白細(xì)胞介素-9在肺結(jié)核患者血漿和T細(xì)胞中表達(dá)水平的研究

廖莎 霍鳳敏 楊新婷 唐神結(jié) 陳效友 孫照剛

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·論著·

白細(xì)胞介素-9在肺結(jié)核患者血漿和T細(xì)胞中表達(dá)水平的研究

廖莎 霍鳳敏 楊新婷 唐神結(jié) 陳效友 孫照剛

目的 比較肺結(jié)核患者、結(jié)核潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)者和健康人群血漿中白細(xì)胞介素-9(interleukin-9，IL-9)表達(dá)水平，以及各人群輔助性T細(xì)胞9(Th9)細(xì)胞亞群經(jīng)結(jié)核特異性早期分泌抗原靶蛋白6(early secreting antigen target 6 kD，ESAT-6)刺激前后的變化，探索IL-9的表達(dá)特點。方法 選取2015年4月至2016年4月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院結(jié)核科住院治療的43例初治肺結(jié)核患者作為肺結(jié)核組；LTBI 組和健康對照組均來自2015年12月于本院進(jìn)行體檢的健康體檢者，其中健康對照組33名，LTBI組38例。收集研究對象血漿，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測其血漿中IL-9水平；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組人群外周血單核淋巴細(xì)胞經(jīng)ESAT-6刺激前后Th9細(xì)胞的比率。結(jié)果 肺結(jié)核組血漿IL-9表達(dá)水平為175.04(149.67～221.70) pg/ml，LTBI組為60.21(48.43～102.37) pg/ml，健康對照組為88.19(73.82～113.79) pg/ml。肺結(jié)核組血漿IL-9表達(dá)水平明顯高于LTBI組(Z=7.64，P<0.01)和健康對照組(Z=5.18，P<0.01)。肺結(jié)核組Th9淋巴細(xì)胞比率為0.17% (0.14%～0.23%)，LTBI組為0.14%(0.10%～0.16%)，健康對照組為0.15%(0.11%～0.20%)，各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(H=4.45，P>0.05)。經(jīng)ESAT-6刺激培養(yǎng)后，肺結(jié)核組Th9細(xì)胞比率為0.11%(0.09%～0.14%)，LTBI組為0.10%(0.07%～0.12%)，健康對照組為0.11%(0.11%～0.14%)，三組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(H=1.13，P>0.05)；各組刺激前后Th9細(xì)胞比率，肺結(jié)核組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.20，P<0.05)；LTBI組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.32，P<0.05)。結(jié)論 IL-9在肺結(jié)核患者血漿中的表達(dá)水平高于LTBI者和健康人群，其對肺結(jié)核診斷具有一定的輔助價值。

結(jié)核，肺； 白細(xì)胞介素9； 酶聯(lián)免疫吸附測定； 流式細(xì)胞術(shù)； 評價研究

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的一種慢性傳染性疾病，全球約有1/3的人群感染MTB，約有5%～10%的結(jié)核潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)者發(fā)展為活動性結(jié)核病[1-2]。我國是結(jié)核病高發(fā)國家，LTBI率達(dá)44.5%[3]。現(xiàn)有的診斷方法，如結(jié)核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test，TST)和γ-干擾素釋放試驗(interferon gamma release assay，IGRA)等目前廣泛使用的結(jié)核病免疫診斷方法，不能滿足現(xiàn)實的需求[4-6]。因此，探索用于輔助診斷的新方法將有力促進(jìn)結(jié)核病的控制[7]。

白細(xì)胞介素-9(interleukin-9，IL-9)主要由新型效應(yīng)性T細(xì)胞Th9分泌，同時Th2、Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)、自然殺傷性T細(xì)胞(nature killer T cell，NKT)和肥大細(xì)胞等也可以分泌。IL-9是一種多效應(yīng)的細(xì)胞因子，在多種疾病中起著重要的應(yīng)答和調(diào)節(jié)作用[3]，其在活動性結(jié)核病患者血清中的分泌水平高于健康人群。但是，目前尚沒有系統(tǒng)比較IL-9在肺結(jié)核患者、LTBI者和健康人群中表達(dá)差異的研究。筆者通過檢測健康人群、LTBI者和肺結(jié)核患者血漿中IL-9表達(dá)水平，以及各人群Th9細(xì)胞亞群經(jīng)結(jié)核特異性早期分泌抗原靶蛋白6(early secreting antigen target 6 kD，ESAT-6)刺激前后的變化，探索IL-9的表達(dá)特點。

對象和方法

一、研究對象和樣本收集

選取2015年4月至2016年4月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院結(jié)核科住院治療的初治肺結(jié)核患者作為肺結(jié)核組，共43例；患者均經(jīng)臨床癥狀、胸部CT掃描、痰涂片抗酸染色、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及菌群鑒定確診，其中11例痰培養(yǎng)陽性，9例痰涂片抗酸染色陽性，其余23例經(jīng)病理學(xué)、影像學(xué)和GeneXpert檢測確診，且入組前治療時間均≤4周。排除慢性非傳染性疾病(如糖尿病、肺部腫瘤)、自身免疫性疾病(如腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等)、感染性疾病(如病毒性肝炎、寄生蟲感染等)、其他呼吸系統(tǒng)疾病患者，以及HIV感染者和免疫抑制劑使用者。

LTBI組和健康對照組均來自2015年12月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康體檢者。健康對照組共33名， TST硬結(jié)平均直徑均<5 mm，經(jīng)結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗(T-SPOT.TB)檢測提示MTB感染陰性，無咳嗽、咯痰、發(fā)熱等相關(guān)癥狀，無慢性病史，無呼吸系統(tǒng)疾病。LTBI組共38例， TST硬結(jié)平均直徑均>10 mm，T-SPOT.TB檢測陽性，均無咳嗽、咯痰、發(fā)熱等相關(guān)癥狀，胸部X線攝影檢查無異常，無慢性病史，無呼吸系統(tǒng)疾病。

所有研究對象均抽取4 ml靜脈血于肝素鈉抗凝管中備用。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象入組前均簽訂知情同意書。

二、主要設(shè)備和試劑

1.設(shè)備：流式細(xì)胞分析采用美國BD公司FACSCalibur型流式細(xì)胞儀，酶標(biāo)儀為美國Thermo Fisher公司生產(chǎn)。CO2培養(yǎng)箱購自上海Heal Force公司。離心機購自日本日立公司。

2.試劑：IL-9檢測試劑盒購自美國Cloud-Clone公司。單克隆抗體：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-APC、溶血素、阻斷劑均購自美國BD公司；IL-9-PE、固定劑和破膜劑均購自美國eBioscience公司；ESAT-6特異性抗原購自英國Oxford公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。

三、實驗檢測

1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)：取各組研究對象靜脈血液3 ml于肝素鈉抗凝管中，4 ℃離心15 min，離心轉(zhuǎn)速為3000 r/min，離心半徑為15 cm。收集上清于凍存管中，置于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。ELISA法檢測研究對象血漿IL-9水平，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

2.流式細(xì)胞術(shù)分析：取研究對象肝素鈉抗凝血0.5 ml于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入RPIM1640培養(yǎng)基充分混勻，總體積1 ml。研究對象均設(shè)置ESAT-6刺激培養(yǎng)組和未刺激組?？乖碳そM加入ESAT-6(終濃度為10 μg/ml)，未刺激組加入等體積RPMI1640培養(yǎng)基，充分混勻，置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃孵育。20 h后在培養(yǎng)體系中加入阻斷劑，終濃度為0.7 μl/ml，繼續(xù)培養(yǎng)5～6 h。進(jìn)行細(xì)胞表面CD3-PerCP、CD8-APC、溶血素、破膜劑、細(xì)胞內(nèi)IL-9-PE因子染色。具體操作均參照各抗體說明書進(jìn)行。應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行結(jié)果檢測分析。在淋巴細(xì)胞設(shè)門里分析CD3+細(xì)胞表達(dá)情況，在CD3+細(xì)胞設(shè)門里分析Th9細(xì)胞的表達(dá)情況。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、基本情況

肺結(jié)核組43例，其中，男23例(53.5%)，女20例(46.5%)，平均年齡(36.5±10.5)歲；LTBI組共38例，其中，男20例(52.6%)，女18例(47.4%)，平均年齡(34.4±12.9)歲；健康對照組共33名，其中，男18名(54.5%)，女15例(45.5%)，平均年齡(27.7±5.2)歲。三組研究對象年齡和性別構(gòu)成均衡可比(F=1.58，P=0.119；χ2=0.02，P=0.980)。

二、血漿IL-9水平檢測

肺結(jié)核組血漿IL-9表達(dá)水平為175.04(149.67～221.70) pg/ml，LTBI組為60.21(48.43～102.37) pg/ml，健康對照組為88.19(73.82～113.79) pg/ml。肺結(jié)核組血漿IL-9表達(dá)水平明顯高于LTBI組(Z=7.64，P<0.01)和健康對照組(Z=5.18，P<0.01)，健康對照組和LTBI組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.11，P>0.05)。

三、外周血單核細(xì)胞中Th9細(xì)胞比率

血漿中的IL-9主要來源于Th9淋巴細(xì)胞，因此，進(jìn)一步采用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測Th9淋巴細(xì)胞在外周血單核細(xì)胞中的比率。結(jié)果顯示，肺結(jié)核組Th9淋巴細(xì)胞比率為0.17% (0.14%～0.23%)，LTBI組為0.14%(0.10%～0.16%)，健康對照組為0.15%(0.11%～0.20%)，各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(H=4.45，P>0.05)。

四、抗原刺激對Th9細(xì)胞比率的影響

在結(jié)核特異性抗原ESAT-6刺激培養(yǎng)后，肺結(jié)核組Th9細(xì)胞比率為0.11%(0.09%～0.14%)，LTBI組為0.10%(0.07%～0.12%)，健康對照組為0.11%(0.11%～0.14%)，三組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(H=1.13，P>0.05)。分別比較各組研究對象經(jīng)ESAT-6刺激培養(yǎng)前后Th9細(xì)胞比率，肺結(jié)核組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.20，P<0.05)；LTBI組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.32，P<0.05)；健康對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-1.83，P>0.05)。

討 論

免疫學(xué)方法是一種簡單、快速、無創(chuàng)的結(jié)核病輔助診斷方法，本研究探索了IL-9在肺結(jié)核患者中的分泌特點及其潛在的應(yīng)用價值。IL-9是主要由新型效應(yīng)T細(xì)胞Th9淋巴細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子[8-9]，同時CD8+T細(xì)胞、γδ T細(xì)胞也有一定的分泌[10]。研究表明，IL-9 是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，參與機體多種疾病的免疫調(diào)節(jié)過程。研究發(fā)現(xiàn)，IL-9在諸如慢性乙型肝炎[11]、寄生蟲感染[12]等患病過程中表達(dá)升高，但在幽門螺旋桿菌感染中有不同的報道[13-14]。另有研究表明IL-9在肺結(jié)核患者血清中的表達(dá)水平高于健康人群[7,10]。本研究用ELISA方法檢測肺結(jié)核患者、LTBI者、健康對照者血漿中IL-9的表達(dá)水平，研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者血漿中IL-9的表達(dá)水平明顯高于健康對照者，與其他研究結(jié)果相似[7]，同時本研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者血漿中IL-9的表達(dá)水平明顯高于LTBI者。可見，血漿中IL-9水平的檢測對于結(jié)核病診斷有一定的輔助意義。

同時，筆者在細(xì)胞水平檢測了Th9細(xì)胞的比率，通過流式細(xì)胞技術(shù)分析研究對象經(jīng)結(jié)核特異性抗原ESAT-6刺激前后Th9細(xì)胞在外周血單核細(xì)胞中比率的變化。結(jié)果表明，肺結(jié)核患者Th9細(xì)胞比率與LTBI者及健康人群相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義?？紤]由于淋巴細(xì)胞亞群中Th9細(xì)胞的比率較低，流式細(xì)胞檢測術(shù)敏感度不足，因此，本次研究未能發(fā)現(xiàn)Th9細(xì)胞的比率在肺結(jié)核患者、LTBI者和健康人群間的差異。

研究發(fā)現(xiàn)，IL-9參與損傷Th1型細(xì)胞抗結(jié)核免疫反應(yīng)，IL-9的表達(dá)水平與γ-干擾素(IFN-γ)的表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)甚至拮抗關(guān)系，通過外原性中和IL-9或者敲除IL-9基因，可以明顯提高體內(nèi)外IFN-γ的表達(dá)水平[15]。同時，IFN-γ可以通過抑制IL-4的表達(dá)來降低IL-9的表達(dá)水平[16]。筆者發(fā)現(xiàn)，通過結(jié)核特異性抗原刺激后，肺結(jié)核患者Th9細(xì)胞比率明顯低于刺激前，可能因ESAT-6刺激外周血單核細(xì)胞后IFN-γ釋放水平上升，從而抑制IL-9的表達(dá)[14-15]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-9在肺結(jié)核患者血漿中的表達(dá)水平明顯高于LTBI者和健康對照者，提示有望通過檢測人群血漿IL-9來予以區(qū)分；肺結(jié)核患者血漿標(biāo)本經(jīng)結(jié)核特異性抗原刺激后，Th9細(xì)胞在外周血單核細(xì)胞中的比率降低，說明經(jīng)抗原刺激后流式細(xì)胞分析法并不適合Th9細(xì)胞比率的檢測。針對以上結(jié)論，還應(yīng)擴大樣本量進(jìn)一步研究；同時，本次研究未納入其他呼吸系統(tǒng)感染性疾病患者，對于IL-9在肺結(jié)核與其他呼吸系統(tǒng)疾病中的表達(dá)差異有待繼續(xù)探索。

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(本文編輯：李敬文)

A study of the interleukin-9 expression in plasma and T cells in pulmonary tuberculosis patients

LIAOSha,HUOFeng-min,YANGXin-ting,TANGShen-jie,CHENXiao-you,SUNZhao-gang.

NationalClinicalLaboratoryonTuberculosis,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

Correspondingauthor:SUNZhao-gang,Email:sunzg75@163.com

Objective To compare interleukin-9 (IL-9) expression in plasma and the proportion of Th9 cell subsets change before and after stimulated byMycobacteriumtuberculosisspecific early secreting antigen target 6 kD (ESAT-6) in pulmonary tuberculosis patients, latent tuberculosis infection (LTBI) ones and healthy-control people, in order to explore the feature of IL-9 expression. Methods A total of 43 pulmonary tuberculosis patients with initial treatment were selected from Department of Tuberculosis, Beijing Chest Hospital, Capital Medical University between April 2015 and April 2016. The LTBI group (n=38) and the healthy control group (n=33) were all from those who getting physical examination in our hospital on December 2015. Plasma levels of IL-9 were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), and the ratio of Th9 cells in peripheral blood mononuclear cells was measured by flow cytometry before and after stimulation with ESAT-6. Results The plasma level of IL-9 in pulmonary tuberculosis group, LTBI group, heathy-control group were 175.04 (149.67-221.70) pg/ml, 60.21 (48.43-102.37) pg/ml, and 88.19 (73.82-113.79) pg/ml respectively. The level of IL-9 in pulmonary tuberculosis group was significantly higher than those in LTBI group (Z=7.64,P<0.01) and heathy-control group (Z=5.18,P<0.01). Percents of Th9 in the three groups were 0.17% (0.14%-0.23%), 0.14% (0.10%-0.16%), and 0.15% (0.11%-0.20%) respectively; there was no statistical significance (H=4.45,P>0.05). After stimu-lated with ESAT-6, differences of percents of Th9 in the three groups were 0.11% (0.09%-0.14%), 0.10% (0.07%-0.12%), 0.11% (0.11%-0.14%) respectively and there was no statistical significance in the three groups (H=1.13,P>0.05). However, significant differences of Th9 before and after stimulated with ESAT-6 were found in in pulmonary tuberculosis group (Z=-3.20,P<0.05) and LTBI group (Z=-3.32,P<0.05). Conclusion The plasma level of IL-9 in pulmonary tuberculosis patients is significantly higher than those in LTBI or heathy-control ones, which has subsidiary value in the diagnosis of tuberculosis.

Tuberculosis, pulmonary; Interleukin-9; Enzyme-linked immunosorbent assay; Flow cytometry; Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.03.013

北京市醫(yī)院管理局臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展專項基金(ZYLX201304)；首都醫(yī)學(xué)發(fā)展專項基金(2016-2-1043)；北京結(jié)核病臨床數(shù)據(jù)和樣本資源庫項目(D131100005313012)

101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院國家結(jié)核病臨床實驗室(廖莎、霍鳳敏、孫照剛)，結(jié)核三科(楊新婷、陳效友)，結(jié)核一科(唐神結(jié))

孫照剛，Email:sunzg75@163.com

2016-09-06)