• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    治愈的肺結(jié)核患者治療前后血清蛋白雙向電泳初步比較分析

    2017-05-15 03:36:17楊瑜謝貝吳玲孟繁榮王楠雷杰張言斌彭德虎譚守勇劉志輝
    中國(guó)防癆雜志 2017年3期
    關(guān)鍵詞:結(jié)核病肺結(jié)核圖譜

    楊瑜 謝貝 吳玲 孟繁榮 王楠 雷杰 張言斌 彭德虎 譚守勇 劉志輝

    ?

    ·短篇論著·

    治愈的肺結(jié)核患者治療前后血清蛋白雙向電泳初步比較分析

    楊瑜 謝貝 吳玲 孟繁榮 王楠 雷杰 張言斌 彭德虎 譚守勇 劉志輝

    選取2013年于廣州市胸科醫(yī)院治療的初治肺結(jié)核,并經(jīng)1個(gè)常規(guī)抗結(jié)核治療療程(6個(gè)月)治愈的42例患者作為研究對(duì)象,采用雙向凝膠電泳技術(shù)(two dimension electrophoresis,2-DE)對(duì)研究對(duì)象治療前、后的混合血清全組蛋白進(jìn)行電泳分離,以PDQuest 8.0軟件根據(jù)蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)、等電點(diǎn)(isoelectric point,PI)、相對(duì)分子質(zhì)量(relative molecular mass,Mr)等進(jìn)行差異蛋白描述性分析。結(jié)果顯示,研究對(duì)象治療前、后差異蛋白點(diǎn)共有15個(gè),治療后血清相對(duì)應(yīng)差異蛋白有12個(gè)下調(diào),3個(gè)上調(diào),Mr為16 200~76 800,PI為5.0~6.8。由此可見(jiàn),治愈的肺結(jié)核患者治療前后血清中存在特異性的差異蛋白,差異蛋白可能作為結(jié)核病的重要診斷標(biāo)志物或者治療靶點(diǎn)。

    結(jié)核,肺; 血清; 雙向差異凝膠電泳; 蛋白質(zhì)組學(xué)

    常規(guī)的結(jié)核病診斷依賴影像、痰涂片和細(xì)菌培養(yǎng),存在敏感度低、特異度差、耗費(fèi)時(shí)間等問(wèn)題。因此,尋找新的診斷標(biāo)志物,建立敏感可靠的早期診斷方法,以及探討結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制是結(jié)核病防控和治療的首要任務(wù)。目前,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速,已成為篩選血清標(biāo)志物的有力工具[1]。本研究采用雙向凝膠電泳(two dimension electrophoresis,2-DE)技術(shù)對(duì)42例臨床已治愈的肺結(jié)核患者治療前、后血清標(biāo)本進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)比較分析,旨在發(fā)現(xiàn)結(jié)核病相關(guān)的差異蛋白,為肺結(jié)核的早期診斷、發(fā)病機(jī)制探索、病情監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

    資料和方法

    1.研究對(duì)象:選取2013年于廣州市胸科醫(yī)院治療的初治肺結(jié)核,并經(jīng)1個(gè)常規(guī)抗結(jié)核治療療程(6個(gè)月)治愈的42例患者作為研究對(duì)象,其中男25例,女17例;年齡17~78歲,平均(42.24±18.00)歲。研究對(duì)象均于抗結(jié)核治療前、后分別留取血清,并于廣州市胸科醫(yī)院生物樣本庫(kù)保存。肺結(jié)核臨床治愈的標(biāo)準(zhǔn)為:(1)臨床癥狀好轉(zhuǎn);(2)痰中抗酸桿菌陰轉(zhuǎn);(3)胸部X線攝影或CT掃描檢查顯示病灶明顯吸收或病灶穩(wěn)定;(4)空洞閉合或明顯縮小[2]。

    2.試劑與儀器:雙向電泳相關(guān)試劑固相pH梯度干膠條(IPG dry strip pH4-7,17 cm)、蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Quick StarTMBradford protein assay)、兩性電解質(zhì)Bio-lyte 3/10、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、考馬斯亮藍(lán)G250染料、碘乙酰胺、尿素、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司;三氯乙酸(TCA)、丙酮等為常規(guī)有機(jī)試劑。等電聚焦儀(Protean IEF cell)、垂直電泳系統(tǒng)(Protean Ⅱ xi cell)、投射掃描儀GS800和凝膠分析軟件PDQuest 8.0均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

    3. 2-DE樣品制備:為了更好地進(jìn)行2-DE凝膠圖片的比較分析,將研究對(duì)象治療前、后血清分別混合成3份電泳標(biāo)本,共計(jì)6份標(biāo)本(每個(gè)標(biāo)本含有14例患者治療前或后的血清),每個(gè)電泳標(biāo)本加入4倍體積的體積分?jǐn)?shù)為10%的冰TCA-丙酮混合液,振蕩混勻,置于冰上4 h;4 ℃,12 000 r/min離心10 min(離心半徑為7 cm),棄上清,加入1 ml 體積分?jǐn)?shù)為90%的冰丙酮重懸沉淀,離心,去上清,重復(fù)3次;上樣水化液1 ml溶解蛋白樣品。

    4.樣品濃度測(cè)定:根據(jù)蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白樣品濃度的測(cè)定。3份混合的患者治療前血清標(biāo)本的蛋白濃度分別為5.15、4.00、6.44 μg/μl;3份混合治療后患者血清標(biāo)本的蛋白濃度分別為5.03、3.39、4.62 μg/μl。

    5. 2-DE:(1)第一向電泳于等電聚焦儀上進(jìn)行,3組治療前、后的樣品膠上樣量約為600 μg,水化和聚焦程序設(shè)置為:50 V,12 h,15 ℃(水化);250 V線性,30 min(除鹽);1000 V 快速,1 h(除鹽);10 000 V線性,5 h(升壓);10 000 V快速,60 000 Vh(聚焦);500 V快速,任意時(shí)間(保持)。(2)聚焦結(jié)束后,將膠條先后置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的DTT和2.5%的碘乙酰胺的膠平衡液中輕搖各10 min。(3)第二向電泳于垂直電泳系統(tǒng)上進(jìn)行,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳[dodecyl sulfate,sodium salt (SDS)-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE]膠濃度為12%,電泳條件為:50 V,30 min;300 V,5 h;每組樣品重復(fù)3次。

    6.SDS-PAGE膠染色:采用膠體考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行凝膠染色,具體操作參考文獻(xiàn)[3]。

    7.凝膠圖譜分析:應(yīng)用PDQuest 8.0凝膠分析軟件分析治療前、后各份標(biāo)本的蛋白質(zhì)凝膠圖譜,根據(jù)蛋白的等電點(diǎn)(isoelectric point,PI)、相對(duì)分子質(zhì)量(relative molecular mass,Mr)、匹配度,確定治療前、后差異蛋白點(diǎn)。蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量以灰度值表示,蛋白點(diǎn)表達(dá)量升高或降低3倍以上者則認(rèn)為存在差異。

    結(jié) 果

    1.2-DE圖譜的建立:通過(guò)上述方法可獲得分辨率和重復(fù)率較高的血清蛋白2-DE圖譜。3組治療前、后混合配對(duì)電泳樣品的匹配率分別為(75±3)%、(77±4)%和(71±4)%;凝膠圖譜中清晰可辨的蛋白點(diǎn)數(shù)為(158±11)個(gè),Mr分布于12 000~102 000,PI為4.2~6.8,見(jiàn)圖1。

    2.差異蛋白分析:治療前與治療后的血清蛋白點(diǎn)比較,第1個(gè)配對(duì)組有24個(gè)差異蛋白點(diǎn),治療后血清相對(duì)應(yīng)差異蛋白有21個(gè)下調(diào),3個(gè)上調(diào);第2個(gè)配對(duì)組有31個(gè)差異蛋白點(diǎn),治療后血清相對(duì)應(yīng)差異蛋白有28個(gè)下調(diào),3個(gè)上調(diào);第3個(gè)配對(duì)組有18個(gè)差異蛋白點(diǎn),治療后血清相對(duì)應(yīng)差異蛋白有14個(gè)下調(diào),4個(gè)上調(diào)。綜合分析3個(gè)配對(duì)組治療前后蛋白圖譜,差異蛋白點(diǎn)共有15個(gè),Mr為16 200~76 800,PI為5.0~6.8,治療后血清相對(duì)應(yīng)差異蛋白有12個(gè)下調(diào),3個(gè)上調(diào),見(jiàn)圖1。3組治療前后共有的差異蛋白點(diǎn)具體信息見(jiàn)表1。

    圖1、2為第1組患者治療前后血清2-DE圖譜;圖3、4為第2組患者治療前后血清2-DE圖譜;圖5、6為第3組患者治療前后血清2-DE圖譜;箭頭所指為各配對(duì)組治療前、后相對(duì)應(yīng)的差異蛋白點(diǎn);點(diǎn)1~12為3個(gè)配對(duì)組患者治療后表達(dá)下調(diào)的共有差異蛋白點(diǎn);點(diǎn)13~15為3個(gè)配對(duì)組患者治療后表達(dá)上調(diào)的共有差異蛋白點(diǎn)圖1 肺結(jié)核治愈患者治療前后血清2-DE圖譜差異分析

    討 論

    血清是一種理想的生物樣本,易獲取,并且包含大量由病變組織釋放相關(guān)蛋白的生物信息。血清蛋白的快速變化可反映疾病發(fā)展的機(jī)制。因此,在血清或血漿中極有可能尋找到結(jié)核病相關(guān)的重要診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。目前,蛋白質(zhì)組學(xué)在血清標(biāo)志物研究上具有很大的優(yōu)勢(shì)[4]。已有學(xué)者通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究結(jié)核病患者與正常人血清蛋白的變化,發(fā)現(xiàn)一些與結(jié)核病相關(guān)的特異性蛋白點(diǎn)。Song等[5]應(yīng)用納米流動(dòng)超高效液相色譜和四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜比較分析結(jié)核病患者與正常人的血清蛋白,發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者血清α1-抗胰蛋白酶的表達(dá)較正常人高,是潛在的診斷標(biāo)志物。Li等[6]通過(guò)同位素標(biāo)記差異蛋白分析技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)發(fā)現(xiàn)性激素結(jié)合球蛋白(sex hormone-binding globulin,SHBG)有可能是結(jié)核病診斷新的標(biāo)志物。同樣應(yīng)用iTRAQ方法,Xu等[7]發(fā)現(xiàn)血清鈣結(jié)合蛋白S100A9、胞外超氧化物歧化酶3(extracellular superoxide dismutase,SOD3)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase,MMP9)可作為肺結(jié)核診斷的新標(biāo)志物,敏感度達(dá)到92.5%,特異度達(dá)到95.0%。由此可見(jiàn),通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在血清中尋找結(jié)核病早期診斷標(biāo)志物是一種必然的趨勢(shì),而且能為探討結(jié)核病發(fā)病機(jī)制或病情監(jiān)測(cè)提供豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),但目前依賴血清標(biāo)志物的簡(jiǎn)便、快速的結(jié)核病診斷方法仍未應(yīng)用于臨床。

    表1 肺結(jié)核治愈患者治療前后共有差異蛋白表達(dá)情況

    本研究應(yīng)用2-DE技術(shù)將42例治愈的肺結(jié)核患者治療前后血清分為3組,分析其蛋白差異,差異蛋白點(diǎn)數(shù)分別為24、31和18。組間出現(xiàn)差異蛋白點(diǎn)數(shù)不一致,也許跟各組患者年齡、性別、病情程度,以及不同批次的凝膠電泳條件不同有關(guān)。但本研究通過(guò)隨機(jī)分配及重復(fù)實(shí)驗(yàn)將組間差異降到最低。通過(guò)對(duì)比分析3組樣品的凝膠圖譜,明確患者治療前后存在相同的15個(gè)差異蛋白點(diǎn),其中,有12個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在抗結(jié)核治療后表達(dá)下調(diào),3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在治療后表達(dá)上調(diào)。肺結(jié)核在抗結(jié)核藥物治療后,體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌活性被抑制或殺滅,對(duì)機(jī)體組織或細(xì)胞產(chǎn)生免疫刺激減少,因此,這也許是治療后部分蛋白表達(dá)下調(diào)的原因。下調(diào)的蛋白點(diǎn)可能為治療肺結(jié)核的重要靶點(diǎn)及生物標(biāo)志物。而治療后表達(dá)上調(diào)的蛋白或許是細(xì)胞在疾病進(jìn)展過(guò)程中調(diào)節(jié)分泌的重要信號(hào)蛋白,上調(diào)的蛋白點(diǎn)可能為治療結(jié)核病的保護(hù)蛋白或耐藥蛋白。

    同時(shí)還發(fā)現(xiàn)15個(gè)差異蛋白的Mr為16 200~76 800,PI為 5.0~6.8。有的差異蛋白相對(duì)分子質(zhì)量相同,但PI不同,這種現(xiàn)象反映了這些蛋白有可能來(lái)源于同一前體蛋白,其只是同一前體蛋白通過(guò)不同的修飾作用后而得到的不同產(chǎn)物,而且這些來(lái)源于同一前體蛋白的幾種蛋白有可能共同參與了宿主或結(jié)核分枝桿菌的某一生命活動(dòng)。這跟筆者之前應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)對(duì)16例肺結(jié)核患者治療前后蛋白的研究有相似發(fā)現(xiàn)[8]。

    另外,本研究標(biāo)本為治愈的肺結(jié)核患者治療前后的血清,換言之,治愈后的血清即為正常人的血清,因此,本研究不僅明確了肺結(jié)核患者治療前后血清蛋白的差異,同時(shí)表明肺結(jié)核患者與正常人的血清蛋白存在差異,這與之前的研究結(jié)論相同[9]。

    總之,本研究表明肺結(jié)核患者治療前后血清蛋白凝膠圖譜存在明顯差異。這些差異蛋白點(diǎn)可能為結(jié)核病的重要診斷標(biāo)志物或者治療靶點(diǎn)。但本次實(shí)驗(yàn)仍有不足之處,尚未對(duì)這些差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定,且樣本量少。因此,下一步實(shí)驗(yàn)計(jì)劃將通過(guò)MALDI-TOF-MS或iTRAQ-LC-MS質(zhì)譜技術(shù),獲取差異蛋白序列,并通過(guò)蛋白免疫印跡法(Western blot)在蛋白水平及通過(guò)RT-PCR在基因水平進(jìn)行驗(yàn)證,以進(jìn)一步對(duì)差異蛋白的結(jié)構(gòu)和功能做出評(píng)價(jià)。

    [1] 張霞, 張宗德, 李琦. 結(jié)核病的體液蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2013, 36(3): 207-209.

    [2] 屠德華, 萬(wàn)利亞, 王黎霞. 現(xiàn)代結(jié)核病控制理論與實(shí)踐. 2版. 北京: 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社, 2013:152-153.

    [3] 郭葆玉. 基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及常見(jiàn)問(wèn)題對(duì)策. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2010: 249-251.

    [4] Ray S, Reddy PJ, Jain R, et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics, 2011, 11(11): 2139-2161.

    [5] Song SH, Han M, Choi YS, et al. Proteomic profiling of serum from patients with tuberculosis. Ann Lab Med, 2014, 34(5): 345-353.

    [6] Li C, He X, Li H, et al. Discovery and verification of serum differential expression proteins for pulmonary tuberculosis. Tuberculosis (Edinb), 2015, 95(5): 547-554.

    [7] Xu D, Li Y, Li X, et al. Serum protein S100A9, SOD3, and MMP9 as new diagnostic biomarkers for pulmonary tuberculosis by iTRAQ-coupled two-dimensional LC-MS/MS. Proteomics, 2015, 15(1): 58-67.

    [8] 尹小毛, 劉志輝, 劉玉美, 等. 肺結(jié)核患者強(qiáng)化治療前后血清差異蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析. 臨床肺科雜志, 2010, 15(5): 697-698.

    [9] 劉志輝, 劉玉美, 云徑平, 等. 結(jié)核病患者和正常人血清蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳差異比較. 廣東醫(yī)學(xué), 2008, 29(12): 1991-1993.

    (本文編輯:李敬文)

    Preliminary comparative analysis of serum proteins from cured pateints with pulmonary tuberculosis before and after treatment by two dimension electrophoresis

    YANGYu,XIEBei,WULing,MENGFan-rong,WANGNan,LEIJie,ZHANGYan-bin,PENGDe-hu,TANShou-yong,LIUZhi-hui.

    LungDiseaseInstituteofGuangzhouChestHospital,Guangzhou510095,China

    Correspondingauthor:LIUZhi-hui,Email:liuyixi2005@163.com

    A total of 42 new tuberculosis (TB) cases seeking health care in Guangzhou Chest Hospital in 2013 were enrolled in this study. All the patients were cured after 6-month first-line anti-TB regimen. The two-dimensions electrophoresis (2-DE) was performed to separate the whole blood protein of patients at the initial and end of treatment, respectively. In addition, the isoelectric point (PI) and the relative molecular mass (Mr) were determined by PDQuest 8.0 software. Our results revealed that there were 15 protein spots exhibiting different profiles between these two periods. In addition, the expression levels of 12 protein spots of the post-treatment period were significantly higher than those of the pre-treatment period, while 3 protein spots were significantly decreased after anti-TB treatment. TheMrvalues of these proteins ranged from 16 200-76 800, and the PI values were from 5.0-6.8. On the basis of our findings, there were specific differential serum proteins in the cured tuberculosis patients before and after treatment. The differential proteins might serve as important diagnostic markers or therapeutic targets of TB.

    Tuberculosis, pulmonary; Serum; Two-dimensional difference gel electrophoresis; Proteomics

    10.3969/j.issn.1000-6621.2017.03.023

    廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014Y2-00117、155700012);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B021800060)

    510095 廣州市胸科醫(yī)院肺部疾病研究所(楊瑜、謝貝、吳玲、孟繁榮、王楠、雷杰、劉志輝),結(jié)核內(nèi)科(張言斌、彭德虎、譚守勇)

    劉志輝,Email:liuyixi2005@163.com

    2016-09-06)

    猜你喜歡
    結(jié)核病肺結(jié)核圖譜
    世界防治結(jié)核病日
    警惕卷土重來(lái)的結(jié)核病
    繪一張成長(zhǎng)圖譜
    愛(ài)情是一場(chǎng)肺結(jié)核,熱戀則是一場(chǎng)感冒
    海峽姐妹(2018年4期)2018-05-19 02:13:00
    補(bǔ)腎強(qiáng)身片UPLC指紋圖譜
    中成藥(2017年3期)2017-05-17 06:09:01
    主動(dòng)對(duì)接你思維的知識(shí)圖譜
    蒙西醫(yī)結(jié)合治療肺結(jié)核進(jìn)展
    疣狀皮膚結(jié)核合并繼發(fā)型肺結(jié)核1例
    算好結(jié)核病防治經(jīng)濟(jì)賬
    IL-17在結(jié)核病免疫應(yīng)答中的作用
    欧美日韩视频高清一区二区三区二| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产av码专区亚洲av| 国产一区二区三区av在线| 国产av不卡久久| 国产成人a∨麻豆精品| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩成人伦理影院| 精品一区二区三区人妻视频| 国产精品一及| 亚洲精品国产av成人精品| 三级国产精品片| 真实男女啪啪啪动态图| av.在线天堂| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 最近视频中文字幕2019在线8| 午夜老司机福利剧场| 18禁动态无遮挡网站| 国产又色又爽无遮挡免| 男女边摸边吃奶| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产免费视频播放在线视频 | 全区人妻精品视频| av免费在线看不卡| 丰满少妇做爰视频| 中文在线观看免费www的网站| 久久久亚洲精品成人影院| 美女国产视频在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 婷婷色av中文字幕| av在线亚洲专区| ponron亚洲| 亚州av有码| 亚洲精品影视一区二区三区av| 欧美 日韩 精品 国产| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲欧美精品专区久久| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久久精品夜色国产| 欧美高清成人免费视频www| 久久热精品热| 91久久精品国产一区二区三区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产精品国产三级专区第一集| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲av在线观看美女高潮| 黄色配什么色好看| 草草在线视频免费看| av在线播放精品| 欧美3d第一页| 岛国毛片在线播放| 国产 一区精品| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 精品国内亚洲2022精品成人| 免费观看在线日韩| 欧美日韩在线观看h| 亚洲av国产av综合av卡| 一级毛片电影观看| 成人特级av手机在线观看| 青青草视频在线视频观看| 国产亚洲最大av| 天美传媒精品一区二区| 老司机影院成人| 99久国产av精品国产电影| 又爽又黄a免费视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 人体艺术视频欧美日本| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 嫩草影院新地址| 国产黄片视频在线免费观看| av女优亚洲男人天堂| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 免费无遮挡裸体视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 色吧在线观看| av卡一久久| 三级毛片av免费| 亚洲精品456在线播放app| 免费少妇av软件| 特级一级黄色大片| 日韩av在线免费看完整版不卡| 97超视频在线观看视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲美女搞黄在线观看| 大香蕉久久网| 免费观看a级毛片全部| 视频中文字幕在线观看| 成年人午夜在线观看视频 | 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 校园人妻丝袜中文字幕| 毛片女人毛片| 99久久人妻综合| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 中文资源天堂在线| 男女边摸边吃奶| 久久久久久伊人网av| 精品午夜福利在线看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产精品伦人一区二区| 成人午夜精彩视频在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国国产精品蜜臀av免费| 一区二区三区免费毛片| 亚洲精品成人av观看孕妇| 午夜免费男女啪啪视频观看| 22中文网久久字幕| 久久人人爽人人爽人人片va| 午夜福利视频精品| 韩国高清视频一区二区三区| 中文字幕久久专区| 国产伦在线观看视频一区| 日韩人妻高清精品专区| av免费在线看不卡| 18禁在线播放成人免费| 国产亚洲一区二区精品| 日日啪夜夜爽| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 欧美高清成人免费视频www| 伦理电影大哥的女人| 国产不卡一卡二| 日韩av免费高清视频| 毛片一级片免费看久久久久| 乱系列少妇在线播放| 熟妇人妻不卡中文字幕| 欧美变态另类bdsm刘玥| 免费av不卡在线播放| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲av.av天堂| 卡戴珊不雅视频在线播放| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久久久久九九精品二区国产| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 精品久久久久久久久av| 亚洲av不卡在线观看| 黄色日韩在线| 欧美另类一区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久久精品94久久精品| 国产91av在线免费观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 深爱激情五月婷婷| 国产成人精品一,二区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 两个人视频免费观看高清| 最近最新中文字幕大全电影3| 成人毛片60女人毛片免费| 搡老乐熟女国产| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美最新免费一区二区三区| 国产成人精品婷婷| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲经典国产精华液单| av一本久久久久| 18禁动态无遮挡网站| av.在线天堂| 国产高清国产精品国产三级 | 熟女人妻精品中文字幕| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 高清av免费在线| 欧美丝袜亚洲另类| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 有码 亚洲区| 国产精品伦人一区二区| ponron亚洲| 91在线精品国自产拍蜜月| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| av在线播放精品| 国产成人精品一,二区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 六月丁香七月| 中文字幕av在线有码专区| av免费观看日本| 一本久久精品| www.av在线官网国产| 亚洲av免费在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 永久免费av网站大全| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 国产黄色免费在线视频| 国内精品宾馆在线| www.av在线官网国产| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 日本-黄色视频高清免费观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 免费黄网站久久成人精品| 午夜福利网站1000一区二区三区| 成人漫画全彩无遮挡| 韩国av在线不卡| 国产淫语在线视频| 特级一级黄色大片| 国产精品国产三级专区第一集| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 卡戴珊不雅视频在线播放| 成人二区视频| 99久久精品一区二区三区| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲综合色惰| 久久97久久精品| 久热久热在线精品观看| 99久久精品一区二区三区| 91久久精品电影网| 欧美精品国产亚洲| 婷婷色综合www| 国产大屁股一区二区在线视频| 插逼视频在线观看| 在线观看一区二区三区| 深爱激情五月婷婷| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲欧美日韩东京热| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲第一区二区三区不卡| 综合色丁香网| 亚洲人成网站在线观看播放| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久草成人影院| 亚洲av日韩在线播放| 国精品久久久久久国模美| 联通29元200g的流量卡| 日本午夜av视频| 国产精品一区www在线观看| 十八禁网站网址无遮挡 | 国产伦一二天堂av在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 天堂影院成人在线观看| 成人国产麻豆网| 久久精品国产亚洲网站| 边亲边吃奶的免费视频| 性色avwww在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 国产成人福利小说| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 99久久九九国产精品国产免费| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲三级黄色毛片| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 欧美+日韩+精品| 免费观看a级毛片全部| 国产精品日韩av在线免费观看| 禁无遮挡网站| 欧美高清性xxxxhd video| 伦理电影大哥的女人| 婷婷六月久久综合丁香| 精品久久久久久久末码| 在线观看人妻少妇| 国内精品美女久久久久久| 有码 亚洲区| 在线免费十八禁| 午夜免费观看性视频| 国产极品天堂在线| 听说在线观看完整版免费高清| 男人狂女人下面高潮的视频| 黄色一级大片看看| 七月丁香在线播放| 五月天丁香电影| 中文字幕av在线有码专区| 2022亚洲国产成人精品| 91在线精品国自产拍蜜月| 波多野结衣巨乳人妻| 美女黄网站色视频| 亚洲精品一区蜜桃| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲人成网站在线播| 男人舔奶头视频| 精品欧美国产一区二区三| 夫妻性生交免费视频一级片| 91在线精品国自产拍蜜月| 18+在线观看网站| 五月天丁香电影| 99re6热这里在线精品视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 青春草视频在线免费观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 又爽又黄无遮挡网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲精品日本国产第一区| 在线a可以看的网站| 午夜亚洲福利在线播放| 国产成人一区二区在线| 嫩草影院精品99| 精品一区二区三卡| av又黄又爽大尺度在线免费看| 99久久人妻综合| av国产免费在线观看| 一级黄片播放器| 人妻夜夜爽99麻豆av| 性色avwww在线观看| 少妇高潮的动态图| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产精品99久久久久久久久| 乱人视频在线观看| 尾随美女入室| 免费大片18禁| 91狼人影院| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲自偷自拍三级| 又爽又黄a免费视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲人成网站在线播| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 一个人免费在线观看电影| 欧美潮喷喷水| 我的女老师完整版在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网 | 毛片一级片免费看久久久久| h日本视频在线播放| 两个人视频免费观看高清| 亚洲性久久影院| 日韩强制内射视频| 久久久精品免费免费高清| 亚洲精品色激情综合| 精品人妻一区二区三区麻豆| 色吧在线观看| 国产成人a区在线观看| 国产精品一及| 国产成人精品一,二区| 免费电影在线观看免费观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久久成人免费电影| 成年av动漫网址| 美女主播在线视频| 亚洲久久久久久中文字幕| eeuss影院久久| 成人鲁丝片一二三区免费| 只有这里有精品99| 日本黄色片子视频| 免费观看a级毛片全部| 欧美丝袜亚洲另类| 日韩欧美精品v在线| 青春草国产在线视频| 日韩av不卡免费在线播放| 久久久久精品性色| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 能在线免费观看的黄片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 乱系列少妇在线播放| 中文天堂在线官网| 99热6这里只有精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 精品一区在线观看国产| 99久久精品一区二区三区| 亚洲内射少妇av| 啦啦啦韩国在线观看视频| 天堂√8在线中文| 亚洲三级黄色毛片| 一级毛片电影观看| 亚洲无线观看免费| 日日干狠狠操夜夜爽| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 嫩草影院新地址| 久久鲁丝午夜福利片| 一夜夜www| 特级一级黄色大片| 91久久精品国产一区二区成人| 天天一区二区日本电影三级| 日韩av在线大香蕉| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 伦精品一区二区三区| 听说在线观看完整版免费高清| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 免费观看性生交大片5| 看免费成人av毛片| 午夜福利在线观看吧| 欧美区成人在线视频| 日韩欧美精品免费久久| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 免费人成在线观看视频色| 麻豆国产97在线/欧美| 久久久精品免费免费高清| a级毛片免费高清观看在线播放| 99久久精品一区二区三区| a级毛片免费高清观看在线播放| 免费看不卡的av| 欧美性感艳星| 黄色配什么色好看| 能在线免费看毛片的网站| 在线天堂最新版资源| 午夜精品在线福利| 亚洲精品自拍成人| 91精品国产九色| 男女下面进入的视频免费午夜| 成人亚洲精品av一区二区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产久久久一区二区三区| 久久久久久久久大av| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲av.av天堂| 成人美女网站在线观看视频| 欧美另类一区| 亚洲在久久综合| 69人妻影院| 大香蕉久久网| 免费观看的影片在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产成人aa在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 别揉我奶头 嗯啊视频| 99热网站在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 色哟哟·www| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产精品1区2区在线观看.| 性色avwww在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 中文欧美无线码| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 十八禁国产超污无遮挡网站| 丰满乱子伦码专区| 99re6热这里在线精品视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久久色成人| 神马国产精品三级电影在线观看| 极品教师在线视频| 美女黄网站色视频| 久久久久久久久中文| 偷拍熟女少妇极品色| 色综合色国产| 99久久精品国产国产毛片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 美女大奶头视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 一级毛片 在线播放| 欧美97在线视频| 国产亚洲最大av| 日本熟妇午夜| 最近手机中文字幕大全| 久久久久久久久久人人人人人人| 欧美性感艳星| 婷婷色综合大香蕉| 国产久久久一区二区三区| 久久精品人妻少妇| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品一区二区在线观看99 | 久久久久久伊人网av| 久久人人爽人人片av| 欧美日韩综合久久久久久| av.在线天堂| 免费大片18禁| 99视频精品全部免费 在线| 成人av在线播放网站| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 黑人高潮一二区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 成人午夜高清在线视频| 在线天堂最新版资源| 国产麻豆成人av免费视频| 免费观看a级毛片全部| 国产在视频线在精品| 亚洲欧洲日产国产| 免费大片黄手机在线观看| 午夜老司机福利剧场| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲av免费在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 男女视频在线观看网站免费| av在线蜜桃| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲国产精品专区欧美| 成年女人在线观看亚洲视频 | 日本黄色片子视频| 亚洲av男天堂| 免费看不卡的av| 国产免费视频播放在线视频 | 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 精品久久久久久久久av| 精品久久久噜噜| 日韩制服骚丝袜av| 国产精品久久久久久久久免| 免费观看av网站的网址| 天天躁日日操中文字幕| 人体艺术视频欧美日本| 午夜激情欧美在线| 亚洲国产av新网站| 亚洲人成网站在线观看播放| 嫩草影院入口| 亚洲精品视频女| 成年av动漫网址| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日韩国内少妇激情av| 免费观看的影片在线观看| 只有这里有精品99| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 国产色爽女视频免费观看| 中国国产av一级| 亚洲成人av在线免费| 97精品久久久久久久久久精品| 最新中文字幕久久久久| 成人综合一区亚洲| 天美传媒精品一区二区| 精品一区二区三区人妻视频| 极品教师在线视频| 2018国产大陆天天弄谢| 大香蕉久久网| 亚洲欧美一区二区三区国产| 搡女人真爽免费视频火全软件| 日韩欧美一区视频在线观看 | 身体一侧抽搐| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美人与善性xxx| 毛片女人毛片| 免费观看a级毛片全部| 精品久久久噜噜| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 777米奇影视久久| 内射极品少妇av片p| 婷婷色综合www| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 伊人久久国产一区二区| 听说在线观看完整版免费高清| 精品国产露脸久久av麻豆 | 日韩人妻高清精品专区| 久久精品国产亚洲av天美| 久久久精品94久久精品| 久久久久久久久久人人人人人人| 99热这里只有是精品在线观看| 一级毛片 在线播放| 国产伦一二天堂av在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品人妻视频免费看| 欧美一级a爱片免费观看看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 国产淫语在线视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲精品视频女| 中文在线观看免费www的网站| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美区成人在线视频| 欧美3d第一页| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲人与动物交配视频| 久久久久久久久大av| 国产成人一区二区在线| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久久久精品久久久久真实原创| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲欧美日韩无卡精品| 成年女人在线观看亚洲视频 | 老女人水多毛片| 免费大片18禁| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美性感艳星| 成人毛片60女人毛片免费| 九九爱精品视频在线观看| 搡老乐熟女国产| 天堂中文最新版在线下载 | 精品久久久噜噜| 色播亚洲综合网| 国产精品国产三级专区第一集| 国产成人a区在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| freevideosex欧美| 亚洲av成人精品一区久久| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 尾随美女入室| 国产片特级美女逼逼视频| 99久久精品热视频| 99re6热这里在线精品视频| 能在线免费观看的黄片| 久久久久久久久大av| 日本熟妇午夜| 97精品久久久久久久久久精品| 在线免费观看的www视频| 亚洲欧美日韩东京热| 免费黄色在线免费观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 黄色一级大片看看| 国产乱来视频区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久草成人影院| 91久久精品国产一区二区三区| 国产熟女欧美一区二区| 午夜精品国产一区二区电影 | 久久久久九九精品影院| 97人妻精品一区二区三区麻豆|