斑馬魚胚胎用于汽車尾氣顆粒物毒性監(jiān)測的可行性

超克+楊景峰+李佳怡

摘要：概述了汽車尾氣的污染狀況及危害、汽車尾氣顆粒物的檢測、斑馬魚的優(yōu)點，探討了斑馬魚用于汽車尾氣顆粒物毒性檢測的可行性。

關鍵詞：汽車尾氣顆粒物；生物監(jiān)測；斑馬魚胚胎；毒性

中圖分類號：X830.2 文獻標識碼：A 文章編號：2095-672X（2017）02-0074-05

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2017.02.014

現今，隨著科學技術的發(fā)展以及經濟水平的提高，汽車已經成為人類不可缺少的交通運輸工具。它給人們的生活和工作帶來了便利的同時，也帶來了極大的污染：汽車尾氣危害人體健康，破壞城市建筑物及景觀，對人類的生存環(huán)境造成極大影響[1]。伴隨汽車工業(yè)的快速發(fā)展、汽車產量和保有量不斷增加，汽車尾氣大量排放已逐漸成為大氣的主要污染來源[2-3]。

1 汽車尾氣的危害及污染狀況

汽車尾氣排放對環(huán)境的污染主要集中表現在城市的空氣污染，尾氣中含有上百種的化合物，排放入空氣后容易形成酸雨、光化學煙霧、霧霾等現象[4]。汽車尾氣中所包含的物質主要有一氧化碳（CO）、氮氧化物（NOx）、碳氫化合物（HC）和細微顆粒物等，這些污染物對人體健康具有潛在的、長久危害，對生態(tài)環(huán)境同樣造成直接污染和破壞[5]。據統(tǒng)計，每千量汽車每天排出一氧化碳約3000kg，碳氫化合物質200-400kg，氮氧化合物50-150kg。一氧化碳與血紅蛋白有高度的親和力，比氧氣要大210倍以上，當空氣中一氧化碳濃度升高時，血紅蛋白與一氧化碳相結合，喪失運輸氧的能力，可危及人和動物生命。碳氫化合物中包含多種有機物成分，部分有機成分被證明是非常強的致癌物質，如苯、苯并芘等多環(huán)芳烴類物質。尾氣中的氮氧化合物含量相對較少，但毒性卻非常的大，達到一定濃度就會對人的呼吸系統(tǒng)和免疫功能造成嚴重危害。此外，汽車尾氣中的含鉛化合物很多，可隨呼吸進入血液，并長期蓄積在體內，引起貧血、腦損傷等癥狀，還會影響兒童正常成長和智力發(fā)育低下，甚至出現嚴重癡呆癥狀。鉛還能經由母體血液進入胎盤，危害胎兒健康。2000年開始，我國在全國范圍內推廣了無鉛汽油，解決了汽車尾氣中鉛污染的問題，但事實上，無鉛汽油仍然存在不少環(huán)境污染問題[6]。近年來，隨著霧霾等大氣污染問題的日益突出，也使得大量細顆粒物（fine particulate matter，PM2.5）走進了人們的視野，細顆粒物對大氣的污染形勢十分嚴峻。

2 汽車尾氣顆粒物

汽車顆粒物污染是對人體健康危害最大的大敵。顆粒物被定義為可懸浮于空氣中的固體和液體微粒，根據粒徑大小可分為總懸浮顆粒物（粒徑≤100μm）、粗顆粒物（粒徑≤10μm，即PM10）和細顆粒物（粒徑≤2.5μm，即PM2.5，也成為可入肺顆粒物）、超細微粒（粒徑≤100 nm）等。目前國內大多數研究集中在細顆粒物對人體各器官的損害。汽車尾氣排出的顆粒物表面較粗糙且呈多空隙狀態(tài)，具有較強的吸附能力[7]。汽油燃燒過程中產生的大量有機物、未燃油和揮發(fā)性有機物等都會吸附在其上。分析結果顯示，顆粒物吸附有多種有機物，其中主要包括酸、酯、烷烴、多環(huán)芳烴類（PAHs）如芘、蒽等、雜環(huán)化合物（苯并噻唑）、含氧化合物等。無鉛汽油車尾氣排出顆粒物，顆粒物吸附的有機物所占的比例較高， 而且由于無鉛汽油中芳烴、烯烴的含量高，顆粒物也含有多種的芳烴化合物 [8]。顆粒物對人體的毒性作用取決于顆粒物的來源、濃度、粒徑、化學組成（過渡金屬、可溶性組分、有機成分、生物成分）、酸性、吸濕性、可溶性，以及與其他污染物的協同作用[9]。

在尾氣顆粒物排放上，美國是全球最早制訂排放標準的國家之一，也是汽車排放法規(guī)最嚴的國家，其中聯邦標準（EPA2010）最為嚴格，比如其規(guī)定的重卡柴油機氮氧化物和顆粒物，每制動馬力1小時的排放上限分別為 0.2 g 和 0.01 g，幾乎相當于零排放。近些年，歐洲標準的限值也是越來越嚴。日本也在很早之前就對細顆粒物的來源和危害有過很多的研究，得出汽車排放的顆粒物是城市中PM2.5的主要來源，而且粒徑相對較小的細顆粒物還具有致癌作用[10]。而我國自從細顆粒物指標加入新修訂的 GB3095-2012《環(huán)境空氣質量標準》以來，機動車細顆粒物排放才得到重視，尾氣顆粒物毒性的生物監(jiān)測也成為一個研究熱點。由于采樣和檢測設備、技術和方法的缺乏，尾氣顆粒物的生成機理、檢測方法、毒性效應等還需要進一步地研究。

3 汽車尾氣顆粒物生物監(jiān)測現狀

以下內容是有關不同種類的生物學監(jiān)測介紹。

3.1 細胞系及酵母等監(jiān)測與研究

3.1.1 人癌細胞

張遵真等[11]為研究汽車尾氣的毒性作用機制，以人肺腺癌A549細胞為研究對象，采用MMT試驗檢測汽車尾氣顆粒物對細胞的毒性作用，結果顯示出明顯的細胞毒性，且隨濃度的增加，細胞存活率也下降。

3.1.2 重組基因酵母

王娟等[12]的實驗中，采用環(huán)境雌激素基因重組酵母測評系統(tǒng)，測定了汽車尾氣的雌激素活性。結果表明汽車尾氣在最高劑量時吸光度值（A600）遠遠低于其他各劑量組，說明汽車尾氣超過一定濃度范圍會對酵母細胞產生毒性作用，導致酵母細胞死亡。同時，汽車尾氣在個別劑量時檢出雌激素活性，說明汽車尾氣具有微弱雌激素樣作用。此外，吳文忠等[13]用重組基因酵母檢測了污泥、土壤中的類雌激素污染物，發(fā)現樣品餾分中多環(huán)芳烴（PAHs）的含量與雌激素的活性正相關。通過研究尾氣顆粒物的組成，結合一些研究結果和參考文獻，有理由推測汽車尾氣中的雌激素樣作用可能與尾氣顆粒物中的多環(huán)芳烴類（PAHs）等物質有關。

3.2 昆蟲系統(tǒng)監(jiān)測與研究

這是一個有趣的研究領域，高慧璟等[14]研究了道路交通污染對昆蟲的影響。其中提到，汽車尾氣中的細顆粒物飄落到公路干線兩側的植物表面，與植物組織結合后很難分解，通過食物鏈轉移到植食性昆蟲及其天敵體內，并造成嚴重威脅。根據昆蟲對污染物的反應類型進行區(qū)系分類，開展昆蟲系統(tǒng)調查，同時利用昆蟲對交通污染物的特異性反應，進行環(huán)境監(jiān)測指示生物研究[15]。

3.3 哺乳動物監(jiān)測與研究

哺乳動物的監(jiān)測與研究主要是圍繞大鼠及小鼠用于汽車尾氣顆粒物毒性監(jiān)測展開的。

3.3.1 呼吸系統(tǒng)損害

在早年，彭寶成等[16]就曾采用大鼠氣管內注入尾氣顆粒物的形式觀察生物效應。得出結論，汽車尾氣顆粒物能引起肺組織及細胞染色體損傷。近些年，顆粒物致呼吸系統(tǒng)的損害依然是比較常見的研究方向。肖純凌等[17]，通過制備動物模型，即SPF級Wistar大鼠氣管注入PM2.5混懸液及其他對照樣本，觀測暴露不同時期大鼠氣管和肺泡的超微結構變化。結果大鼠氣管掃描電鏡觀察可見，隨著染毒劑量的增高，氣管上皮纖毛粘連、紊亂； PM2.5對大鼠肺組織的損害比對氣管上皮的損害嚴重得多，可使肺纖維增生，肺泡腔變小，甚至使肺泡上皮細胞脫落溶解。與大鼠一樣，作為哺乳動物首先考慮尾氣對其肺部損傷的作用。唐思文等[21]選擇SPF級雄性昆明小鼠（Kunming mice，KM小鼠）作為實驗動物。隨機分組，采用自制汽車尾氣染毒柜進行短時、多次、連續(xù)染毒。通過肺組織HE染色、免疫組化法、Western印跡法等實驗方法檢測發(fā)現汽車尾氣暴露后，小鼠肺組織出現明顯病理損傷，其作用與多個炎癥因子表達增高和氧化損傷有關。

3.3.2 生殖功能損害

嚴超等[18]研究，建立Sprague Dawley（SD）大鼠汽車來源PM2.5長期暴露模型，研究PM2.5長期暴露對SD大鼠生殖功能的損傷及其機制。將足夠數量SD雄性大鼠樣本 隨機分配成 3 組： 生理鹽水對照組，低劑量組，高劑量組。連續(xù)暴露，統(tǒng)計雌鼠受孕率，剩余實驗鼠取材，進行精子計數和畸形率測定、睪丸組織病理學檢測以及睪丸組織蛋白表達檢測。通過實驗得出，PM2.5長期暴露損傷血睪屏障的完整性，進而破壞生精微環(huán)境的穩(wěn)定，生精細胞發(fā)育異常，精子生成數量減少和質量降低，并最終導致生殖功能損傷。

3.3.3 胚胎毒性及遺傳毒性

比較特別的研究，王海青等[19]使用妊娠期Wistar大鼠，通過動式染毒裝置進行吸入染毒，觀察汽車尾氣對妊娠結局及胎鼠的影響，得出汽車尾氣具有胚胎毒性和遺傳毒性的結論。指出尾氣中的多環(huán)芳烴（PAHs）可以通過胎盤屏障，造成胎兒生長發(fā)育受限。同樣，根據葉雯婧等[20]等報道，通過對汽車尾氣顆粒物進行采樣，制備提取液。向孕鼠妊娠起經腹腔注射，按二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）對照組、低濃度組合高濃度組進行研究。結果高劑量組非存活胎鼠發(fā)生率和活胎鼠宮內發(fā)育遲緩發(fā)生率均高于對照組；高低劑量組均出現外觀畸形的活胎鼠，對照組的活胎鼠外觀正常。通過HE染色觀察到不同程度的組織病理損傷。得出汽車尾氣顆粒物可造成胎盤組織病理損傷，增加了宮內發(fā)育遲緩和外觀畸形的發(fā)生率的結論。

3.3.4 其他器官或者多器官的損害

與上述同樣的暴露方法及實驗手段，還可以研究尾氣顆粒物的多器官毒性。結果顯示，與正常組相比，PM2.5暴露組的SD大鼠體重明顯降低，且肺部外觀改變明顯，肺臟及心臟組織結 構受損，出現心肌水腫，炎癥反應明顯，肝臟、脾臟及腎臟亦有炎癥表現[22]。在小鼠，張志紅等[23]利用汽車尾氣顆粒物有機提取物進行腹腔注射染毒。測定小鼠外周血白細胞分類、體重增長和臟器重量、抗體形成細胞實驗及腹腔巨噬細胞吞噬功能實驗4個指標。結果表明，尾氣顆粒物對小鼠免疫功能有抑制作用，并且是多方面的。

4 斑馬魚在科研中的優(yōu)勢

斑馬魚（Danio rerio）是一種常見的小型熱帶淡水魚。因為體側有類似斑馬一樣的條紋而得名。斑馬魚體型纖細，成魚體長約4cm，成梭形或紡錘形。它的世代時間短，3～4個月即可達到性成熟。斑馬魚常年產卵，成熟雌魚每隔幾天可產幾百枚卵。卵子體外受精、發(fā)育，胚胎發(fā)育同步且速度快，胚體透明。斑馬魚對水質要求不高，發(fā)育溫度為25～31℃。目前斑馬魚己逐漸成為最受關注的脊椎動物發(fā)育生物學模式之一，在環(huán)境毒理學、病理毒理學等方面顯示出了很大的優(yōu)勢[24]。

概括來說，斑馬魚作為模式生物有以下優(yōu)點：（1）成本低：由于斑馬魚體型小，所需養(yǎng)殖空間少，養(yǎng)殖成本低；能大規(guī)模養(yǎng)殖繁育，便于獲得大量樣本；染毒劑量少，節(jié)約實驗成本；（2）易觀察：斑馬魚胚胎透明，可以清楚地觀察到各個階段的發(fā)育情況；（3）可利用信息豐富：斑馬魚由于基因信息全面且已有多種轉基因魚模型，作為一種國際標準的動物模型而普遍應用于醫(yī)學、基因組學及生態(tài)毒理學的研究中；（4）斑馬魚胚胎敏感度高，這對環(huán)境毒理評價具有重要意義；（5）研究方法多：如整體原位雜交技術、整體免疫組化技術、熒光技術等；（6）具有遺傳毒性：斑馬魚生長周期短，有利于次代的檢測與觀察。

在我國，斑馬魚被廣泛用于胚胎發(fā)育學研究領域，一般常用動物模型如小鼠屬于胎盤動物，胚胎操作時不能離開母體，實驗分析時就需要大量推論，用時超過20天，需要大量的資金和人力。而斑馬魚的胚胎體外發(fā)育且發(fā)育非常迅速，各發(fā)育階段有其明顯的特征，易于準確地在各不同階段進行處理[25-26]。

5 斑馬魚胚胎作為尾氣顆粒物毒性監(jiān)測模 型的可行性

顆粒物對人體的危害與其來源以及復雜的理化性質（如表面形態(tài)特征、吸附組分等）有著很大的關系，它對人體可能產生諸多危害，毒性機制也不唯一，因此對顆粒物的毒性需要進行高通量評價[27-28]。而斑馬魚胚胎的經濟、快速、敏感，可大面積高通量初期篩選與檢測，突出了其顯著優(yōu)點。

給斑馬魚胚胎染毒所用的汽車尾氣顆粒物，使用大中流量大氣采樣裝置和稱重過的玻璃纖維濾膜進行采樣，也可采用直接刮取排氣管上積碳的方法。采樣后的濾膜進行再次稱重，記錄。浸泡于酒精或其他溶劑經超聲波震蕩萃取，過濾后提純，用二甲基亞砜（DMSO）溶劑定容，提取液4℃保存[29]。實驗動物斑馬魚胚胎，選用受精后2h的斑馬魚進行梯度染毒，因為斑馬魚胚胎及幼魚呈透明狀，因此它在形態(tài)學方面極易觀察。在光學顯微鏡下可以很直觀的看到他的發(fā)育狀況是否正常?？梢酝ㄟ^軟骨染色觀察顆粒物提取液對斑馬魚胚胎軟骨發(fā)育的影響。也可以深入的做病理組織學及其酶類變化方面的的檢測. 還可以通過切片，以及HE染色來觀察尾氣顆粒物對斑馬魚胚胎肝臟等器官的組織學變化，通過二惡英類物質標志物質細胞色素P450 （CYP1A）的誘導期強度（如CYP1A抗體染色或者定量PCR）檢測二惡英類物質的污染程度。

綜上所述，表明斑馬魚胚胎作為汽車尾氣顆粒物毒性生物監(jiān)測測模型具有實際可行性。尤其是污染物的高通量檢測，為尾氣凈化技術、污染檢測技術及污染物過濾技術提供高通量檢測。

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