腦-后腦邊界、后腦)表達(dá)(圖 5B); 而在55 hpf時(shí), MSTN mRNA僅在眼睛、前腦和間腦中表達(dá)(圖 4C)。對(duì)照組均無信號(hào)表達(dá)(圖 4D, E, F)。

2.5 MSTN mRNA過表達(dá)結(jié)果分析

圖 1 團(tuán)頭魴與人類、斑馬魚、草魚MSTN氨基酸序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)分析Fig. 1 Alignment of the deduced amino acid sequences of grass carp duplicated MSTNs with homologs from zebrafish, grass carp and humansRXXR蛋白酶水解位點(diǎn)黑色下劃線表示, 黑色邊框?yàn)門GF-β前肽結(jié)構(gòu)域, 波浪邊框?yàn)門GF-β或類TGF-β結(jié)構(gòu)域保守的半胱氨酸殘基用黑色箭頭表示RXXR hydrolysis sites underlined black, black border for the TGF-β propeptide domain, a wave border for the TGF-β or TGF-β type domain conserved cysteine, residues with a black arrow

圖 2 團(tuán)頭魴MSTN基因氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Neighbor-Joining phylogenetic tree of blunt snout bream MSTN putative peptides in vertebrates團(tuán)頭魴MSTN用下劃線標(biāo)出, 數(shù)值代表置信的百分比The blunt snout bream MSTN is indicated by underline; Numbers of branches are percentage of times that the two clades branched as sisters

圖 3 團(tuán)頭魴MSTN在成體不同組織(A)和胚胎不同時(shí)期(B)的表達(dá)情況Fig. 3 The MSTN mRNA level in adult tissues (A) and during embryogenesis (B) in Megalobrama amblycephala

圖 4 團(tuán)頭魴MSTN mRNA在胚胎時(shí)期的整胚原位雜交結(jié)果Fig. 4 Whole-mount embryo in situ hybridization analysis of MSTN mRNA during different embryonic stages in blunt snout breamA、B和C. MSTN反義探針; D、E和F. MSTH正義探針; n. 脊索; e. 眼睛; f. 前腦; d. 間腦; MHB. 中腦、后腦邊界; h. 后腦The MSTN antisense probe (A, B and C), the sense probe (D, E and F); n. notochord; e. eyes; f. forebrain; d. midbrain; MHB. midhindbrain; h. hindbrain

團(tuán)頭魴MSTN mRNA過表達(dá)結(jié)果(圖 5), 16 hpf后團(tuán)頭魴胚胎發(fā)育出現(xiàn)明顯異常, 在體節(jié)發(fā)生期顯示為前-后軸伸長(zhǎng), 背-腹軸縮短, 包被層萎縮, 體型呈紡錘形(圖 5A–H); 脊索和肌節(jié)的生長(zhǎng)發(fā)育受到強(qiáng)烈抑制, 并造成脊索的輕微扭曲(圖 5H)。顯微注射結(jié)果表明, MSTN mRNA過表達(dá)對(duì)團(tuán)頭魴胚胎背-腹軸和體節(jié)的形成過程造成重大的影響。在12 hpf,對(duì)照組、注射組的存活率分別為91, 6%和20, 7%;在16 hpf, 對(duì)照組、注射組的存活率分別為 75.4%和8.6%; 17 hpf時(shí)注射組胚胎全部死亡。

3 討論

本研究克隆獲得團(tuán)頭魴MSTN基因全長(zhǎng)cDNA序列, 序列全長(zhǎng)2187 bp; ORF編碼375個(gè)氨基酸, 屬于TGF-β超家族, 有的RIRR蛋白水解位點(diǎn)和9個(gè)保守的半胱氨酸殘基?；蛟S是由于魚類第三輪全基因組復(fù)制的緣故, 一些魚類研究表明存在兩個(gè)MSTN基因[25,26]。序列比對(duì)結(jié)果顯示, 團(tuán)頭魴MSTN基因氨基酸序列與斑馬魚、草魚MSTN基因氨基酸序列相似性較高, 而與人類MSTN基因氨基酸序列相似性較低, 表明MSTN基因在長(zhǎng)期的進(jìn)化中高度保守。團(tuán)頭魴MSTN與斑馬魚MSTN 1的相似性高達(dá)97%, 與斑馬魚MSTN 2的相似率僅為66%, 表明研究克隆得到的團(tuán)頭魴MSTN應(yīng)為1型基因。

研究小鼠發(fā)現(xiàn), MSTN基因只在某一特定組織(骨骼肌)中大量表達(dá), 少數(shù)組織(脂肪、心肌、乳腺)中少量表達(dá)[1], 而魚類中MSTN基因卻廣泛表達(dá)[27]。團(tuán)頭魴組織RT-PCR結(jié)果顯示, 所有檢測(cè)組織中MSTN mRNA均有表達(dá), 但組織間MSTN mRNA表達(dá)量存在明顯差異; 據(jù)此推斷, 團(tuán)頭魴MSTN基因除調(diào)節(jié)肌肉生長(zhǎng)和發(fā)育外, 可能還存在其他的功能[17,28]。團(tuán)頭魴不同發(fā)育時(shí)期的胚胎RT-PCR結(jié)果顯示, MSTN mRNA在0—44 hpf的表達(dá)量較低, 48—52 hpf表達(dá)量逐漸升高。前期檢測(cè)到的MSTN mRNA或許是少量保留的母源性轉(zhuǎn)錄本, 后期檢測(cè)到的MSTN mRNA可能由于團(tuán)頭魴胚胎發(fā)育36h后體節(jié)基本發(fā)育完成, 激活相關(guān)肌肉特異性基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[29], 因而導(dǎo)致MSTN mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)量逐漸升高。Vianello等[30]報(bào)道了斑馬魚一細(xì)胞期就檢測(cè)到MSTN mRNA, 8 hpf降低; 而在16 hpf, MSTN mRNA表達(dá)水平顯著增加, 由此可以驗(yàn)證前期檢測(cè)到的MSTN mRNA是由少量保留的母源性轉(zhuǎn)錄本而來, 后期是由于胚胎發(fā)育過程中肌肉細(xì)胞分化而引起的MSTN mRNA表達(dá)量的上升。

圖 5 MSTN過表達(dá)對(duì)團(tuán)頭魴胚胎發(fā)育的影響Fig. 5 Overexpression of MSTN causes obvious embryonic abnormalities in Megalobrama amblycephala at 12 hpf and 16 hpfA為發(fā)育至12h對(duì)照組胚胎, B為發(fā)育至12h過表達(dá)胚胎; C-H均為發(fā)育至16h胚胎; C、E和G為正常對(duì)照組; D、F和H為MSTN過表達(dá)組; 黑箭頭指示體節(jié)位置; 短線長(zhǎng)度均為600 μmA are the wildtype embryos that developed at 12 h; B are MSTN mRNA-injected embryos that developmented at 12 h; C-H are all embryos that developmented at 16h; C, E and G are the wildtype embryos; D, F and H are MSTN mRNA-injected embryos. Dark arrows show the somites. Scale bar=600 μm

WISH結(jié)果顯示, 胚胎發(fā)育早期MSTN mRNA廣泛表達(dá), 在脊髓中表達(dá)最明顯; 這與草魚MSTN mRNA的早期12 hpf胚胎原位雜交結(jié)果是一致的。團(tuán)頭魴MSTN mRNA在中期28 hpf和晚期55 hpf胚胎中主要集中在腦中表達(dá); 與草魚MSTN mRNA中期胚胎中在腦中和尾節(jié)中; 晚期胚胎中在腦和脊索中表達(dá)結(jié)果不同[31,32]; 而斑馬魚MSTN mRNA的表達(dá)與團(tuán)頭魴、草魚MSTN mRNA完全相反, 斑馬魚MSTN mRNA在早期表達(dá)信號(hào)微弱, 在中、后期表達(dá)強(qiáng)烈[33];表明在不同種魚之間MSTN mRNA的表達(dá)存在差異。團(tuán)頭魴MSTN mRNA過表達(dá)造成表型發(fā)生變化, 主要體現(xiàn)在胚胎前-后軸伸長(zhǎng), 背-腹軸縮短, 使整個(gè)胚胎成紡錘形, 這與BMPs蛋白受到抑制后引起的胚胎形態(tài)變化非常相似[34,35], 這或許是由于MSTN基因的調(diào)控作用通過Smad蛋白發(fā)揮的同時(shí),促進(jìn)抑制性Samd蛋白的表達(dá), 抑制了BMPs信號(hào)轉(zhuǎn)遞的結(jié)果[36]。本研究開展了團(tuán)頭魴MSTN基因結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)以及過表達(dá)研究, 可為下階段MSTN基因的morpholino基因敲降或crispr/cas9敲除研究MSTN功能性缺失對(duì)胚胎發(fā)育的影響打下良好基礎(chǔ)。

[1]McPherron A C, Lawler A M, Lee S J. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member [J]. Nature, 1997, 387(6628): 83—90

[2]Yang W, Wang H X. cDNA cloning, expression and purification of protein of GDF-8 in chicken [J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2001, 17(4): 460—462 [楊威,王海霞. 雞生長(zhǎng)分化因子GDF-8 cDNA的克隆表達(dá)及蛋白質(zhì)純化. 生物工程學(xué)報(bào), 2001, 17(4): 460—462]

[3]Li S H, Xiong Y Z, Zheng R. The polymorphism and SNPs research of myostatin gene in pig (porcine) [J]. Journal of Genetica and Genomics, 2002, 29(4): 326—331 [李邵華, 熊遠(yuǎn)著, 鄭嶸. 豬MSTN基因多態(tài)性及其SNPs的研究. 遺傳學(xué)報(bào), 2002, 29(4): 326—331]

[4]Grober L, Martin L J R, Poncelet D, et al. A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle [J]. Nature Genetics, 1997, 17(1): 71—74

[5]Amali A A, Lin C J, Chela Y. Up-regulation of musclespecific transcription factors during embryonic somhogenesis of zebrafish (Danio rerio) by knock-down of myostafin-1 [J]. Developmental Dynamics, 2003, 229: 847—856

[6]Du F K, Nie Z J, Xu G C, et al. Cloning and tissue expression of the MSTN gene in Coilia nasus [J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2014, 4: 684—692 [杜富寬,聶志娟, 徐鋼春, 等. 刀鱭MSTN基因的克隆及其組織表達(dá). 中國水產(chǎn)科學(xué), 2014, 4: 684—692]

[7]Xu J Y, Cheng S L. Cloning and expression analysis of the myostatin (MSTN) gene in Paralichthys olivaceus [J]. Journal of Fisheries of China, 2008, 32(4): 497—506 [徐建勇, 陳松林. 牙鲆肌肉生長(zhǎng)抑制素(MSTN)基因克隆.水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2008, 32(4): 497—506]

[8]Pu J W, Sun C F, Jiang X Y, et al. Two cDNAs cloning, expression and overexpression in embryo of myostatin from grass carp (Ctenopharyngodon idellus) [J]. Biotechnology Bulletin, 2011, 8: 153—160 [濮劍威, 孫成飛, 蔣霞云, 等. 草魚兩個(gè)肌肉生長(zhǎng)抑制素cDNA克隆、表達(dá)及過量表達(dá)對(duì)胚胎發(fā)育的影響. 生物技術(shù)通報(bào), 2011, 8: 153—160]

[9]Maccatrozzo L, Bargelloni L, Radaelli G, et al. Characterization of the myostatin gene in the gilthead seabream (Sparus aurata): sequence, genomic structure, and expression pattern [J]. Marine Biotechnology, 2001, 3(3): 224—230

[10]Rodgers B D, Weber G M, Sullivan C V, et al. Isolation and characterization of moystatin complementary deoxyribonucleic acid clones from two commercially important fish: Oreochromis mossambicus and Morone chrysops [J]. Endocrinology, 2001, 142: 1412—1418

[11]Rescan P Y, Jutel I, Ralliere C. Two myostatin genes are differentially expressed in myotomal muscles of the trout (Oncorhynchus mykiss) [J]. The Journal of Experimental Biology, 2001, 204(20): 3523—3529

[12]Ostbye T K, Galloway T F, Nielsen C, et al. The two myostatin genes of Atlantic salmon (Salmo salar) are expressed in a variety of tissues [J]. European Journal of Biochemistry, 2001, 268(20): 5249—5257

[13]Lee S J, McPherron A C. Regulation of myostatin activity and muscle growth [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98(16): 9306—9311

[14]Hill J J, Davies M V, Pearson A A, et al. The myostatin propeptide and the follistatin-related gene are inhibitory binding proteins of myostatin in normal serum [J]. The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(43): 40735—40741

[15]Zhu X, Topuzis S, Liang L, et al. Myostatin signaling through Smad2, Smad3 and Smad4 is regulated by the inhibitory Smad7 by a negative feedback mechanism [J]. Cytokine, 2004, 26(6): 263—272

[16]Xu C, Wu G, Zohar Y, et al. Analysis of myostatin gene structure, expression and function in zerbafish [J]. Journal of Experimental Biology, 2003, 206(22): 4067—4079

[17]Amali A A, Lin C J F, Chen Y H, et al. Upregulation of muscle-specific transcription factors during embryonic somitogenesis of zebrafish (Danio rerio) by knock-down of myostatin-1 [J]. Developmental Dynamics, 2004, 229(4): 847—856

[18]Acosta J, Carpio Y, Borroto L, et al. Myostatin gene silenced by RNAi show a zebrafish giant phenotype [J]. The Journal of Biology, 2005, 119(4): 324—331

[19]Li S F, Zou S M, Cai W Q, et al. Production of interploid triploids by 4n × 2n blunt snout bream (Megalobrama amblycephala) and their first performance data [J]. Aquaculture Research, 2006, 37(4): 374—349

[20]FBMA. China Fisheries Year Book [C]. Beijing: China Agriculture Press. 2015 [中國漁業(yè)年鑒. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社. 2015]

[21]Zhou C X. Molecular cloning and functional characterization of IGF-1R and duplicated IGFBP-5 in grass carp (Ctenopharyngodon idellus) and SNP analysis of different grass carp’s muscle-growth control genes [D]. Thesis for Master of Science. Shanghai Ocean University, Shanghai, 2014 [周春雪. 草魚胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體和結(jié)合蛋白5的克隆與功能研究及不同草魚群體肌肉生長(zhǎng)調(diào)控基因SNP分析. 碩士學(xué)位論文, 上海海洋大學(xué),上海. 2014]

[22]Larkin M A, Blackshields G, Brown N P, et al. Clustal W and Clustal X version 2.0 [J]. Bioinformatics, 2007, 23(21): 2947—2948

[23]Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods [J]. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28(10): 2731—2739

[24]Sheng R J. Structural and functional studies of hypoxia inducible factors in Megalobrama amblycephala [D]. Thesis for Master of Science. Shanghai Ocean University, Shanghai. 2011 [沈睿杰. 團(tuán)頭魴缺氧誘導(dǎo)因子的結(jié)構(gòu)和功能研究. 碩士學(xué)位論文, 上海海洋大學(xué), 上海. 2011]

[25]Ostbye T K, Galloway T F, Nislsen C, et al. The two myostatin genes of Atlantic salmon (Salmo salar) are expressed in a variety of tissues [J]. European Journal of Biochemistry, 2001, 268(20): 5249—5357

[26]Robert S B, Goetz F W. Myostatin protein and RNA tran-script levels in adult and developing brook trout [J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2003, 210(1-2): 9—20

[27]Rodgers B D, Weber G M, Sullivan C V, et al. Isolation and characterization of myostatin complementary deoxyribonucleic acid clones from two commercially important fish: Oreochromis mossambicus and Morone chrysops [J]. Endocrinology, 2001, 142(4): 1412—1418

[28]Garikipati D K, Gahr S A, Roalson E H, et al. Characterization of rainbow trout myostatin-2 genes (rtMSTN-2a and -2b): genomic organization, differential expression, and pseudogenization [J]. Endocrinology, 2007, 148(5): 2106—2115

[29]Zhang H W. Developmental Biology (second edition) [M]. Beijing: Higher Education Press. 2006, 178—179 [張紅衛(wèi). 發(fā)育生物學(xué)(第二版). 北京: 高等教育出版社. 2006, 178—179]

[30]Vianello S, Brazzoduro L, Dalla Valle L, et al. Myostatin expression during development and chronic stress in zebrafish (Danio rerio) [J]. The Journal of Endocrinology, 2003, 176(1): 47—59

[31]Zheng G D, Sun C F, Pu J W, et al. Two myostatin genes exhibit divergent and conserved functions in grass carp (Ctenopharyngodon idellus) [J]. General & Comparative Endocrinology, 2016, 214: 68—76

[32]Pu J W. cDNA cloning, expression in embryo of myostain in grass carp (Ctenopharyngodon idellus) [D]. Thesis for Master of Science. Shanghai Ocean University, Shanghai. 2011 [濮劍威. 草魚肌肉生長(zhǎng)抑制素克隆及功能研究. 碩士學(xué)位論文, 上海海洋大學(xué), 上海. 2011]

[33]Xu C, Wu G, Zohar Y, et al. Analysis of myostatin gene structure, expression and function in zebrafish [J]. Journal of Experimental Biology, 2003, 206(22): 4067—4079

[34]Gan S, Huang Z, Liu N, et al. MicroRNA-140-5p impairs zebrafish embryonic bone development via targeting BMP-2 [J]. FEBS Letters, 2016, 590(10): 1438—1446

[35]Xue Y, Zheng X, Huang L, et al. Organizer-derived Bmp2 is required for the formation of a correct BMP activity gradient during embryonic development [J]. Nature Communication, 2014, 5(4): 3766

[36]Ishisaki A, Yamato K, Hashimoto S, et al. Differential inhibition of Smad6 and Smad7 on bone morphogenetic protein- and activin-mediated growth arrest and apoptosis in B cells [J]. Journal of Biological Chemistry, 1999, 274(19): 13637—13642

MOLECULAR STRUCTURE AND EXPRESSION OF MYOSTATIN IN MEGALOBRAMA AMBLYCEPHALA AND ITS OVEREXPRESSION EFFECTS IN EMBRYO

DU Shang-Ke, SHEN Rui-Jie, CHEN Jie, JIANG Xia-Yun and ZOU Shu-Ming
(Key Laboratory of Genetic Resources for Freshwater Aquaculture and Fisheries, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The current study cloned a 2187 bp full-length cDNA of myostatin from blunt snout bream (Megalobrama amblycephala) by rapid amplification of cDNA ends (RACE). Its open reading frame is 1128 bp encoding 376 amino acids. RT-PCR analysis demonstrated that MSTN are extensively expressed in tissues of blunt snout bream with high level in the muscle, brain and testis is the highest, modest level in the liver, spleen, and ovary, and low level in intestine, gills, heart, eye, and kidney. During embryos development, mRNA level of MSTN is low from 0 to 44 hpf, whereas its expression increases gradually from 48 hpf to 52 hpf. The whole mount in situ hybridization demonstrated that MSTN mRNA was transcribed at different tissues of blunt snout bream’s embryos. MSTN mRNA were detected at the Notochord at 16 hpf. In 28 hpf and 55 hpf embryos, the MSNT mRNA level was very high in brain. Overexpression MSTN mRNA in embryos caused elongated anterior-posterior axis, shorter dorsal-ventral axis, slightly distorted notochord, and strongly inhibited somites. This study provides knowledge for subsequent blunt snout bream MSTN gene function research and molecular breeding of blunt snout bream.

Myostatin; Megalobrama amblycephala; In situ hybridization; Overexpression

Q344+.1

A

1000-3207(2017)03-0573-08

10.7541/2017.74

2016-07-11;

2016-11-25

國家科技支撐計(jì)劃(2012BAD26B00); 國家自然科學(xué)基金(31272633和31201760)資助 [Supported by the Key Projects in the National Science & Technology Pillar Program (2012BAD26B00); the National Natural Science Foundation of China (31272633, 31201760)]

杜尚可(1988—), 男, 河南新鄉(xiāng)人; 碩士; 研究方向?yàn)轸~類遺傳育種。E-mail: dushangke1988@163.com

鄒曙明, 教授, 博導(dǎo); 研究方向?yàn)轸~類遺傳育種。E-mail: smzou@shou.edu.cn