嬰幼兒配方羊奶粉中乳鐵蛋白含量測定

文/李則均

（黑龍江完達(dá)山乳品有限公司）

嬰幼兒配方羊奶粉中乳鐵蛋白含量測定

文/李則均

（黑龍江完達(dá)山乳品有限公司）

以食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中乳鐵蛋白的測定（征求意見稿）》為參考，優(yōu)化預(yù)處理步驟和梯度洗脫條件，肝素親和柱凈化，紫外高效液相色譜法測定嬰幼兒配方羊奶粉中乳鐵蛋白含量。檢測波長280 nm，乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間9.475 min。乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品工作液濃度50～250 μg/mL，在此范圍內(nèi)線性回歸方程y =129.67x-7.4719，R2＞0.9991。乳鐵蛋白定性重復(fù)性RSD%（n=6）為0.074，定量重復(fù)性RSD%（n=6）為0.996。乳鐵蛋白加標(biāo)回收率在93.4%～99.1%，平均回收率96.7%。

嬰幼兒配方羊奶粉；乳鐵蛋白；肝素親和柱；紫外高效液相色譜

乳鐵蛋白是一種非常重要的非血紅素鐵結(jié)合單體糖蛋白。乳鐵蛋白不僅參與鐵的轉(zhuǎn)運，而且具有廣譜抗菌、抗病毒、抗真菌、抗氧化、抗輻射、抗過敏、抗癌和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能。研究表明，人乳喂養(yǎng)的嬰兒較嬰幼兒配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒抵抗力更高，不易患各種傳染性疾病，主要是由于母乳中含有更多的乳鐵蛋白、免疫球蛋白等多種活性蛋白，因此普通嬰幼兒配方奶粉中合理的添加乳鐵蛋白尤為重要。羊奶與牛奶相比，羊奶的脂肪顆粒體積更小，維生素和微量元素含量更高，更易被嬰幼兒消化吸收，因此嬰幼兒配方羊奶粉越來越受到市場青睞。嬰幼兒配方羊奶粉中添加乳鐵蛋白有著更廣泛的前景，本文旨在確定一種準(zhǔn)確、高效的嬰幼兒配方羊奶粉中乳鐵蛋白含量的測定方法。

目前乳鐵蛋白的測定方法主要有分光光度法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效親和色譜法、高效毛細(xì)血管電泳法以及表面等離子共振技術(shù)等。分光光度法測定乳鐵蛋白含量準(zhǔn)確性差。酶聯(lián)免疫吸附法、高效親和色譜法和高效毛細(xì)血管電泳法樣品前處理操作繁瑣，預(yù)處理時間長。高效液相色譜法測定準(zhǔn)確性好，親和柱處理目標(biāo)峰明確，干擾峰少，前處理簡單、時間短，因此本文采用肝素親和柱預(yù)處理凈化樣品，紫外高效液相色譜柱分離測定嬰幼兒配方羊奶粉中乳鐵蛋白含量。

1 材料方法

1.1 儀器與藥品材料

1.1.1 儀器

紫外高效液相色譜：美國，PE生產(chǎn)，型號PE Flexar。

數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司，型號KQ-1000DB。

冷凍離心機：SIGMA生產(chǎn)，型號3K15。

pH計：METTLER TOLEDO生產(chǎn)，型號MP220。

渦旋振蕩器：IKA VORTEX生產(chǎn)，型號GENIUS 3。

1.1.2 藥品材料

超純水：Millipore純水機制備。

三氟乙酸：CNW生產(chǎn)，色譜純，濃度0.1%。

乙腈：DiKMA生產(chǎn)，色譜純。

乙醇溶液（20%）：乙醇DiKMA生產(chǎn)，色譜純。

磷酸：科密歐生產(chǎn)，優(yōu)級純。

磷酸氫二鈉溶液（0.20 mol/L）：稱取28.4 g磷酸氫二鈉（科密歐生產(chǎn)，優(yōu)級純），加水溶解，用磷酸調(diào)pH值至8.00±0.50，加水定容至1 000 mL。

磷酸氫二鈉-氯化鈉溶液：稱取7.1 g磷酸氫二鈉，58.4 g氯化鈉（科密歐生產(chǎn)，優(yōu)級純），加水溶解，用磷酸調(diào)pH值至8.00±0.50，加水定容至1 000 mL。

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：乳鐵蛋白儲備液，濃度10 mg/mL；乳鐵蛋白中間液，濃度0.5 mg/mL；乳鐵蛋白工作液，濃度分別為0、50、100、150、200、250 μg/mL。

肝素親和小柱（1 mL）：Pharmacia生產(chǎn)，Hitrap Heparin HP。

1.2 預(yù)處理方法

1.2.1 提取

準(zhǔn)確稱取嬰幼兒配方羊奶粉1.0 g于50 mL帶蓋離心管中，加入10 mL 40～45 ℃磷酸氫二鈉溶液。渦旋振蕩使樣品完全溶解后，再渦旋振蕩30 s，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min。移取上層清液，再加5 mL磷酸氫二鈉溶液重復(fù)操作1 次，合并2 次液體作為提取液備用。

1.2.2 凈化

肝素親和小柱先加入5 mL磷酸氫二鈉溶液平衡，然后加入樣品提取液，待樣液完全流出后，再用10 mL磷酸氫二鈉溶液淋洗，棄去全部流出液，用2.5 mL磷酸氫二鈉-氯化鈉溶液洗脫，收集全部流出液，用磷酸氫二鈉-氯化鈉溶液定容至2.5 mL。過0.45 μm微孔水相濾膜，進行液相色譜檢測分析。

1.3 分離條件

1.3.1 色譜柱

Proteonavi HPLC PACKED COLUMN C4，4.6 μm×150 mm。

1.3.2 流動相

A：0.1%三氯乙酸；B：乙腈。梯度洗脫，洗脫條件見表1。

1.3.3 進樣量

50 μL。

1.3.4 檢測波長

280 nm。

1.3.5 柱溫

30 ℃。

2 結(jié)果分析

2.1 嬰幼兒配方羊奶粉中乳鐵蛋白目標(biāo)峰的確定

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為100 μg/mL的液相色譜圖見圖1。如圖1所示，乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜顯示為單峰，出峰時間為9.475 min，在該保留時間內(nèi)無梯度洗脫物和試劑雜峰干擾，具有很好的相應(yīng)強度，基線穩(wěn)定。

表1 梯度洗脫條件

圖1 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖

圖2 嬰幼兒配方羊奶粉中乳鐵蛋白色譜圖

嬰幼兒配方羊奶粉樣品中乳鐵蛋白液相色譜圖見圖2。圖2顯示，樣品中乳鐵蛋白的保留時間為9.413 min。樣品預(yù)處理采用肝素親和小柱，色譜圖中除去梯度洗脫和試劑雜峰外，無任何干擾雜峰。嬰幼兒配方羊奶粉成分復(fù)雜，含有大量的酪蛋白，它的存在對乳鐵蛋白的測定具有較大干擾，肝素親和小柱有效地去除了大量雜質(zhì)，對乳鐵蛋白進行純化和濃縮吸收，對提高檢測靈敏度起到了很好的作用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液注入高效液相色譜儀測定的對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。不同濃度工作液與對應(yīng)峰面積見表2，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。線性回歸方程為y =129.67x-7.4719，R2＞0.9991，說明乳鐵蛋白工作液濃度在50～250 μg/mL時，乳鐵蛋白峰面積與質(zhì)量濃度之間存在良好的線性關(guān)系。本方法的檢出限為24 μg/mL，定量限為8 μg/mL。

2.3 方法的重現(xiàn)性與回收率

2.3.1 重現(xiàn)性

嬰幼兒配方羊奶粉中乳鐵蛋白的測定疊加圖見圖4，樣本數(shù)為6，乳鐵蛋白定性定量重復(fù)性見表3。通過圖4和表3表明，采用此方法測定嬰幼兒配方羊奶粉中乳鐵蛋白含量，試驗重現(xiàn)性良好。

2.3.2 回收率

選取沒有添加過乳鐵蛋白的全脂羊奶粉（樣品1）做空白對照，選取市場銷售的某嬰幼兒配方羊奶粉（樣品2）中乳鐵蛋白平均含量為30 mg/100 g，加標(biāo)回收試驗分別添加乳鐵蛋白含量為10、30、50 mg/100 g，測得回收率結(jié)果見表4。

表2 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度與對應(yīng)峰面積

乳鐵蛋白含量為10 mg/100 g的加標(biāo)回收率較低，平均值為94.3%（樣品1和樣品2平均值）；乳鐵蛋白含量為30 mg/100 g的加標(biāo)回收率平均值為97.0%；乳鐵蛋白含量為50 mg/100 g的加標(biāo)回收率較高，平均值為98.8%。但是加標(biāo)回收試驗的添加量不能過高，因為肝素親和柱（1 mL）的柱過載量不能超過1 g/100 g，添加量過大會造成肝素親和柱飽和，導(dǎo)致乳鐵蛋白無法被吸附而損失，影響回收率。本試驗的添加量分別按照樣品含量的0.3 倍、1.0 倍、1.6 倍添加，在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，又沒有超過肝素親和柱添加量，因此回收率較穩(wěn)定，平均回收率為96.7%。

圖3 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 嬰幼兒配方羊奶粉中乳鐵蛋白定性定量重復(fù)性結(jié)果表

圖4 嬰幼兒配方羊奶粉中乳鐵蛋白的測定疊加圖

表4 回收率試驗

3 討論

嬰幼兒配方羊奶粉成分十分復(fù)雜，含有大量的乳糖和酪蛋白，這些物質(zhì)對乳鐵蛋白的測定產(chǎn)生了較大的干擾，本文采用肝素親和柱法凈化濃縮后，乳鐵蛋白目標(biāo)峰明確。肝素親和柱的主要成分為肝素瓊脂糖，其作用原理主要是固定化肝素的活性調(diào)節(jié)分子與乳鐵蛋白結(jié)合，同時肝素的聚陽離子特性，使其具有離子交換的作用。肝素由于其生理特性，pH值的范圍一般為5～10，因此試驗時溶解乳鐵蛋白和洗脫用的離子緩沖溶液要嚴(yán)格控制pH值范圍。

為了節(jié)約試驗成本，肝素親和柱可以反復(fù)使用，在第1次使用完畢后，用50～100 mL的磷酸氫二鈉溶液（0.20 mol/L）反復(fù)沖洗，最后保存在20%乙醇溶液中。一根肝素親和柱可以反復(fù)使用2～3 次，試驗表明肝素親和柱后2 次的使用吸附率一般在85%以上。為了提高檢測準(zhǔn)確率，肝素親和柱從4 ℃冰箱拿出后不能馬上使用，要緩到室溫20～25 ℃，再注入提取液時，過柱流速一般控制在10～20 mL/min，使乳鐵蛋白與肝素上帶負(fù)電的硫酸鹽和羧酸基團能充分反應(yīng)，以提高回收率。

本文以食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中乳鐵蛋白的測定（征求意見稿）》為參考，優(yōu)化了預(yù)處理試驗步驟，節(jié)省了檢測時間；改變了梯度洗脫條件，使乳鐵蛋白得到更好的分離，基線更穩(wěn)定。

4 結(jié)論

本文采用肝素親和柱凈化，紫外高效液相色譜法測定嬰幼兒配方羊奶粉中乳鐵蛋白含量，采用Proteonavi HPLC PACKED COLUMN C4，4.6 μm×150 mm色譜柱，以0.1%的三氯乙酸溶液和乙腈梯度洗脫，在乳鐵蛋白工作液濃度為50～250 μg/mL時準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性較好，適合工廠大批生產(chǎn)嬰幼兒配方羊奶粉及其它奶制品等添加乳鐵蛋白含量的測定。C

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Determination of the Content of Lactoferrin in Infant Formula Sheep Powder

LI Ze-jun
（Heilongjiang Wondersun Dairy Co. Ltd.）

The determination of lactoferrin in food （draft for comments） was taken as the reference in the national food safety standard. The pretreatment and gradient elution conditions were optimized. The heparin affinity column was used for the determination of lactoferrin in infant formula sheep powder. Detection wavelength was 280 nm，lactoferrin standard peak time was 9.475 min. Lactoferrin standard working solution concentration was 50～250 μg / mL，in this range linear regression equation was y=129.67x-7.4719，R2＞0.9991. The qualitative repeatability RSD% （n =6）of lactoferrin was 0.074 and the quantitative repeatability RSD%（n=6）was 0.996. The recoveries of lactoferrin were 93.4%～99.1%，and the average recovery was 96.7%.

infant formula sheep powder；lactoferrin；heparin affinity column；ultraviolet high performance liquid chromatography

李則均（1983-），女，工程師，主要從事質(zhì)量分析工作。

2017-02-03）