• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    治愈的肺結(jié)核患者治療前后血清蛋白雙向電泳初步比較分析

    2017-05-15 03:36:17楊瑜謝貝吳玲孟繁榮王楠雷杰張言斌彭德虎譚守勇劉志輝
    中國(guó)防癆雜志 2017年3期
    關(guān)鍵詞:結(jié)核病肺結(jié)核圖譜

    楊瑜 謝貝 吳玲 孟繁榮 王楠 雷杰 張言斌 彭德虎 譚守勇 劉志輝

    ?

    ·短篇論著·

    治愈的肺結(jié)核患者治療前后血清蛋白雙向電泳初步比較分析

    楊瑜 謝貝 吳玲 孟繁榮 王楠 雷杰 張言斌 彭德虎 譚守勇 劉志輝

    選取2013年于廣州市胸科醫(yī)院治療的初治肺結(jié)核,并經(jīng)1個(gè)常規(guī)抗結(jié)核治療療程(6個(gè)月)治愈的42例患者作為研究對(duì)象,采用雙向凝膠電泳技術(shù)(two dimension electrophoresis,2-DE)對(duì)研究對(duì)象治療前、后的混合血清全組蛋白進(jìn)行電泳分離,以PDQuest 8.0軟件根據(jù)蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)、等電點(diǎn)(isoelectric point,PI)、相對(duì)分子質(zhì)量(relative molecular mass,Mr)等進(jìn)行差異蛋白描述性分析。結(jié)果顯示,研究對(duì)象治療前、后差異蛋白點(diǎn)共有15個(gè),治療后血清相對(duì)應(yīng)差異蛋白有12個(gè)下調(diào),3個(gè)上調(diào),Mr為16 200~76 800,PI為5.0~6.8。由此可見(jiàn),治愈的肺結(jié)核患者治療前后血清中存在特異性的差異蛋白,差異蛋白可能作為結(jié)核病的重要診斷標(biāo)志物或者治療靶點(diǎn)。

    結(jié)核,肺; 血清; 雙向差異凝膠電泳; 蛋白質(zhì)組學(xué)

    常規(guī)的結(jié)核病診斷依賴影像、痰涂片和細(xì)菌培養(yǎng),存在敏感度低、特異度差、耗費(fèi)時(shí)間等問(wèn)題。因此,尋找新的診斷標(biāo)志物,建立敏感可靠的早期診斷方法,以及探討結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制是結(jié)核病防控和治療的首要任務(wù)。目前,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速,已成為篩選血清標(biāo)志物的有力工具[1]。本研究采用雙向凝膠電泳(two dimension electrophoresis,2-DE)技術(shù)對(duì)42例臨床已治愈的肺結(jié)核患者治療前、后血清標(biāo)本進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)比較分析,旨在發(fā)現(xiàn)結(jié)核病相關(guān)的差異蛋白,為肺結(jié)核的早期診斷、發(fā)病機(jī)制探索、病情監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

    資料和方法

    1.研究對(duì)象:選取2013年于廣州市胸科醫(yī)院治療的初治肺結(jié)核,并經(jīng)1個(gè)常規(guī)抗結(jié)核治療療程(6個(gè)月)治愈的42例患者作為研究對(duì)象,其中男25例,女17例;年齡17~78歲,平均(42.24±18.00)歲。研究對(duì)象均于抗結(jié)核治療前、后分別留取血清,并于廣州市胸科醫(yī)院生物樣本庫(kù)保存。肺結(jié)核臨床治愈的標(biāo)準(zhǔn)為:(1)臨床癥狀好轉(zhuǎn);(2)痰中抗酸桿菌陰轉(zhuǎn);(3)胸部X線攝影或CT掃描檢查顯示病灶明顯吸收或病灶穩(wěn)定;(4)空洞閉合或明顯縮小[2]。

    2.試劑與儀器:雙向電泳相關(guān)試劑固相pH梯度干膠條(IPG dry strip pH4-7,17 cm)、蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Quick StarTMBradford protein assay)、兩性電解質(zhì)Bio-lyte 3/10、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、考馬斯亮藍(lán)G250染料、碘乙酰胺、尿素、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司;三氯乙酸(TCA)、丙酮等為常規(guī)有機(jī)試劑。等電聚焦儀(Protean IEF cell)、垂直電泳系統(tǒng)(Protean Ⅱ xi cell)、投射掃描儀GS800和凝膠分析軟件PDQuest 8.0均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

    3. 2-DE樣品制備:為了更好地進(jìn)行2-DE凝膠圖片的比較分析,將研究對(duì)象治療前、后血清分別混合成3份電泳標(biāo)本,共計(jì)6份標(biāo)本(每個(gè)標(biāo)本含有14例患者治療前或后的血清),每個(gè)電泳標(biāo)本加入4倍體積的體積分?jǐn)?shù)為10%的冰TCA-丙酮混合液,振蕩混勻,置于冰上4 h;4 ℃,12 000 r/min離心10 min(離心半徑為7 cm),棄上清,加入1 ml 體積分?jǐn)?shù)為90%的冰丙酮重懸沉淀,離心,去上清,重復(fù)3次;上樣水化液1 ml溶解蛋白樣品。

    4.樣品濃度測(cè)定:根據(jù)蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白樣品濃度的測(cè)定。3份混合的患者治療前血清標(biāo)本的蛋白濃度分別為5.15、4.00、6.44 μg/μl;3份混合治療后患者血清標(biāo)本的蛋白濃度分別為5.03、3.39、4.62 μg/μl。

    5. 2-DE:(1)第一向電泳于等電聚焦儀上進(jìn)行,3組治療前、后的樣品膠上樣量約為600 μg,水化和聚焦程序設(shè)置為:50 V,12 h,15 ℃(水化);250 V線性,30 min(除鹽);1000 V 快速,1 h(除鹽);10 000 V線性,5 h(升壓);10 000 V快速,60 000 Vh(聚焦);500 V快速,任意時(shí)間(保持)。(2)聚焦結(jié)束后,將膠條先后置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的DTT和2.5%的碘乙酰胺的膠平衡液中輕搖各10 min。(3)第二向電泳于垂直電泳系統(tǒng)上進(jìn)行,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳[dodecyl sulfate,sodium salt (SDS)-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE]膠濃度為12%,電泳條件為:50 V,30 min;300 V,5 h;每組樣品重復(fù)3次。

    6.SDS-PAGE膠染色:采用膠體考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行凝膠染色,具體操作參考文獻(xiàn)[3]。

    7.凝膠圖譜分析:應(yīng)用PDQuest 8.0凝膠分析軟件分析治療前、后各份標(biāo)本的蛋白質(zhì)凝膠圖譜,根據(jù)蛋白的等電點(diǎn)(isoelectric point,PI)、相對(duì)分子質(zhì)量(relative molecular mass,Mr)、匹配度,確定治療前、后差異蛋白點(diǎn)。蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量以灰度值表示,蛋白點(diǎn)表達(dá)量升高或降低3倍以上者則認(rèn)為存在差異。

    結(jié) 果

    1.2-DE圖譜的建立:通過(guò)上述方法可獲得分辨率和重復(fù)率較高的血清蛋白2-DE圖譜。3組治療前、后混合配對(duì)電泳樣品的匹配率分別為(75±3)%、(77±4)%和(71±4)%;凝膠圖譜中清晰可辨的蛋白點(diǎn)數(shù)為(158±11)個(gè),Mr分布于12 000~102 000,PI為4.2~6.8,見(jiàn)圖1。

    2.差異蛋白分析:治療前與治療后的血清蛋白點(diǎn)比較,第1個(gè)配對(duì)組有24個(gè)差異蛋白點(diǎn),治療后血清相對(duì)應(yīng)差異蛋白有21個(gè)下調(diào),3個(gè)上調(diào);第2個(gè)配對(duì)組有31個(gè)差異蛋白點(diǎn),治療后血清相對(duì)應(yīng)差異蛋白有28個(gè)下調(diào),3個(gè)上調(diào);第3個(gè)配對(duì)組有18個(gè)差異蛋白點(diǎn),治療后血清相對(duì)應(yīng)差異蛋白有14個(gè)下調(diào),4個(gè)上調(diào)。綜合分析3個(gè)配對(duì)組治療前后蛋白圖譜,差異蛋白點(diǎn)共有15個(gè),Mr為16 200~76 800,PI為5.0~6.8,治療后血清相對(duì)應(yīng)差異蛋白有12個(gè)下調(diào),3個(gè)上調(diào),見(jiàn)圖1。3組治療前后共有的差異蛋白點(diǎn)具體信息見(jiàn)表1。

    圖1、2為第1組患者治療前后血清2-DE圖譜;圖3、4為第2組患者治療前后血清2-DE圖譜;圖5、6為第3組患者治療前后血清2-DE圖譜;箭頭所指為各配對(duì)組治療前、后相對(duì)應(yīng)的差異蛋白點(diǎn);點(diǎn)1~12為3個(gè)配對(duì)組患者治療后表達(dá)下調(diào)的共有差異蛋白點(diǎn);點(diǎn)13~15為3個(gè)配對(duì)組患者治療后表達(dá)上調(diào)的共有差異蛋白點(diǎn)圖1 肺結(jié)核治愈患者治療前后血清2-DE圖譜差異分析

    討 論

    血清是一種理想的生物樣本,易獲取,并且包含大量由病變組織釋放相關(guān)蛋白的生物信息。血清蛋白的快速變化可反映疾病發(fā)展的機(jī)制。因此,在血清或血漿中極有可能尋找到結(jié)核病相關(guān)的重要診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。目前,蛋白質(zhì)組學(xué)在血清標(biāo)志物研究上具有很大的優(yōu)勢(shì)[4]。已有學(xué)者通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究結(jié)核病患者與正常人血清蛋白的變化,發(fā)現(xiàn)一些與結(jié)核病相關(guān)的特異性蛋白點(diǎn)。Song等[5]應(yīng)用納米流動(dòng)超高效液相色譜和四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜比較分析結(jié)核病患者與正常人的血清蛋白,發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者血清α1-抗胰蛋白酶的表達(dá)較正常人高,是潛在的診斷標(biāo)志物。Li等[6]通過(guò)同位素標(biāo)記差異蛋白分析技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)發(fā)現(xiàn)性激素結(jié)合球蛋白(sex hormone-binding globulin,SHBG)有可能是結(jié)核病診斷新的標(biāo)志物。同樣應(yīng)用iTRAQ方法,Xu等[7]發(fā)現(xiàn)血清鈣結(jié)合蛋白S100A9、胞外超氧化物歧化酶3(extracellular superoxide dismutase,SOD3)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase,MMP9)可作為肺結(jié)核診斷的新標(biāo)志物,敏感度達(dá)到92.5%,特異度達(dá)到95.0%。由此可見(jiàn),通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在血清中尋找結(jié)核病早期診斷標(biāo)志物是一種必然的趨勢(shì),而且能為探討結(jié)核病發(fā)病機(jī)制或病情監(jiān)測(cè)提供豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),但目前依賴血清標(biāo)志物的簡(jiǎn)便、快速的結(jié)核病診斷方法仍未應(yīng)用于臨床。

    表1 肺結(jié)核治愈患者治療前后共有差異蛋白表達(dá)情況

    本研究應(yīng)用2-DE技術(shù)將42例治愈的肺結(jié)核患者治療前后血清分為3組,分析其蛋白差異,差異蛋白點(diǎn)數(shù)分別為24、31和18。組間出現(xiàn)差異蛋白點(diǎn)數(shù)不一致,也許跟各組患者年齡、性別、病情程度,以及不同批次的凝膠電泳條件不同有關(guān)。但本研究通過(guò)隨機(jī)分配及重復(fù)實(shí)驗(yàn)將組間差異降到最低。通過(guò)對(duì)比分析3組樣品的凝膠圖譜,明確患者治療前后存在相同的15個(gè)差異蛋白點(diǎn),其中,有12個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在抗結(jié)核治療后表達(dá)下調(diào),3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在治療后表達(dá)上調(diào)。肺結(jié)核在抗結(jié)核藥物治療后,體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌活性被抑制或殺滅,對(duì)機(jī)體組織或細(xì)胞產(chǎn)生免疫刺激減少,因此,這也許是治療后部分蛋白表達(dá)下調(diào)的原因。下調(diào)的蛋白點(diǎn)可能為治療肺結(jié)核的重要靶點(diǎn)及生物標(biāo)志物。而治療后表達(dá)上調(diào)的蛋白或許是細(xì)胞在疾病進(jìn)展過(guò)程中調(diào)節(jié)分泌的重要信號(hào)蛋白,上調(diào)的蛋白點(diǎn)可能為治療結(jié)核病的保護(hù)蛋白或耐藥蛋白。

    同時(shí)還發(fā)現(xiàn)15個(gè)差異蛋白的Mr為16 200~76 800,PI為 5.0~6.8。有的差異蛋白相對(duì)分子質(zhì)量相同,但PI不同,這種現(xiàn)象反映了這些蛋白有可能來(lái)源于同一前體蛋白,其只是同一前體蛋白通過(guò)不同的修飾作用后而得到的不同產(chǎn)物,而且這些來(lái)源于同一前體蛋白的幾種蛋白有可能共同參與了宿主或結(jié)核分枝桿菌的某一生命活動(dòng)。這跟筆者之前應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)對(duì)16例肺結(jié)核患者治療前后蛋白的研究有相似發(fā)現(xiàn)[8]。

    另外,本研究標(biāo)本為治愈的肺結(jié)核患者治療前后的血清,換言之,治愈后的血清即為正常人的血清,因此,本研究不僅明確了肺結(jié)核患者治療前后血清蛋白的差異,同時(shí)表明肺結(jié)核患者與正常人的血清蛋白存在差異,這與之前的研究結(jié)論相同[9]。

    總之,本研究表明肺結(jié)核患者治療前后血清蛋白凝膠圖譜存在明顯差異。這些差異蛋白點(diǎn)可能為結(jié)核病的重要診斷標(biāo)志物或者治療靶點(diǎn)。但本次實(shí)驗(yàn)仍有不足之處,尚未對(duì)這些差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定,且樣本量少。因此,下一步實(shí)驗(yàn)計(jì)劃將通過(guò)MALDI-TOF-MS或iTRAQ-LC-MS質(zhì)譜技術(shù),獲取差異蛋白序列,并通過(guò)蛋白免疫印跡法(Western blot)在蛋白水平及通過(guò)RT-PCR在基因水平進(jìn)行驗(yàn)證,以進(jìn)一步對(duì)差異蛋白的結(jié)構(gòu)和功能做出評(píng)價(jià)。

    [1] 張霞, 張宗德, 李琦. 結(jié)核病的體液蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2013, 36(3): 207-209.

    [2] 屠德華, 萬(wàn)利亞, 王黎霞. 現(xiàn)代結(jié)核病控制理論與實(shí)踐. 2版. 北京: 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社, 2013:152-153.

    [3] 郭葆玉. 基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及常見(jiàn)問(wèn)題對(duì)策. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2010: 249-251.

    [4] Ray S, Reddy PJ, Jain R, et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics, 2011, 11(11): 2139-2161.

    [5] Song SH, Han M, Choi YS, et al. Proteomic profiling of serum from patients with tuberculosis. Ann Lab Med, 2014, 34(5): 345-353.

    [6] Li C, He X, Li H, et al. Discovery and verification of serum differential expression proteins for pulmonary tuberculosis. Tuberculosis (Edinb), 2015, 95(5): 547-554.

    [7] Xu D, Li Y, Li X, et al. Serum protein S100A9, SOD3, and MMP9 as new diagnostic biomarkers for pulmonary tuberculosis by iTRAQ-coupled two-dimensional LC-MS/MS. Proteomics, 2015, 15(1): 58-67.

    [8] 尹小毛, 劉志輝, 劉玉美, 等. 肺結(jié)核患者強(qiáng)化治療前后血清差異蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析. 臨床肺科雜志, 2010, 15(5): 697-698.

    [9] 劉志輝, 劉玉美, 云徑平, 等. 結(jié)核病患者和正常人血清蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳差異比較. 廣東醫(yī)學(xué), 2008, 29(12): 1991-1993.

    (本文編輯:李敬文)

    Preliminary comparative analysis of serum proteins from cured pateints with pulmonary tuberculosis before and after treatment by two dimension electrophoresis

    YANGYu,XIEBei,WULing,MENGFan-rong,WANGNan,LEIJie,ZHANGYan-bin,PENGDe-hu,TANShou-yong,LIUZhi-hui.

    LungDiseaseInstituteofGuangzhouChestHospital,Guangzhou510095,China

    Correspondingauthor:LIUZhi-hui,Email:liuyixi2005@163.com

    A total of 42 new tuberculosis (TB) cases seeking health care in Guangzhou Chest Hospital in 2013 were enrolled in this study. All the patients were cured after 6-month first-line anti-TB regimen. The two-dimensions electrophoresis (2-DE) was performed to separate the whole blood protein of patients at the initial and end of treatment, respectively. In addition, the isoelectric point (PI) and the relative molecular mass (Mr) were determined by PDQuest 8.0 software. Our results revealed that there were 15 protein spots exhibiting different profiles between these two periods. In addition, the expression levels of 12 protein spots of the post-treatment period were significantly higher than those of the pre-treatment period, while 3 protein spots were significantly decreased after anti-TB treatment. TheMrvalues of these proteins ranged from 16 200-76 800, and the PI values were from 5.0-6.8. On the basis of our findings, there were specific differential serum proteins in the cured tuberculosis patients before and after treatment. The differential proteins might serve as important diagnostic markers or therapeutic targets of TB.

    Tuberculosis, pulmonary; Serum; Two-dimensional difference gel electrophoresis; Proteomics

    10.3969/j.issn.1000-6621.2017.03.023

    廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014Y2-00117、155700012);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B021800060)

    510095 廣州市胸科醫(yī)院肺部疾病研究所(楊瑜、謝貝、吳玲、孟繁榮、王楠、雷杰、劉志輝),結(jié)核內(nèi)科(張言斌、彭德虎、譚守勇)

    劉志輝,Email:liuyixi2005@163.com

    2016-09-06)

    猜你喜歡
    結(jié)核病肺結(jié)核圖譜
    世界防治結(jié)核病日
    警惕卷土重來(lái)的結(jié)核病
    繪一張成長(zhǎng)圖譜
    愛(ài)情是一場(chǎng)肺結(jié)核,熱戀則是一場(chǎng)感冒
    海峽姐妹(2018年4期)2018-05-19 02:13:00
    補(bǔ)腎強(qiáng)身片UPLC指紋圖譜
    中成藥(2017年3期)2017-05-17 06:09:01
    主動(dòng)對(duì)接你思維的知識(shí)圖譜
    蒙西醫(yī)結(jié)合治療肺結(jié)核進(jìn)展
    疣狀皮膚結(jié)核合并繼發(fā)型肺結(jié)核1例
    算好結(jié)核病防治經(jīng)濟(jì)賬
    IL-17在結(jié)核病免疫應(yīng)答中的作用
    中文字幕高清在线视频| 搡女人真爽免费视频火全软件 | h日本视频在线播放| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 久久亚洲真实| 久久久国产成人精品二区| 精品久久久久久久久久免费视频| 在线a可以看的网站| 一进一出抽搐gif免费好疼| 中文字幕免费在线视频6| 午夜视频国产福利| 在线观看免费视频日本深夜| 国产高清激情床上av| 极品教师在线免费播放| 免费在线观看亚洲国产| 窝窝影院91人妻| 久久久久免费精品人妻一区二区| 精品人妻1区二区| 亚洲综合色惰| 免费观看人在逋| 午夜精品久久久久久毛片777| 校园春色视频在线观看| 黄色配什么色好看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 男女视频在线观看网站免费| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 在线a可以看的网站| eeuss影院久久| 变态另类丝袜制服| 亚洲国产色片| 美女被艹到高潮喷水动态| 在线a可以看的网站| 日韩中字成人| 欧美zozozo另类| 美女高潮的动态| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产亚洲精品久久久久久毛片| eeuss影院久久| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 在线观看免费视频日本深夜| 国产主播在线观看一区二区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 日本黄色片子视频| 一个人看视频在线观看www免费| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲自偷自拍三级| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲在线观看片| 国产精品1区2区在线观看.| 精品人妻视频免费看| 九九热线精品视视频播放| 成年人黄色毛片网站| 别揉我奶头 嗯啊视频| 免费看光身美女| 午夜福利18| 午夜福利免费观看在线| 一级黄片播放器| 看免费av毛片| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 丰满的人妻完整版| 毛片女人毛片| 国产激情偷乱视频一区二区| av中文乱码字幕在线| 国产一区二区激情短视频| 午夜精品在线福利| 亚洲国产精品久久男人天堂| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美午夜高清在线| 成年人黄色毛片网站| 十八禁国产超污无遮挡网站| 身体一侧抽搐| 国产精品三级大全| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 中文字幕久久专区| 亚洲 国产 在线| 国产三级黄色录像| 色视频www国产| 国产精品不卡视频一区二区 | 欧美极品一区二区三区四区| 成人国产综合亚洲| 黄色女人牲交| 1024手机看黄色片| 亚洲午夜理论影院| 午夜影院日韩av| av在线天堂中文字幕| 午夜激情欧美在线| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 性插视频无遮挡在线免费观看| 内地一区二区视频在线| 动漫黄色视频在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 成人鲁丝片一二三区免费| 91狼人影院| 午夜免费成人在线视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国内揄拍国产精品人妻在线| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产久久久一区二区三区| 国产乱人伦免费视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 中出人妻视频一区二区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 久久这里只有精品中国| 毛片女人毛片| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 动漫黄色视频在线观看| 天堂√8在线中文| av女优亚洲男人天堂| 国产精品电影一区二区三区| 久久久久亚洲av毛片大全| a级毛片免费高清观看在线播放| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 在线国产一区二区在线| 日韩中字成人| 欧美乱妇无乱码| 99热这里只有是精品50| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久精品影院6| 嫁个100分男人电影在线观看| 天堂影院成人在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 久久精品综合一区二区三区| 校园春色视频在线观看| 国产一区二区三区视频了| 国产欧美日韩精品亚洲av| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲无线观看免费| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产在线男女| av欧美777| www.www免费av| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产免费男女视频| 亚洲综合色惰| 亚洲人成伊人成综合网2020| 婷婷精品国产亚洲av| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产精品久久视频播放| 国产精品电影一区二区三区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美性感艳星| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲色图av天堂| 宅男免费午夜| 国产日本99.免费观看| 亚洲欧美日韩东京热| 一区福利在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 欧美精品啪啪一区二区三区| 欧美黄色片欧美黄色片| 99热这里只有是精品在线观看 | 俺也久久电影网| 免费人成在线观看视频色| 国产精品影院久久| 日本免费a在线| 人妻久久中文字幕网| 亚洲av二区三区四区| 黄色女人牲交| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产探花极品一区二区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 成人无遮挡网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久国产乱子免费精品| 午夜老司机福利剧场| 日韩大尺度精品在线看网址| 3wmmmm亚洲av在线观看| av女优亚洲男人天堂| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 成人午夜高清在线视频| 真实男女啪啪啪动态图| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 久久久色成人| 国产熟女xx| 国产不卡一卡二| 桃红色精品国产亚洲av| 免费人成在线观看视频色| 午夜福利18| 亚洲精华国产精华精| 欧美一级a爱片免费观看看| 午夜福利在线在线| 一区二区三区免费毛片| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 精品久久久久久,| 久久午夜福利片| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 成人av在线播放网站| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲片人在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 激情在线观看视频在线高清| 国产精品爽爽va在线观看网站| 色av中文字幕| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 日韩欧美精品免费久久 | 日日干狠狠操夜夜爽| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产三级中文精品| 俺也久久电影网| 欧美高清成人免费视频www| 一级a爱片免费观看的视频| 一区二区三区免费毛片| 久久久久久久久久成人| 91麻豆精品激情在线观看国产| 午夜精品久久久久久毛片777| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 99久国产av精品| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产精品影院久久| 精品欧美国产一区二区三| 久久久久久久久久成人| 国产一区二区激情短视频| 成人亚洲精品av一区二区| 我的老师免费观看完整版| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产精品久久电影中文字幕| av在线观看视频网站免费| 午夜福利在线观看吧| 国产精品野战在线观看| 久久中文看片网| 99热这里只有是精品在线观看 | 热99re8久久精品国产| 99久久九九国产精品国产免费| 欧美精品国产亚洲| 日韩欧美在线二视频| 中文字幕av成人在线电影| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国内精品久久久久精免费| 国产真实伦视频高清在线观看 | 最近最新中文字幕大全电影3| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲无线观看免费| 国产三级黄色录像| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产美女午夜福利| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 黄色视频,在线免费观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲成人中文字幕在线播放| 一级作爱视频免费观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 我要搜黄色片| 看片在线看免费视频| eeuss影院久久| 一进一出抽搐动态| h日本视频在线播放| 露出奶头的视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 国产 一区 欧美 日韩| 国产男靠女视频免费网站| 国产亚洲精品久久久com| 天天一区二区日本电影三级| 乱人视频在线观看| 99热精品在线国产| 黄色女人牲交| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产极品精品免费视频能看的| 精品免费久久久久久久清纯| 中文资源天堂在线| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 午夜久久久久精精品| 无遮挡黄片免费观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲av二区三区四区| 俄罗斯特黄特色一大片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲人成伊人成综合网2020| 精品人妻偷拍中文字幕| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产精品永久免费网站| 日韩中字成人| 免费看日本二区| 免费在线观看影片大全网站| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲成av人片在线播放无| 欧美黄色片欧美黄色片| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产真实伦视频高清在线观看 | 赤兔流量卡办理| 日韩欧美三级三区| 国产大屁股一区二区在线视频| 精品久久久久久,| 一进一出抽搐动态| 久久久久久九九精品二区国产| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产熟女xx| 天堂动漫精品| 两人在一起打扑克的视频| 日本在线视频免费播放| 免费在线观看影片大全网站| 51午夜福利影视在线观看| 成人精品一区二区免费| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲人与动物交配视频| 国产免费一级a男人的天堂| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 一个人看视频在线观看www免费| 欧美性猛交黑人性爽| 男女那种视频在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 色av中文字幕| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 如何舔出高潮| 亚洲精品成人久久久久久| 在线看三级毛片| 久久热精品热| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲精品在线美女| 午夜福利视频1000在线观看| 午夜两性在线视频| 男人的好看免费观看在线视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 午夜亚洲福利在线播放| 国产探花极品一区二区| 搡老妇女老女人老熟妇| 免费看光身美女| 18禁在线播放成人免费| 国产伦一二天堂av在线观看| 嫩草影院精品99| 美女被艹到高潮喷水动态| 深夜精品福利| 九色国产91popny在线| 久久久成人免费电影| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲国产精品sss在线观看| aaaaa片日本免费| 国产高潮美女av| 久久午夜亚洲精品久久| 免费在线观看影片大全网站| 午夜精品久久久久久毛片777| 动漫黄色视频在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 小说图片视频综合网站| 国产精品久久视频播放| 女同久久另类99精品国产91| 一本久久中文字幕| 一区二区三区激情视频| 日本一二三区视频观看| 亚洲精品在线美女| 最近在线观看免费完整版| 成人国产综合亚洲| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲avbb在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 性色avwww在线观看| 精品日产1卡2卡| 伦理电影大哥的女人| 欧美黄色片欧美黄色片| 毛片女人毛片| 麻豆一二三区av精品| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久久久性生活片| 欧美又色又爽又黄视频| 美女高潮的动态| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产单亲对白刺激| 成人三级黄色视频| 一级av片app| 日本与韩国留学比较| 99热这里只有是精品在线观看 | 色av中文字幕| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 午夜a级毛片| 免费黄网站久久成人精品 | 日本一本二区三区精品| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 99在线人妻在线中文字幕| 精品国内亚洲2022精品成人| 哪里可以看免费的av片| 窝窝影院91人妻| 国产一区二区在线av高清观看| 国内精品久久久久精免费| 精品午夜福利在线看| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美一区二区国产精品久久精品| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲性夜色夜夜综合| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 黄色视频,在线免费观看| 国产午夜精品论理片| 听说在线观看完整版免费高清| 韩国av一区二区三区四区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 黄色配什么色好看| 中国美女看黄片| 麻豆成人av在线观看| a在线观看视频网站| 动漫黄色视频在线观看| 能在线免费观看的黄片| 最好的美女福利视频网| 国产精品伦人一区二区| 欧美bdsm另类| 乱码一卡2卡4卡精品| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 看免费av毛片| 我要看日韩黄色一级片| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 色播亚洲综合网| av福利片在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 国内揄拍国产精品人妻在线| 观看免费一级毛片| 长腿黑丝高跟| 看黄色毛片网站| 日韩欧美免费精品| 亚洲经典国产精华液单 | 男人舔奶头视频| 成年免费大片在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 直男gayav资源| 欧美黄色片欧美黄色片| 午夜视频国产福利| 天美传媒精品一区二区| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 成年人黄色毛片网站| а√天堂www在线а√下载| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲激情在线av| 国产色婷婷99| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美黑人巨大hd| 亚洲电影在线观看av| 成人av在线播放网站| 神马国产精品三级电影在线观看| 91麻豆av在线| 免费电影在线观看免费观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 99国产综合亚洲精品| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产午夜福利久久久久久| 精品熟女少妇八av免费久了| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 黄片小视频在线播放| 成人一区二区视频在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 日本熟妇午夜| 性色avwww在线观看| 悠悠久久av| 国产日本99.免费观看| 日韩中字成人| av福利片在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲精品在线观看二区| 99热这里只有精品一区| 五月玫瑰六月丁香| 国产亚洲精品av在线| 岛国在线免费视频观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 日本一二三区视频观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 色av中文字幕| 亚洲精品色激情综合| 丁香六月欧美| 日日干狠狠操夜夜爽| 午夜两性在线视频| 99热6这里只有精品| 3wmmmm亚洲av在线观看| 99热这里只有是精品50| 我要看日韩黄色一级片| 国产黄片美女视频| 欧美色视频一区免费| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产高清视频在线观看网站| 在线播放无遮挡| 久久亚洲真实| 日韩欧美 国产精品| 99久久精品国产亚洲精品| 日本与韩国留学比较| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲无线观看免费| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲 国产 在线| 色综合欧美亚洲国产小说| 香蕉av资源在线| 日日夜夜操网爽| 欧美日韩乱码在线| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美日韩福利视频一区二区| 精品久久久久久久久亚洲 | 成年女人看的毛片在线观看| 很黄的视频免费| 欧美在线黄色| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 偷拍熟女少妇极品色| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 丁香欧美五月| 天堂网av新在线| 嫩草影院精品99| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 成人性生交大片免费视频hd| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 一本精品99久久精品77| 成人特级av手机在线观看| 日本熟妇午夜| 日韩亚洲欧美综合| 搡老岳熟女国产| 亚洲在线观看片| 欧美日韩乱码在线| 亚洲精品在线美女| 国产成人欧美在线观看| 国产精品,欧美在线| 中文字幕高清在线视频| 亚洲精华国产精华精| 日韩人妻高清精品专区| 精品久久久久久成人av| 亚洲国产欧美人成| h日本视频在线播放| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 日本免费a在线| 成年女人看的毛片在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 国产私拍福利视频在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 日韩欧美在线二视频| 色哟哟·www| 国内精品一区二区在线观看| 最近在线观看免费完整版| www日本黄色视频网| 脱女人内裤的视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美日韩黄片免| 久久草成人影院| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 一本综合久久免费| 国产亚洲av嫩草精品影院| 午夜福利18| 校园春色视频在线观看| 亚洲激情在线av| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 老鸭窝网址在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 午夜久久久久精精品| 超碰av人人做人人爽久久| 欧美三级亚洲精品| 女人被狂操c到高潮| 亚洲av美国av| 久久久久久久久久成人| 好男人在线观看高清免费视频| 精品久久久久久久久亚洲 | 日韩人妻高清精品专区| 亚洲第一电影网av| 欧美性感艳星| 精品一区二区三区人妻视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久久久久国产a免费观看| 波野结衣二区三区在线| xxxwww97欧美| 国产高清视频在线观看网站| 国产毛片a区久久久久| 国产麻豆成人av免费视频| 国产精品av视频在线免费观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲人成网站高清观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产乱人视频| 日韩欧美国产在线观看| 一夜夜www| 在线观看av片永久免费下载| 久久久久精品国产欧美久久久| 我要搜黄色片| 91久久精品电影网| 高清在线国产一区| 日本免费a在线| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲第一电影网av| 欧美日韩乱码在线| 日本免费一区二区三区高清不卡| 又爽又黄a免费视频| 99国产综合亚洲精品| 我的老师免费观看完整版| 久久伊人香网站| 我要搜黄色片| 日本免费一区二区三区高清不卡| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美|