魯氏酵母的復(fù)壯及培養(yǎng)條件的研究

張立文，劉振蓉

(1.煙臺經(jīng)濟學(xué)校，山東 煙臺 264000；2.煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005)

魯氏酵母的復(fù)壯及培養(yǎng)條件的研究

張立文1，劉振蓉2

(1.煙臺經(jīng)濟學(xué)校，山東 煙臺 264000；2.煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005)

對退化的魯氏酵母進行了復(fù)壯，并研究了培養(yǎng)條件對魯氏酵母生物量，通過單因素試驗和正交試驗對酵母生長條件進行了優(yōu)化，實驗結(jié)果表明魯氏酵母最佳生長條件為：食鹽濃度8%，溫度30 ℃，pH值5，含氮量0.15%。

魯氏酵母；分離；純化

醬油在傳統(tǒng)的制作工藝上主要是用大豆、小麥中的植物蛋白、食鹽和水為主要原料，經(jīng)過微生物，比如酵母菌、米曲霉以及乳酸菌等多種微生物和細胞的共同作用釀造而成[1]。其中霉菌(米曲霉和黑曲霉)與產(chǎn)品發(fā)酵周期的長短、發(fā)酵成熟的快慢、產(chǎn)品的色澤和味道有著密切的聯(lián)系，而醬油的風味醇香程度則主要取決于微生物中的魯氏酵母菌和乳酸菌[2,3]。魯氏酵母是耐高滲透壓酵母，能夠在鹽濃度為5%～8%時生長良好，魯氏酵母是醬油釀造過程中的主要產(chǎn)香菌株，在發(fā)酵溫度過高的情況下，酵母會失去活性從而影響醬油香氣成分的形成[4,5]。

本文對魯花生物科技有限公司提供的魯氏酵母菌懸液進行了分離純化，挑選出茁壯的酵母菌落，分別考察它們的細胞形態(tài)、細胞生長曲線、酒精發(fā)酵能力，從中篩選出最優(yōu)的菌株，并對其發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

魯氏酵母 魯花生物科技有限公司；液體麥芽汁 煙臺大學(xué)發(fā)酵工程實驗室。

1.2 實驗用培養(yǎng)基

1.2.1 液體麥芽汁培養(yǎng)基的制備

將液體麥芽汁進行解凍，按7.0 g/dL的比例加入NaCl，三角瓶分裝后,在121 ℃下蒸汽殺菌30 min。

1.2.2 固體麥芽汁培養(yǎng)基的制備

將上述所得的液體麥芽汁培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂，溶解、分裝后，121 ℃滅菌30 min。

1.2.3 酵母生長的液體培養(yǎng)基

醬油氨基酸氮0.25%，葡萄糖5%，鹽10%。

1.3 實驗方法[6]

1.3.1 魯氏酵母的分離純化

將魯氏酵母懸液充分搖勻，分別取5.0 mL接于3個500 mL滅過菌的液體麥芽汁培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩器上30 ℃培養(yǎng)36 h，觀察生長狀況。

酵母懸液的梯度稀釋：用移液管準確移取1.0 mL魯氏酵母懸液至9.0 mL的無菌水中，搖勻，然后進行梯度稀釋到10-7。

制作平板：將稀釋后的菌懸液用傾注法倒平板，置于30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，觀察生長狀況。

劃線分離：從上述的平板中找出長勢快的菌株，在平板上進行劃線分離，直到長出純的菌落，標記后斜面保存。

1.3.2 魯氏酵母生長曲線的測定

將純化好的3株魯氏酵母分別接入到酵母生長的液體培養(yǎng)基中，搖床150 r/min，28 ℃培養(yǎng)2天。

標準曲線的測定：取2個相同體積的離心管，分別用移液管準確移取10 mL的菌懸液，在4800 r/min的離心機離心15 min，棄去上清液，再加蒸餾水至10 mL，再次離心15 min，重復(fù)操作3次。 其中一個離心管中的菌泥，用少量的水完全轉(zhuǎn)移到已經(jīng)稱重過的小燒杯中，80 ℃干燥至恒重，記錄小燒杯和菌泥總重，得到菌泥的干重X；另一個離心管中的菌泥，轉(zhuǎn)移至10 mL的比色管中定容，搖勻后，按照濃度由大到小的原則，稀釋5個梯度，使得5個梯度的OD值在0.25～0.75，用1 cm比色皿測定在660 nm下的OD值，以酵母菌濃度X為橫坐標，用測得的吸光度A值為縱坐標，繪制酵母菌的標準曲線。

魯氏酵母濃度的測定：每隔2 h取樣，分別取10 mL菌液于離心管中，離心10 min(4800 r/min)，然后用蒸餾水清洗，再次離心，用分光光度計測出其吸光度，根據(jù)標準曲線計算菌體濃度，繪制魯氏酵母的生長曲線。

1.4 魯氏酵母培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.4.1 培養(yǎng)溫度對魯氏酵母生物量的影響

將魯氏酵母接入液體培養(yǎng)基中，分別置于26，28，30，32，34 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中(每個溫度設(shè)置3組平行)，培養(yǎng)36 h，測定菌體的濃度。

1.4.2 NaCl含量對魯氏酵母生物量的影響

將酵母接入液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中的NaCl濃度分別為6%，8%，10%，12%，14%(每組設(shè)3個平行)，于150 r/min搖床培養(yǎng)36 h，測定菌體的濃度。

1.4.3 pH值對魯氏酵母生物量的影響

將酵母接入液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中的pH值分別為4.0，4.5，5.0，5.5，6.0(每組設(shè)3個平行)，于150 r/min搖床培養(yǎng)36 h，測定菌體的濃度。

1.4.4 含氮量(醬油添加量)對魯氏酵母生物量的影響

在液體培養(yǎng)基中分別添加0.05%，0.15%，0.25%，0.35%，0.45%的醬油(每組設(shè)3個平行)，于150 r/min搖床培養(yǎng)36 h，測定菌體的濃度。

1.4.5 魯氏酵母生長條件的優(yōu)化

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，對以上四因素進行三水平的正交試驗，確定魯氏酵母的最適生長條件，因素水平表見表1。

表1 因素水平表

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 魯氏酵母標準曲線的制作

魯氏酵母的標準曲線見圖1。

圖1 魯氏酵母的標準曲線

由圖1可知，魯氏酵母的吸光度(0.3～0.8)和濃度之間線性關(guān)系良好。

2.2 溫度對魯氏酵母生物量的影響

溫度對魯氏酵母生物量的影響，見圖2。

圖2 溫度對魯氏酵母生物量的影響

由圖2可知，魯氏酵母菌的生物量隨著培養(yǎng)溫度的升高呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢，在30 ℃時達到最高，當溫度超過32 ℃，酵母的生物量開始急劇減少。

隨著培養(yǎng)溫度的升高，酵母體內(nèi)的酶活力也在增加，代謝加快，故酵母的生物量增加很快，但當溫度超過32 ℃時，酵母體內(nèi)的酶會迅速失活，代謝水平急劇下降，因而酵母的生物量也會急劇下降[7]。

2.3 氯化鈉濃度對魯氏酵母生物量的影響

氯化鈉濃度對魯氏酵母生物量的影響見圖3。

圖3 氯化鈉濃度對魯氏酵母生物量的影響

由圖3可知，當培養(yǎng)基中鹽濃度小于8%時，魯氏酵母的生物量隨培養(yǎng)基中鹽濃度的增加而增加，當鹽濃度超過8%時，魯氏酵母的生物量隨鹽濃度的增加而下降。

NaCl是魯氏酵母生長的重要因子，當培養(yǎng)基中的NaCl濃度較低時，限制魯氏酵母的生長，故魯氏酵母的生物量隨著NaCl濃度的增加而增加；但當培養(yǎng)基中NaCl濃度高于8%時，由于一方面高濃度的鹽會抑制酵母的生長，另一方面高濃度的鹽也會使培養(yǎng)基的滲透壓增加，超過了酵母能夠耐受的程度，也會使酵母的生物量下降。

2.4 pH值對魯氏酵母生物量的影響

pH值對魯氏酵母生物量的影響見圖4。

圖4 pH對魯氏酵母生物量的影響

由圖4可知，魯氏酵母菌在pH值為5時的生物量最高，pH值超過5時，隨著pH值的增加，魯氏酵母的生物量下降，過高或過低的pH都會影響魯氏酵母的生長。

2.5 含氮量對魯氏酵母生物量的影響

含氮量(醬油的添加量)對魯氏酵母生物量的影響見圖5。

圖5 含氮量對魯氏酵母生物量的影響

由圖5可知,含氮量會影響魯氏酵母的生長，當含氮量為0.15%時，此時的生物量最大，當超過了0.25%，魯氏酵母的生物量隨著含氮量的增加而減少。

氮源作為魯氏酵母生長的重要底物，在底物濃度不足時會對酵母的生長起到限制作用，而濃度過高又對酵母的生長起到抑制作用，而且濃度越大，對酵母的抑制作用也越大。

2.6 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表2。

表2 L9(34)正交試驗

續(xù) 表

由表2可知，選取的4個因素對酵母的生物量都有影響，其中溫度對酵母菌體濃度的影響最顯著，其余依次為鹽濃度、pH、含氮量。魯氏酵母生長的最優(yōu)組合為A2B2C2D2，此時鹽濃度為10%，溫度為30 ℃，pH值為5，含氮量為0.15%。

之后在魯氏酵母生長最優(yōu)條件下重新進行接種，培養(yǎng)3天，再測定酵母的菌體濃度，最后測得的菌體含量為35.73 g/L，含量高于實驗第二組A1B2C2D2的平均含量，所以通過正交試驗得到的優(yōu)化條件是可行的，可用于實際的生產(chǎn)。

3 結(jié)論

單因素試驗和正交試驗結(jié)果表明：復(fù)壯后的魯氏酵母的適合生長條件為溫度30℃，鹽濃度10%，pH值5，含氮量0.15%。

[1]徐高丹,陳敏,蔣予箭.酵母菌對釀造醬油風味形成的影響[J].中國調(diào)味品,2011,36(1):29-30.

[2]Kim Jong K.Hybridoma of ZygosaccharomycesrouxiiandTorulopsisversatiliswhich produce aromas of soy sauce[P]. United States: 5210034,1993.

[3]孫泰山.微生物在醬油釀造中的應(yīng)用[J].中小企業(yè)管理與科技(下旬刊)，2012(6):307.

[4]蔡金星,曹小紅,劉秀鳳.釀造醬油酵母純化、生長特性及初步應(yīng)用研究[D].天津：天津科技大學(xué),2004(5):1-2.

[5]林祖申.提高低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油質(zhì)量風味的研究與探討[J].中國釀造,2010(9):13-14.

[6]錢存柔.微生物學(xué)實驗教程[M].北京：北京大學(xué)出版社,2008.

[7]戚以政,汪叔雄.生物反應(yīng)動力學(xué)與反應(yīng)器[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2007.

Study on Rejuvenation and Culture Conditions of Saccharomyces rouxii

ZHANG Li-wen1, LIU Zhen-rong2

(1.Yantai Economic School,Yantai 264000, China；2.College of Life Science,Yantai University,Yantai 264005, China)

The degeneratedSaccharomycesrouxiiis purified and rejuvenated.The cultivation conditions are investigated as well. The optimal conditions for the growth ofSaccharomycesrouxiiare obtained by the methods of single-factor experiment and orthogonal test. The results show that the optimal conditions for the growth of rejuvenated strains are as follows: salt concentration is 8%, temperature is 30 ℃, pH is 5, nitrogen content is 0.15% respectively.

Saccharomycesrouxii; separation; purification

2016-12-10

張立文(1964-)，男，山東煙臺人，高級講師，研究方向：微生物發(fā)酵。

TS264.21

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.05.010

1000-9973(2017)05-0049-03