禽蛋表面腸桿菌的分布及其喹諾酮耐藥基因的檢測(cè)*

王樂晨 農(nóng)宇涵 唐婉瀅 付 鑫

（北京市十一學(xué)校 北京 100039）

喹諾酮類藥物廣泛應(yīng)用于臨床治療各種細(xì)菌感染。細(xì)菌對(duì)喹諾酮類的耐藥機(jī)制主要由染色體介導(dǎo)，不具有水平傳播性。隨后國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因［1］，其作用機(jī)制是其所編碼的蛋白質(zhì)可對(duì)喹諾酮類藥物靶位點(diǎn)產(chǎn)生保護(hù)，從而導(dǎo)致菌株產(chǎn)生耐藥。由于耐藥基因可在不同菌株和不同菌種之間傳播，加重了細(xì)菌耐藥的傳播,臨床分離細(xì)菌對(duì)其耐藥性迅速增加。

我國(guó)是喹諾酮類藥物耐藥最嚴(yán)重的國(guó)家之一，最近報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)動(dòng)物和禽類市場(chǎng)中的細(xì)菌存在多種抗生素耐藥基因，并且發(fā)現(xiàn)了一種新的對(duì)多黏菌素產(chǎn)生高度耐藥的基因（MCR－1）［2］，廣泛存在于取自中國(guó)南方的豬和患者腸桿菌科細(xì)菌中，包括具有流行可能性的菌株。禽蛋為日常生活中的常用食物，但其表面攜帶的細(xì)菌種類和耐藥狀況鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在北京市幾家禽類市場(chǎng)上，采集禽蛋表面涂抹物作為標(biāo)本，調(diào)查了禽蛋表面腸桿菌科細(xì)菌的種類，并對(duì)細(xì)菌攜帶的喹諾酮耐藥基因進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 標(biāo)本為禽蛋表面涂抹物，收集自2016年8月10—12日間，在北京市海淀區(qū)6處禽類市場(chǎng)的在售禽蛋進(jìn)行采樣。6處禽類市場(chǎng)來自于13個(gè)不同的養(yǎng)殖場(chǎng)，每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)隨機(jī)采集5份禽蛋涂抹標(biāo)本。采集標(biāo)本時(shí)，使用無(wú)菌棉簽沾取采樣管中的LB液體（胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%,NaCl 1%），在3～5個(gè)禽蛋表面進(jìn)行涂抹，然后放入含有LB的采樣管中，作為1份標(biāo)本。標(biāo)本于4 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行菌株分離。

1.2 菌株分離 將標(biāo)本劃線接種至SS培養(yǎng)基平板（沙門菌、志賀菌選擇性培養(yǎng)基平板，北京陸橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品），然后將SS培養(yǎng)基平板放至37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以該平板上菌落形態(tài)大小與顏色不同為依據(jù)，每個(gè)平板上挑選1～7個(gè)有差異的單菌落，轉(zhuǎn)移至普通培養(yǎng)基平板，至37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。

1.3 DNA模板的制備 本研究中DNA模板的制備采用水煮模板法，用無(wú)菌牙簽挑取普通培養(yǎng)基平板的菌落，至含有200 μL滅菌水的Eppendorf管中，充分混勻后，將Eppendorf管在沸水中煮10 min，即刻取出于0℃冰浴中放置 10 min，然后12 000 rpm離心2 min，上清移至新的Eppendorf中，即為DNA模版待用。

1.4 PCR 細(xì)菌種屬的鑒定,采用細(xì)菌16S r RNA通用引物（見表1），喹諾酮耐藥基因的檢測(cè)，采用3對(duì)引物，qnrA、qnrB和qnrS，見表1,引物序列參考文獻(xiàn)［3］。每個(gè)菌落PCR反應(yīng)體系體積為50 μL，反應(yīng)體系組成如下：2×Taq Master mix（TaKaRa公司產(chǎn)品）25.0 μL，正向引物 1.0 μL，反向引物 1.0 μL，ddH2O 21 μL，模版 DNA 2.0 μL。 PCR 條件：94℃10 min；循環(huán) 94℃ 45 s，54℃ 45 s，72℃ 45 s。 共 30個(gè)循環(huán)；最后延伸72℃ 10 min。

表1 本研究用PCR引物的信息

1.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定與測(cè)序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖5V/cm電壓電泳45～60 min后，用紫外檢測(cè)儀觀察結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送公司進(jìn)行商業(yè)測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank網(wǎng)站（ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn）進(jìn)行序列比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本的采集結(jié)果：取樣于6處采集點(diǎn)、來自于13個(gè)不同的養(yǎng)殖場(chǎng)，每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)隨機(jī)采集5份禽蛋涂抹標(biāo)本，共收集65份標(biāo)本，包括雞蛋（60份）和鵪鶉蛋（5份）。

2.2 菌株的分離 將標(biāo)本劃線至SS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，在65份標(biāo)本中，有35份有菌落生長(zhǎng)。每份在SS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落依據(jù)其形態(tài)與顏色的不同，挑選1～7個(gè)有差異的單菌落，共108個(gè)菌落，轉(zhuǎn)移至普通培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.3 菌落的鑒定 將108個(gè)單菌落進(jìn)行細(xì)菌16 S rRNA通用引物的PCR擴(kuò)增，獲得了1.5 kb大小的片段（圖 1），PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，序列在Gen-Bank網(wǎng)站經(jīng)比對(duì)后，共鑒定出11個(gè)種或?qū)俚募?xì)菌（表 2）。其中埃希氏菌屬46個(gè)（42.6%），克雷伯氏菌19個(gè)（17.6%），假單胞菌 13個(gè)（12.0%），其他還有沙門菌、克呂沃爾菌、檸檬酸菌、假單胞菌、泛菌屬、嗜氣桿菌、奇異變形桿菌、志賀菌等種屬。

圖1 部分細(xì)菌16s rRNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

表2 禽蛋表面涂抹物標(biāo)本中腸桿菌種屬的構(gòu)成

表3 喹諾酮耐藥基因在腸桿菌種屬中的分布

2.4 耐藥基因的PCR檢測(cè) 在108個(gè)菌落、所檢測(cè)的3種耐藥基因中，共30株菌種檢測(cè)到耐藥基因，陽(yáng)性率為27.8%。其中qnrB陽(yáng)性率為23.2%，qnrA陽(yáng)性率為6.5%,但所有菌株中均未檢測(cè)出qnrS基因；qnrA與qnrB同時(shí)呈陽(yáng)性的有2株菌（見表3）。而根據(jù)菌株種屬的不同，耐藥基因呈陽(yáng)性的種屬，最多的為埃希氏菌屬（8株），其次為檸檬酸菌屬（6株），以及普羅威登斯菌（3株）和克雷伯菌（3株）；其他攜帶耐藥基因的菌屬還有假單胞菌、克呂沃爾菌、沙門菌等（見表3）。

3 討論

喹諾酮類也稱為吡酮酸類或吡啶酮酸類藥物，是含4－喹諾酮基本結(jié)構(gòu)人工合成抗菌藥品。這類抗生素以細(xì)菌DNA為靶，阻礙DNA回旋酶的作用，進(jìn)而造成不可逆的DNA損傷，此其抗菌機(jī)理［12］。自1979年諾氟沙星合成后，又有新藥問世——含氟的新喹諾酮類藥（氟喹諾酮類）。目前在臨床上使用頻繁的是四代喹諾酮類藥物的第三代。其中常用的有諾氟沙星、氟羅沙星、氧氟沙星和環(huán)丙沙星等。此類藥物針對(duì)多種革蘭氏陰性菌，常借以治療泌尿生殖系統(tǒng)和胃腸疾病，也用于抵抗皮膚和呼吸道的革蘭氏陰性細(xì)菌感染。

本次調(diào)查在菌株分離過程中，將標(biāo)本劃線至SS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，在收集到的65份標(biāo)本中，僅35份有菌落生長(zhǎng)。標(biāo)本沒有菌落生長(zhǎng)的原因，可能是由于使用了腸桿菌科的強(qiáng)選擇性平板（SS培養(yǎng)基平板）所致，在此平板上，一些腸桿菌科細(xì)菌及其他革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的生長(zhǎng)可能被抑制而不能篩選。所以，在SS培養(yǎng)基平板上無(wú)生長(zhǎng)的標(biāo)本，不代表禽蛋表面沒有腸桿菌或其他種類的細(xì)菌，如金黃色葡萄球菌等。

本研究發(fā)現(xiàn)，北京禽類市場(chǎng)禽蛋表面的腸桿菌種類有11個(gè)種或?qū)?，?gòu)成最多的前3個(gè)種屬為埃希菌屬（42.6%）、克雷伯菌（17.6%）和假單胞菌屬（12.0%）。這種構(gòu)成不同于陳力力等的報(bào)道［4］，雞蛋殼表面細(xì)菌種類（構(gòu)成最多的前3個(gè)種屬為假單胞菌屬、埃希氏－志賀氏菌屬和不動(dòng)桿菌屬）。究其原因是兩者使用的方法不同，陳力力等采用的是菌落總數(shù)計(jì)數(shù)法，獲得的是所有可生長(zhǎng)的細(xì)菌，而本研究使用的是腸桿菌科強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基，因而獲得的僅是腸桿菌科細(xì)菌，這有利于篩選出腸桿菌科細(xì)菌，進(jìn)而分析其中的喹諾酮耐藥基因。另外，本研究采用16S rRNA序列的網(wǎng)上比對(duì)鑒定細(xì)菌種屬。在細(xì)菌基因組中，編碼16S rRNA的rDNA基因具有良好的進(jìn)化保守性，以及與進(jìn)化距離相匹配的良好變異性，所以成為細(xì)菌分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)識(shí)序列［5］。保守序列區(qū)域反映了生物物種間的親緣關(guān)系，而高變序列區(qū)域則能體現(xiàn)物種間的差異。目前16S rDNA的序列信息已經(jīng)廣泛應(yīng)用于菌種鑒定和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究。

在質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因中，首個(gè)喹諾酮類耐藥基因現(xiàn)命名為qnrAl［6］，隨后qnrB［7］、qnrS［8］等新型質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因陸續(xù)被報(bào)道。本研究在檢測(cè)了禽蛋表面腸桿菌科細(xì)菌中的上述3種耐藥基因，共30株菌種檢測(cè)到耐藥基因，陽(yáng)性率為27.8%，其中，不同種類的qnr基因，其陽(yáng)性率（qnrA為 6.5%，qnrB為 23.2%）明顯高于臨床來源腸桿菌科的細(xì)菌［9］，提示禽蛋表面腸桿菌科細(xì)菌耐藥的嚴(yán)重性。但本研究的所有菌株中，均未檢測(cè)出qnrS基因，而qnrS基因在食品來源的腸桿菌科細(xì)菌時(shí)有報(bào)道［10］。其原因可能是qnrS基因存在較大變異體［11］，本研究使用的qnrS引物無(wú)法擴(kuò)增而產(chǎn)生假陰性，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。同時(shí)，本研究根據(jù)菌株種屬的不同，耐藥基因呈陽(yáng)性的種屬，最多的為埃希氏菌屬、檸檬酸菌屬，以及普羅威登斯菌和克雷伯菌等，這些種屬的細(xì)菌攜帶喹諾酮耐藥基因，也在臨床和食品中有過報(bào)道［12-14］。本研究還在禽蛋表面分離鑒定到沙門菌和志賀菌這些常見的致病菌，其中沙門菌還攜帶喹諾酮耐藥基因（表3），因此應(yīng)警惕食源性疾病的發(fā)生。同時(shí)，本調(diào)研結(jié)果也表明，應(yīng)該打破過多依賴喹諾酮類藥物的現(xiàn)狀，藥物多樣化開發(fā)很有必要。

本研究的不足之處是采集的樣本量較少，加之使用的是腸桿菌科的強(qiáng)選擇性平板，所以篩選到的腸桿菌科細(xì)菌種類有限，并且喹諾酮耐藥基因的陽(yáng)性率不足以做統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

致謝：本研究由十一學(xué)校付鑫老師指導(dǎo)完成。本研究的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容在中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所完成，一并致謝！

主要參考文獻(xiàn)

［1］Martinez-Martinez,L A Pascual,G A Jacoby.Quinolone resistance from a transferable plasmid.Lancet,1998,351(9105):797.

［2］Yi Yun Liu,Yang Wang,Timothty R Walshet al.Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China:a microbiological and molecular biological study.The Lancet Infections Diseases,2016,16(2):161.

［3］應(yīng)華永,徐瑞龍，胡付品，等.肺炎克雷伯菌中質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因qnr的檢測(cè)及其耐藥特征.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2009,32(3):293.

［4］陳力力，楊伊磊，青文哲，等.雞蛋殼表面細(xì)菌數(shù)量及種群多樣性分析.現(xiàn)代食品科技，2015,31（10）:74.

［5］Coenye T,P Vandamme.Intragenomic heterogeneity between multiple16S ribosomal RNA operons in sequenced bacterial genomes.FEMS Microbiol Lett,2003,228(1):45.

［6］李從榮，黃俊,呂霞,等.腸桿菌科細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因qnr的研究.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008,31（12）:1348.

［7］George A Jacoby,Kelley E Walsh,Debra M Mills,et al.qnrB,another plasmid-mediated gene for quinolone resistance.Antimicrob Agents Chemother,2006,50(4):1178.

［8］Mami Hata,Masahiro Suzuki,Masakado Matsumoto,et al.Cloning of a novel gene for quinolone resistance from a transferable plasmid in Shigella flexneri 2b.Antimicrob Agents Chemother,2005,49(2):801.

［9］黃麗，高曉坤,張宏.腸桿菌科細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥基因的檢測(cè).中國(guó)感染與化療雜志,2014(4):286.

［10］劉貴深，于濤.食源性沙門氏菌耐藥性及質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因檢測(cè).生物技術(shù)通報(bào),2014,46(8):202.

［11］閆雷，徐海.質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因qnr的分類、耐藥機(jī)制及其在國(guó)內(nèi)的流行狀況.微生物學(xué)報(bào),2016,56(2):169.

［12］茆海豐，劉洪書,趙勇,等.大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥物耐藥機(jī)制研究.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2015,(15):3375.

［13］Kees Veldman,Arie Kant,Cindy Dierikx,et al.Enterobacteriaceae resistant to third-generation cephalosporins and quinolones in fresh culinary herbs imported from Southeast Asia.Intetnational Journal of Food Microbiology,2014(177):72.

［14］Bin Li,Yong Yi,Qi Wang,et al.Analysis of drug resistance determinants in Klebsiella pneumoniae isolates from a tertiarycare hospital in Beijing,China.PLoS One,2012,7(7):e42280.