淡紫擬青霉固體發(fā)酵條件初步研究*

趙俊杰 王繼雯 ** 鞏 濤 劉 莉 岳丹丹 李冠杰 楊文玲 甄 靜 杜志敏 陳國參 劉杏忠

（1河南省微生物工程重點實驗室 河南鄭州 450008 2河南省科學(xué)院生物研究所有限責任公司 河南鄭州 450008 3中國科學(xué)院微生物研究所國家真菌學(xué)重點實驗室 北京 100101）

植物線蟲病是嚴重影響作物生長的主要病害之一，每年植物寄生線蟲給全球農(nóng)業(yè)造成的損失高達千億美元［1－2］。中國也是受植物線蟲病嚴重影響的國家之一，每年僅因線蟲侵染導(dǎo)致小麥發(fā)病的土地面積就達 6.7 萬 hm2以上［3－4］。 而防治植物寄生線蟲通常以化學(xué)殺蟲劑為主，但化學(xué)殺蟲劑的生產(chǎn)和使用給環(huán)境和土壤帶來嚴重污染,同時造成藥物殘留，危害人類健康［5］。而生物防治劑具有安全環(huán)保的優(yōu)點，成為防治線蟲研究的熱點。淡紫擬青霉是一種廣泛分布于土壤和植物根系的習居菌，能寄生于根結(jié)線蟲、孢囊線蟲等植物線蟲上，在侵染線蟲過程中可通過菌絲機械壓力和分泌的胞外酶聯(lián)合作用，使線蟲卵和蟲體破裂而死，是一種具有防治植物線蟲作用的生防菌株［6－7］。淡紫擬青霉屬于半知菌亞門絲孢綱絲孢目叢梗孢科擬青霉屬，具有末端膨大的分生孢子梗，分生孢子為橢圓形或紡錘形，無色至黃色，寬2～4 μm，呈平滑鏈狀［8］。 目前淡紫擬青霉的生產(chǎn)以液體發(fā)酵為主，但液體發(fā)酵存在一些不足，例如生產(chǎn)成本高、孢子含量不高、能耗較高、制劑保存時間短等［9］。與液體發(fā)酵相比，固體發(fā)酵具有原料價格低廉、設(shè)備簡單、產(chǎn)物加工方便等優(yōu)點，采用固體發(fā)酵法生產(chǎn)淡紫擬青霉，可降低生產(chǎn)成本，環(huán)保節(jié)能，無需處理大量的廢水和廢棄物，是一種比較理想的生產(chǎn)方式［10］。本研究對淡紫擬青霉固體發(fā)酵條件進行初步研究,為其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1）菌種：淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus），由本實驗室分離保存。

2）試劑：硝酸鉀、蔗糖、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸亞鐵、氯化錳等試劑，均為國產(chǎn)分析純。

3）儀器：HYG－A全溫搖瓶柜，太倉市實驗設(shè)備廠；DRP－9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；Nikon 50i顯微鏡，日本尼康公司。

4）培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基：蔗糖 30 g，NaNO33 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH自然?；景l(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮10 g加水10 mL組成。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備 無菌條件下，從長滿淡紫擬青霉孢子的PDA平板上接菌塊于種子培養(yǎng)基中，取100 mL種子培養(yǎng)基裝入250 mL錐形瓶中，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床上培養(yǎng)72 h。

1.2.2 分生孢子數(shù)的測定 準確秤取淡紫擬青霉發(fā)酵好的基質(zhì)1.0 g，加入10 mL無菌水，用研缽充分粉碎，收集孢子懸液，在顯微鏡下采用血球計數(shù)板測定分生孢子數(shù)。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基初篩 分別選用麩皮和玉米粉1∶1、麩皮和米糠 1∶1、麩皮和豆餅粉 1∶1、玉米粉和米糠 1∶1、玉米粉和豆餅粉 1∶1、米糠和豆餅粉 1∶1 代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的麩皮。將上述培養(yǎng)基10 g裝入250 mL錐形瓶中，加入水10 mL，拌勻于121℃滅菌30 min，冷卻后按占干料重5%比例接入孢子種子液，在30℃下培養(yǎng)10 d后測定孢子數(shù)。

1.2.4 培養(yǎng)基組成單因素實驗

1）麩皮與玉米的比例對產(chǎn)孢的影響。將麩皮與玉米分別按 0.5∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 和 6∶1的比例混合均勻，在250 mL錐形瓶中裝入10 g混合料和10 mL水，拌勻后于121℃滅菌30 min，冷卻后按5%比例接入孢子種子液，在30℃下培養(yǎng)10 d后測定孢子數(shù)。

2）料水比對產(chǎn)孢的影響。將麩皮與玉米按4∶1的比例混合均勻，在250 mL錐形瓶中裝入10 g混合料，改變料水比分別為 1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2 拌勻后于 121℃滅菌 30 min， 冷卻后按5%比例接入孢子種子液，在30℃下培養(yǎng)10 d后測定孢子數(shù)。

3）不同無機鹽對產(chǎn)孢的影響。將麩皮與玉米按4∶1的比例混合均勻，在250 mL錐形瓶中裝入10 g混合料，按料水比 1∶0.6比例加入水，按占干料重0.5%分別加入氯化鋅、氯化鎂、氯化鈣、氯化鉀、氯化錳和硫酸亞鐵，拌勻后于121℃滅菌30 min，冷卻后按5%比例接入孢子種子液，在30℃下培養(yǎng)10 d后測定孢子數(shù)。

4）氯化錳含量對產(chǎn)孢的影響。將麩皮與玉米按4:1的比例混合均勻，在250 mL錐形瓶中裝入10 g混合料，按料水比1∶0.6比例加入水，按占干料重 0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和 1%的添加量加入氯化錳，拌勻后于121℃滅菌30 min，冷卻后按5%比例接入孢子種子液，在30℃下培養(yǎng)10 d后測定孢子數(shù)。

5）培養(yǎng)基初始pH值。將配好的發(fā)酵培養(yǎng)基分別用1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和 9.0，經(jīng) 121℃滅菌 30 min，冷卻后按5%比例接入孢子種子液，在30℃下培養(yǎng)10 d后測定孢子數(shù)。

1.2.5 培養(yǎng)基組成正交實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以產(chǎn)孢子數(shù)為考察指標，設(shè)計4因素3水平的正交實驗，麩皮與玉米粉比例因素水平為3∶1、4∶1 和 5∶1；料水比因素水平為 1∶0.5、1∶0.6 和 1∶0.7；氯化錳含量因素水平為0.4%、0.5%和0.6%；初始pH值因素水平為6.0、7.0和8.0。

1.2.6 培養(yǎng)條件單因素實驗

1）接種量。將麩皮與玉米按4∶1的比例混合均勻，在250 mL錐形瓶中裝入10 g混合料，按料液比1∶0.6比例加入水，按占干料重0.6%加入氯化錳，調(diào)節(jié)pH為 7.0，拌勻于 121℃滅菌 30 min，冷卻后分別按2%、4%、6%、8%和10%接種量接入孢子種子液，于30℃下培養(yǎng)10 d后測定孢子數(shù)。

2）培養(yǎng)溫度。將麩皮與玉米按4∶1的比例混合均勻，在250 mL錐形瓶中裝入10 g混合料，按料液比1∶0.6比例加入水，按占干料重0.6%加入氯化錳，調(diào)節(jié)pH為7.0，拌勻于121℃滅菌30 min，冷卻后按6%比例接入孢子種子液，分別在溫度15℃、20℃、25℃、30℃、35℃培養(yǎng) 10 d后測定孢子數(shù)量。

3）培養(yǎng)時間。將麩皮與玉米按4∶1的比例混合均勻，在250 mL錐形瓶中裝入10 g混合料，按料液比1∶0.6比例加入水，按占干料重0.6%加入氯化錳，調(diào)節(jié)pH為7.0，拌勻于121℃滅菌30 min，冷卻后按6%比例接入孢子種子液，在溫度25℃下分別培養(yǎng) 5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d 后測定孢子數(shù)量。

1.2.7 培養(yǎng)條件正交實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以產(chǎn)孢子數(shù)為考察指標，設(shè)計3因素3水平的正交實驗，接種量因素水平為5%、6%和7%；培養(yǎng)溫度因素水平為20℃、25℃和30℃；培養(yǎng)時間因素水平為7 d、8 d和9 d。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基初篩 培養(yǎng)基初篩結(jié)果如圖1所示，培養(yǎng)基的組成為麩皮和玉米粉1∶1時，分生孢子數(shù)最高，為6.7×109CFU/g。其次是玉米粉和米糠 1∶1，分生孢子數(shù)為 5.6×109CFU/g，而培養(yǎng)基組成只為麩皮時，分生孢子數(shù)為4.0×109CFU/g。因此，適合淡紫擬青霉固體發(fā)酵培養(yǎng)基的基質(zhì)組成為麩皮和玉米粉。

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基初篩結(jié)果

2.2 培養(yǎng)基組成單因素實驗 如表1所示，在培養(yǎng)中添加適量的玉米粉對淡紫擬青霉產(chǎn)孢具有促進作用，麩皮與玉米粉組成比例為4∶1時，分生孢子數(shù)最高，為8.5×109CFU/g。料水比對固體發(fā)酵影響較大，料水比過低或過高都不利于淡紫擬青霉的產(chǎn)孢，料水比為1∶0.6時，分生孢子數(shù)最高，為9.3×109CFU/g。添加不同的無機鹽對淡紫擬青霉產(chǎn)孢的影響不同，氯化錳能促進淡紫擬青霉的產(chǎn)孢，而氯化鋅、氯化鎂、氯化鈣、氯化鉀及硫酸亞鐵均對淡紫擬青霉產(chǎn)孢有抑制作用。氯化錳的含量為0.6%時，分生孢子數(shù)最高，為10.7×109CFU/g,。中性環(huán)境有利于淡紫擬青霉生長產(chǎn)孢，偏酸或偏堿環(huán)境都不利于其生長，培養(yǎng)基初始pH值為7時，分生孢子數(shù)最高。

表1 培養(yǎng)基組成單因素實驗結(jié)果

2.3 培養(yǎng)基組成正交實驗 培養(yǎng)基組成正交實驗結(jié)果如表2所示。

表2 培養(yǎng)基正交實驗結(jié)果

由表2可知，培養(yǎng)基的最佳組合為A2B2C3D1，即麩皮和玉米粉 4∶1、料水比 1∶0.6、氯化錳含量 0.6%、初始 pH 6.0，分生孢子數(shù)最高，為 12.9×109C－FU/g。由極差值R分析可知，影響分生孢子數(shù)的因素順序為A＞D＞C＞B，即麩皮和玉米粉比例＞初始pH值＞氯化錳含量＞料水比，其中麩皮和玉米粉比例對分生孢子數(shù)影響最大。按表2中最佳培養(yǎng)基組成做驗證實驗，分生孢子數(shù)為12.9×109CFU/g。

2.4 培養(yǎng)條件單因素實驗 培養(yǎng)條件單因素實驗結(jié)果如表3所示。接種量過低或過高都不利于淡紫擬青霉的產(chǎn)孢，接種量為6%時，分生孢子數(shù)最高，為 11×109CFU/g。淡紫擬青霉在溫度為20～30℃范圍內(nèi)都能較好地生長，培養(yǎng)溫度為25℃時最有利于其產(chǎn)孢，分生孢子數(shù)為11.7×109CFU/g。隨著培養(yǎng)時間的增加，淡紫擬青霉的分生孢子數(shù)也隨之增加，當培養(yǎng)時間為8 d時，分生孢子數(shù)到達最高，為11.8×109CFU/g，而培養(yǎng)時間繼續(xù)增加，分生孢子數(shù)略為降低。

表3 培養(yǎng)條件單因素實驗結(jié)果

2.5 培養(yǎng)條件正交實驗 培養(yǎng)條件的正交實驗結(jié)果如表4所示。

表4 培養(yǎng)條件正交實驗結(jié)果

由表4可知，培養(yǎng)條件的最佳組合為A2B2C3，即接種量6%，培養(yǎng)溫度25℃，培養(yǎng)時間為9 d，分生孢子數(shù)為13.5×109CFU/g。由極差值R分析可知，影響分生孢子數(shù)的因素順序為A＞B＞C，即接種量＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時間，其中接種量對分生孢子數(shù)影響最大。按表4中最佳培養(yǎng)條件做驗證實驗，分生孢子數(shù)為13.5×109CFU/g。

3 討論

淡紫擬青霉固體發(fā)酵對營養(yǎng)物質(zhì)要求不高，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成多以農(nóng)副產(chǎn)品為主，例如麩皮、玉米粉、米糠等，原料易得，生產(chǎn)成本較低，同時又能為淡紫擬青霉的生長產(chǎn)孢提供有利養(yǎng)分［11－12］。本實驗通過對發(fā)酵培養(yǎng)基的基質(zhì)的篩選發(fā)現(xiàn)，以麩皮和玉米粉組成復(fù)合培養(yǎng)基比較適宜淡紫擬青霉生長，在麩皮中添加適量的玉米粉能夠促進淡紫擬青霉的產(chǎn)孢，過量的玉米粉會使培養(yǎng)基結(jié)塊，影響培養(yǎng)基的通氣性，不利于淡紫擬青霉的生長。黃永兵［13］的研究也表明含玉米粉的培養(yǎng)基有利于淡紫擬青霉的生長。在淡紫擬青霉固體發(fā)酵中，料水比對產(chǎn)孢有較大的影響，料水比過大時，培養(yǎng)基含水量少，不利于淡紫擬青霉的孢子萌發(fā)，而料水比過小時，培養(yǎng)基含水量大，會因供氧不足而影響淡紫擬青霉的生長。本實驗的結(jié)果表明，料水比為1∶0.6時，最有利于淡紫擬青霉產(chǎn)孢，這與谷軍［14］的研究結(jié)果相一致。無機鹽對淡紫擬青霉固體發(fā)酵有重要的影響，添加適合的無機鹽能夠促進孢子萌發(fā)，本實驗研究表明，添加氯化錳能促進淡紫擬青霉產(chǎn)孢，汪軍［15］的研究也表明添加錳離子能提高淡紫擬青霉的產(chǎn)孢量。培養(yǎng)基的初始pH值也會影響淡紫擬青霉的產(chǎn)孢，偏酸或偏堿都不利于其生長，中性環(huán)境下比較適宜其生長。接種量對固體發(fā)酵有著較大的影響，接種量過小時，不能滿足菌種萌發(fā)需要量，淡紫擬青霉生長緩慢產(chǎn)孢量少，接種量過大時，不利于菌體對營養(yǎng)的有效利用，淡紫擬青霉產(chǎn)孢量也會降低。溫度也是影響淡紫擬青霉產(chǎn)孢的重要因素，溫度升高有利淡紫擬青霉的產(chǎn)孢，但固體發(fā)酵為放熱過程，溫度過高會將培養(yǎng)基內(nèi)的菌落燒死，本實驗結(jié)果表明淡紫擬青霉適宜的發(fā)酵溫度為20～30℃，在25℃時生長最好。淡紫擬青霉固體發(fā)酵時間在8～10 d時，孢子產(chǎn)量較高，繼續(xù)增加培養(yǎng)時間，淡紫擬青霉代謝能力減弱，孢子產(chǎn)量開始下降。本實驗對淡紫擬青霉固體發(fā)酵條件進行了初步研究，旨在為淡紫擬青霉固體發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考，下步需要對淡紫擬青霉固體發(fā)酵的放大實驗條件下相關(guān)參數(shù)進行探索，最終實現(xiàn)淡紫擬青霉固體發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)。

4 結(jié)論

本實驗對淡紫擬青霉固體發(fā)酵條件進行了初步研究，通過單因素實驗和正交實驗對固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，淡紫擬青霉固體發(fā)酵最佳的培養(yǎng)基組成為麩皮和玉米粉4∶1、料水比 1∶0.6、氯化錳含量 0.6%、初始 pH 值為6.0，固體發(fā)酵最佳的培養(yǎng)條件為接種量6%，培養(yǎng)溫度25℃，培養(yǎng)時間為9 d，在此條件下淡紫擬青霉固體發(fā)酵的分生孢子數(shù)為13.5×109CFU/g。

主要參考文獻

［1］Brand D,Soccol C R,Sabu A.et al.Production of fungal biological control agents through solid state fermentation:a case study on Paecilomyces lilacinus against root－knot nematodes.Micologia Aplicada International,2010,22(1):38.

［2］Morton C O,Hirsch P R,Kerry B R.Infection of plant－parasitic nematodes by nematophagous fungi－a review of the application of molecular biology to understand infection processes and to improve biological control.Nematology,2004,6(2):167.

［3］李紅梅,王暄,彭德良.小麥孢囊線蟲病概況及江蘇省的發(fā)生現(xiàn)狀與防治對策.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(6):2.

［4］袁虹霞,陳莉,李洪連,等.小麥禾谷孢囊線蟲生防真菌的篩選與鑒定.植物保護學(xué)報,2011,38(1):53.

［5］劉青娥,曹鵬飛.植物線蟲的研究和防治.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(18):4646.

［6］Khan H U,Riaz A,Waqar A.et al.Evaluation of the Combined Effects of Paecilomyces lilacinus and Trichoderma harzianum Against Root－knot Disease of Tomato.Journal of Biological Sciences,2001,1(3):139.

［7］Kiewnick S.Effect of temperature on growth,germination,germ－tube extension and survival of Paecilomyces lilacinus strain 251.Biocontrol Science&Technology,2006,16(5):536.

［8］Yu Z,Zhang Y,Zhang X.et al.Conversion of food waste into biofertilizer for the biocontrol of root knot nematode by Paecilomyces lilacinus.Environmental Technology,2015,36(24):3.

［9］肖順.根結(jié)線蟲寄生真菌資源與淡紫擬青霉的研究.福州:福建農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文,2006.

［10］牟宏晶,楊路清,張輝,等.淡紫擬青霉的固體發(fā)酵條件研究.技術(shù)交流,2008,30(4):69.

［11］Sharma A,Sharma S,Mittal A.et al.Statistical optimization of growth media for Paecilomyces lilacinus 6029 using nonedible oil cakes.Annals of Microbiology,2013,64(2):518.

［12］張春龍.淡紫擬青霉顆粒菌劑研制及其防治禾谷孢囊線蟲研究.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2011.

［13］黃永兵.淡紫擬青霉固體發(fā)酵技術(shù)研究.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2006.

［14］谷軍,張曉彥,沙長青.淡紫擬青霉固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化.生物技術(shù),2014,24(6):96.

［15］汪軍,楊臘英,毛超,等.淡紫擬青霉E7菌株固體放大發(fā)酵產(chǎn)孢培養(yǎng)基和工藝條件研究.熱帶作物學(xué)報,2013,34(10):2039.