酶催化過程的全程模擬

趙 媛 曹澤星

酶催化過程的全程模擬

趙 媛1曹澤星2,*

(1河南大學天然藥物與免疫工程重點實驗室，河南開封475004；
2廈門大學化學化工學院，福建省理論與計算化學重點實驗室，福建廈門361005)

酶催化包括底物到活性區(qū)的輸運、選擇催化化學反應及產(chǎn)物釋放等復雜過程，由于復雜的蛋白質(zhì)環(huán)境效應，任一化學和非化學過程都有可能是決定酶活性的關鍵步驟。為了全面認識酶催化活性，我們對幾類酶催化過程進行了廣泛的組合量子/分子力學(QM/MM)和經(jīng)典分子力學(MM)動力學模擬(MD)研究，詳細地討論了整個酶催化過程的分子機制、關鍵殘基的作用和蛋白質(zhì)環(huán)境效應，豐富了對酶催化活性的認識。隨著多尺度模型和計算模擬方法的進一步完善與發(fā)展，有望實現(xiàn)超大復雜生物酶催化過程的全程模擬研究，為酶工程領域的相關研究提供支持。

酶催化；底物輸運；自由能計算；QM/MM MD模擬；隨機加速動力學模擬

1 引言

1.1 酶催化特點及其調(diào)控因素

酶是一種具有生物催化功能的復雜高分子體系，是生物體中不可缺少的催化劑。如果酶缺失或酶活性降低，生命活動將發(fā)生紊亂，甚至無法維持1－9。通常酶催化具有很高的活性，其催化過程具有高度的專一性，即一種酶僅催化一種或一類底物參與的生物化學過程，并生成特定的產(chǎn)物。酶催化可以在溫和的條件下進行，其活性與環(huán)境溫度和pH值密切相關，溫度和pH偏高或者偏低，都會顯著影響酶的催化活性。如果遇到過酸、過堿或溫度升高，酶的空間結構遭到破壞，就會導致酶變性失活。此外，催化活性還會受到多種其它因素調(diào)控，如抑制劑和激活劑調(diào)節(jié)、反饋抑制調(diào)節(jié)、變構調(diào)節(jié)和共價修飾調(diào)節(jié)等，有些酶的催化活性還與輔酶因子有關10。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，保守殘基對底物結合和催化活性調(diào)控的作用機制、蛋白質(zhì)構象的pH依賴性、底物和殘基質(zhì)子化狀態(tài)等對酶催化效率的影響也是不可忽視的11－18。如6-磷酸葡糖胺脫氨酶(glucosamine 6-phosphate deaminase，NagB)中的催化三聯(lián)體(catalytic triad)Asn128-His130-Glu135以及羥氰裂解酶(hydroxynitrile lyase，HNL)中的三聯(lián)體Ser80-His235-Asp207，在催化過程中起著十分重要的作用，其酶催化最初的質(zhì)子轉移就是由這些保守殘基的協(xié)同作用引發(fā)的16－18。HbHNL酶中的Thr11、Ile12、Ser80、Cys81、Leu157、His235和Lys236等殘基通過與底物相互作用，將其限域在酶催化活性位點16；HbHNL和MeHNL酶中的殘基Trp128在反應物進入活性位點及產(chǎn)物釋放中，起到門控“開-關”的作用16,17；活性區(qū)賴氨酸質(zhì)子化狀態(tài)可以改變整個酶催化反應機制16,17；NagB中底物氨基的質(zhì)子化狀態(tài)將顯著影響其催化N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)開環(huán)的機理，且反應活性口袋側鏈殘基His145的質(zhì)子化狀態(tài)會影響其lid motif區(qū)的“開-關”動力學行為，進而控制底物的結合，改變酶的活性18。

1.2 底物/產(chǎn)物輸運與酶催化

在蛋白質(zhì)環(huán)境中，酶催化全過程通常由一系列的化學步和非化學步組成，其中非化學步主要包括底物結合到活性位點的輸運和產(chǎn)物從反應區(qū)域的釋放(見圖1)1－7,9,19。由于復雜的蛋白質(zhì)環(huán)境效應，其中任何一個步驟都可能對酶催化效率產(chǎn)生重要影響。理論上，通過對酶催化過程的全程模擬，可以構造酶催化過程相對自由能變化的全景圖，準確預測催化過程的決速步驟，深入了解酶催化微觀機理，全面認識蛋白質(zhì)環(huán)境中酶催化特性，進而有針對性地調(diào)控酶催化劑的活性。這將有利于仿酶催化體系的設計和相關的應用研究，在酶工程領域的研究中具有重要意義。

底物到活性區(qū)域的輸運是酶催化過程的第一步，對酶催化過程有著不可忽視的影響，甚至有可能成為整個酶催化效率的決定性因素，近年來備受關注16,17,20－28。實驗上主要通過晶體結構和殘基突變分析等方法，推測可能的輸運通道及關鍵殘基，并結合瞬態(tài)動力學等方法預測底物傳遞的kcat值。比如在羥氰裂解酶(HNL)的研究中，實驗研究組就通過晶體結構分析，預測了可能的底物傳遞通道，并通過將通道關鍵殘基突變的方法，對其進一步驗證29,30；在胞嘧啶脫氨酶的研究中，Yao等28通過瞬態(tài)動力學研究，推測產(chǎn)物釋放可能是酶催化過程的決速步驟。然而，盡管如此，在實驗上仍然很難獲取底物或產(chǎn)物進出酶活性位點時的結構和酶構象的變化信息。理論上，隨著分子動力學理論方法的發(fā)展，不但可以找到最為可能的反應通道，而且可以獲取底物傳遞過程中的熱動力學性質(zhì)、關鍵殘基和蛋白質(zhì)構象變化，為實驗研究提供理論支持20－27。最近，我們通過隨機加速分子動力學(random acceleration molecular dynamics，RAMD)和傳統(tǒng)分子動力學(classical molecular dynamics，MD)模擬，獲得了HNLs酶催化過程中底物/產(chǎn)物輸運的可能通道及傳遞過程中蛋白質(zhì)的構象變化等信息16,17。

趙媛，1987年生。2015年于廈門大學獲取理學博士學位，現(xiàn)為河南大學天然藥物與免疫工程重點實驗室講師?，F(xiàn)主要從事生物體系多尺度計算模擬及計算機輔助藥物設計相關領域的研究。

曹澤星，1962年生?，F(xiàn)為廈門大學化學化工學院教授，博士生導師。研究興趣包括：激發(fā)態(tài)與光化學、無機與金屬有機化學反應機理、復雜體系與酶催化過程的多尺度模擬、低維納米材料的計算設計與模擬。

圖1 酶催化過程(底物結合、化學反應、產(chǎn)物釋放)Fig.1 Enzymatic process(substrate binding,chemical reaction,and product release)

酶催化反應機理是實驗和理論都非常關注的焦點。實驗上，主要采用X射線晶體衍射和核磁共振等實驗手段，獲取生物酶體系的結構，并通過同位素示蹤、殘基突變、酶反應動力學參數(shù)測定等方法表征酶催化反應機理。但是，由于很難捕捉催化過程中的過渡態(tài)和瞬時中間體的結構信息，加之酶靜態(tài)晶體結構和活性態(tài)的結構差異，導致催化機制推測上的多樣性及不準確性。隨著理論與計算化學的發(fā)展，尤其是量子-經(jīng)典力學組合方法(combined quantum mechanics/molecular mechanics，QM/MM)的不斷完善，使得從原子和電子水平上解釋酶催化反應機理成為可能，彌補了實驗方法的局限性31,32。比如來自橡樹和木薯的羥氰裂解酶(HbHNL&MeHNL)在碳碳鍵生物逆合成方面具有重要作用，二者高度同源，但是實驗基于獲取的原生態(tài)和突變體的晶體結構，推測兩個酶具有不同的催化機制，且活性位點賴氨酸質(zhì)子化對它們的調(diào)控作用也不一致33。而在理論上，基于酶相關的晶體結構，采用MM MD和QM/MM MD方法，建立了這兩類酶活性態(tài)的初始結構，系統(tǒng)地研究了賴氨酸質(zhì)子化狀態(tài)對兩類酶催化活性的影響，對實驗推測的酶催化機理進行了一定修正，使之更能合理地解釋有關實驗現(xiàn)象16,17。

2 計算方法

2.1 MM MD與RAMD方法

分子動力學(molecular mechanics molecular dynamics，MM MD)方法主要基于牛頓經(jīng)典力學建立多粒子系統(tǒng)的運動方程組，通過數(shù)值求解，模擬系統(tǒng)隨時間推進的微觀過程，獲得系統(tǒng)粒子相軌跡，進而研究該系統(tǒng)的平衡熱力學性質(zhì)及結構動力學性質(zhì)等。在MM MD模擬中，首先要搭建初始模型，并對其進行優(yōu)化，消除初始模型中的不合理構象；然后對模型進行長時間分子動力學模擬，使系統(tǒng)達到平衡，并收集平衡后的數(shù)據(jù)，通過統(tǒng)計方法對系統(tǒng)的熱力學性質(zhì)等進行分析。其中，合理選取系統(tǒng)邊界和粒子間作用勢能模型、設定粒子初態(tài)、建立模擬算法計算粒子間作用力和各粒子的速度和位置等都有助于改進分子動力學模擬。常用的分子動力學模擬軟件有Amber34、Namd35、Gromacs36－39、Charmm40、Tinker41和Lammps42等。

隨機加速分子動力學方法核心在于對體系中處于活性位點的底物或產(chǎn)物分子質(zhì)心或某個自定義原子上額外施加一個隨機方向的力，推動其移動，直至離開整個酶體系，使其暴露于外部溶劑中，以此尋找底物或產(chǎn)物傳遞通道。在RAMD模擬中，給定初始的加速度及距離閾值，在一段時間內(nèi)，當?shù)孜锘虍a(chǎn)物達到或超過設定閾值，方向繼續(xù)保持；否則，將施加另一個隨機方向的力，以此來獲取底物或產(chǎn)物分子傳遞的可能通道。但是，當隨機作用力大于蛋白質(zhì)系統(tǒng)對底物或產(chǎn)物約束力時，就有可能推動其朝向錯誤的方向，此時，就需要RAMD結合MD的方法來解決這個問題。當?shù)孜锘虍a(chǎn)物受力逃離初始位置，經(jīng)典MD模擬就會開啟平衡整個體系，在一定程度上糾正過強的隨機作用力，使底物朝正確方向移動。在RAMD模擬中，加速度和閾值的設定非常重要，為了獲得合理可行的模擬結果，通常需要設置多個加速度、多個閾值，根據(jù)軌跡統(tǒng)計，來獲取通道情況。目前可用Amber34、Namd35、Gromacs36－39和Charmm40來實現(xiàn)RAMD的計算。

目前，將MM MD和RAMD相結合是研究底物輸運可能通道及其相應熱動力學性質(zhì)的重要方法之一，在酶催化過程的全程模擬研究中具有重要意義15－17。

2.2 QM/MM與QM/MM MD方法

近年來，量子-經(jīng)典力學(quantum mechanics/ molecular mechanics，QM/MM)方法已經(jīng)成為研究酶催化過程中化學反應步的強大工具43－60。其中，QM方法用來描述關鍵區(qū)域(quantum mechanics subsystem，QS)，如化學反應活性區(qū)域，MM方法用來描述活性區(qū)域環(huán)境(molecular mechanics subsystem，MS)，如周圍蛋白質(zhì)環(huán)境及溶劑。QM/ MM方法可以在考慮蛋白質(zhì)和介質(zhì)環(huán)境的前提下，從原子及電子水平上合理描述酶催化體系的結構、反應機理及其能量學性質(zhì)(圖2)。而QM/MM MD則是在QM/MM的水平上進行分子動力學模擬，并結合傘形采樣(umbrella sampling，US)等技術，可以獲得蛋白質(zhì)和介質(zhì)環(huán)境動力學對催化反應過程的影響及其反應過程的自由能性質(zhì)，相對于QM/MM計算獲得的靜態(tài)結構和能量信息而言，自由能變化可以更加合理地描述酶催化反應的特征。值得注意的是，當體系劃分為QS區(qū)和MS區(qū)之后，二者之間會形成邊界，如何描述兩個區(qū)域間的邊界相互作用也是QM/MM方法一直關注的問題。

QM/MM方法計算體系的能量時，通常采用減法方案和加法方案。減法方案的能量表達式為：

EQM/MM=EMM(MS+QS)+EQM(QS)－EMM(QS)其中，EMM(MS+QS)為MM水平下獲得的MS和QS區(qū)域的總能量，EQM(QS)為QM水平下QS區(qū)域的能量，EMM(QS)為MM水平下QS區(qū)域的能量。它的優(yōu)點是在QS區(qū)和MS區(qū)之間沒有耦合項，處理較為簡單直接。缺點是在QS區(qū)也采用力場來處理，在一些情況中不可行。而且當有化學反應發(fā)生時，QS區(qū)電荷分布會發(fā)生變化，在處理靜電相互作用中，用固定原子點電荷描述是不準確的。此外，無法考慮MS區(qū)對QS區(qū)電子密度的極化。Morokuma等61,62提出的ONIOM方法運用此種方案。加法方案的能量表達式為：

圖2 QM/MM系統(tǒng)Fig.2 General QM/MM system

EQM/MM=EQM(QS)+EMM(MS)+EQM/MM(QS/MS)其中，EQM(QS)和EMM(MS)為QS區(qū)域和MS區(qū)域能量項，EQM/MM(QS/MS)為QS和MS區(qū)域相互作用能，一般包括成鍵相互作用項和非鍵相互作用項，而非鍵相互作用項又包括靜電相互作用和范德華相互作用。靜電相互作用是處理耦合的關鍵，通常采用機械嵌入(mechanical embedding)、靜電嵌入(electrostatic embedding)和極化嵌入(polarized embedding)來處理。在大多數(shù)機械嵌入中，QS區(qū)域是孤立的，其電子密度不會受到MS區(qū)域的影響，且處理QS及MS之間相互作用是在MM水平下進行的。其優(yōu)勢是減小了計算量，但較為粗糙。ONIOM(MO:MM)方法61,62則通過這種嵌入方案來處理QS和MS區(qū)域間的靜電耦合。靜電嵌入方案則是機械嵌入方案的改進，在此方案中，將QS與MS之間靜電相互作用當做單電子算符考慮到QM哈密頓算符中。此時，QS區(qū)電子結構會被MS區(qū)的電荷分布所極化，提高了計算精度。在極化嵌入方案中，兩個區(qū)域可以相互極化，即MS區(qū)也會被QS區(qū)域所極化。常用的模型有charge-on-aspring model63，induced dipole model64和fluctuating charge model65。在這種方案下，要獲取總能量，在QM波函數(shù)每一步自洽場迭代都需要進行一次MM極化計算。這種處理非常耗時，也會帶來收斂問題。因此，此方案往往適用于MS區(qū)域較小的體系66。

針對邊界處理，目前較為流行的處理方法有：連接原子法(link-atom scheme)67-72，邊界原子法(boundary-atom scheme)60,73-78和定域軌道法(localizedorbital scheme)43,46,53,79-84(圖3)。連接原子法是處理QM與MM邊界問題最直接的方法。它在QM與MM切斷處Q1―M1引入一個額外的原子中心或一個懸空的鍵B來滿足Q1的自由價態(tài)。通常采用氫原子，但也可以是任何單價原子或基團。其中，電子飽和部分包括B和Q，采用QM處理；Q1―M1鍵用MM描述。邊界原子法是利用一個特殊的類似“兩面神”的邊界原子Cps來代替M1原子，既作為正常的MM原子參與MM計算，又用來飽和Q1的自由價態(tài)，出現(xiàn)在QM計算中。它可以避免連接原子法中引入額外原子的問題，還能夠模仿邊界上MM基團的電子特征。大多數(shù)邊界原子法的提出都基于單價贗勢(或有效勢)，贗勢局域在M1原子的位置，可利用參數(shù)化來重現(xiàn)特定期望的性質(zhì)，如利用C―C單鍵的截斷來模仿甲基。目前，這類方法也有許多發(fā)展，如調(diào)節(jié)原子(adjusted connection atom)75、贗鍵(pseudobond)60,73,74,85、有效團勢(effective group potentials)76,86－88、量子覆蓋勢(quantum capping potentials)78,89、極小原理有效哈密頓(effective hamiltontians from a minimum principle)77、多中心價電子有效勢(multicentred valence-electron effective potentials)90等。定域軌道法是采用一個凍結的雜化軌道來飽和QM-MM邊界的懸空鍵。其共同點是在一個前線原子上設置一組合適的定域軌道，并保持這些軌道凍結，不參與SCF迭代。這類方法主要有局域自洽場(local self-consistent field)80－82,84,91、凍結軌道(frozen orbitals)53,54,92、廣義雜化軌道(generalized hybrid orbitals)46,83,93－95和有效碎片勢(ffective fragment potentials)79,96－98等。

圖3 (a)連接原子法；(b)邊界原子法；(c)定域軌道法Fig.3 (a)Link-atom scheme;(b)boundary-atom scheme; (c)localized-orbital scheme

2.3 自由能計算方法

自由能與實驗數(shù)據(jù)有直接可比性，是構造酶催化過程全景圖不可缺少的數(shù)據(jù)之一，通?？煞譃楹ツ坊羝澴杂赡?A)或吉布斯自由能(G)。亥姆霍茲自由能適合正則系綜(canonical ensemble，即NVT系綜)，吉布斯自由能適合NPT系綜，其中，ΔG=ΔA+ΔPV。生物大分子是一個凝聚相體系，因此，可將ΔPV近似為0，那么ΔG≈ΔA。對于蛋白質(zhì)環(huán)境中的化學反應，自由能不能只基于靜態(tài)電子結構計算獲取相對能量值，而需考慮到體系的漲落，合理描述反應的動態(tài)過程。

目前，自由能計算方法種類較多，如傘形采樣99－102、自由能微擾103－105、熱力學積分(thermodynamic integration，TDI)106、metadynamics107－109和Jarzynski equality110－113等。US主要通過施加偏勢來改變勢函數(shù)，使得體系能夠在高能區(qū)采樣，而后根據(jù)概率密度求解自由能數(shù)據(jù)，較多應用于對新提出的自由能計算方法準確性檢驗111,112,114－116；FEP基本思想是在初末態(tài)間插入若干中間態(tài)，通過獲取各態(tài)間自由能變化，來獲取初末態(tài)自由能變化，這種方法原理嚴格，不需要規(guī)定反應路徑，對于小分子來說較為精確117－119；TDI與FEP類似，只是對兩個狀態(tài)間自由能差的定義不同，利用各態(tài)能量系綜平均值獲得自由能，近年來，自適應偏置力(adaptive biasing force，ABF)方法120－122就是在TDI的基礎上發(fā)展起來的，它引入了偏置力概念，提高采樣效率，且采樣均勻；metadynamics方法主要通過對體系低自由能區(qū)不斷施加額外的高斯型排斥勢能函數(shù)，使其到達高自由能區(qū)域，進而通過施加的勢能函數(shù)來對自由能進行計算，此方法不需要事先對反應路徑有預先判斷，因此，在尋找最優(yōu)反應路徑方面有較大優(yōu)勢123；Jarzynski equality方法是需要施加額外的恒速運動諧振勢使得體系到達高自由能區(qū)進行采樣，由大量的不可逆功的系統(tǒng)平均來求解反應過程的自由能，在操作便捷及計算效率上有較大優(yōu)勢111。上述幾種方法在自由能勢能面構造中，均得到了廣泛應用111,112,114－124。

2.4 關鍵殘基作用分析方法

關鍵殘基在底物/產(chǎn)物輸運及酶催化化學反應過程中起著十分重要的作用，通常采用殘基突變方法，討論保守殘基在酶催化過程中所扮演的角色。例如，將重要殘基突變?yōu)楸彼?，通過QM/ MM計算或MM MD模擬，以及和原生酶體系結果的比較，可以探明關鍵殘基在酶催化過程中不同階段所起的結構或功能作用。

理論上，評估關鍵殘基在底物結合中的作用，常采用molecular mechanics generalized born surface/ poisson-boltzmann surface area(MM-GB/PBSA)方法。該方法是基于分子力學與連續(xù)介質(zhì)模型的一種結合自由能計算方法，已成功應用于蛋白質(zhì)－配體125－130，蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)131－133，蛋白質(zhì)－肽相互作用134－136的研究中。配體(L)和受體(R)形成復合物RL的結合自由能(ΔGbind)的計算如下：

ΔGbind=ΔH－TΔS≈ΔEMM+ΔGsol－TΔS

其中，ΔEMM、ΔGsol和－TΔS分別代表氣相MM能量變化、溶劑自由能變化和結合熵變。ΔEMM包括鍵長、鍵角和二面角能量、靜電相互作用能和范德華相互作用能。ΔGsol是溶劑化能總和，包括采用GB和PB模型計算得到的極化溶劑化能(極化部分)和采用溶劑可及表面積(solvent accessible surface area，SASA)得到的非靜電溶劑化能(非極化部分)。

3 計算研究進展

3.1 羥氰裂解酶催化過程中自由能變化全景圖的構造

羥氰裂解酶(hydroxynitrile lyases，HNLs)能夠催化氰醇生成相應醛(酮)及氫氰酸(HCN)，HCN的釋放不僅可以幫助植物抵御食草動物及微生物的侵害137，而且能夠為天冬氨酸的生物合成提供氮源138。此外，其逆反應可以用來合成手性化合物，并具有較高選擇性139－142。近幾年，HNLs已經(jīng)成功應用于藥物的生物逆催化合成143－149。因此，對HNLs催化過程的深入研究將有助于工業(yè)產(chǎn)物優(yōu)化及生物催化設計。最近，我們采用MM和QM/ MM MD的方法，結合傘形采樣技術，對來自木薯的羥氰裂解酶(hydroxynitrile lyases from Manihot esculent，MeHNL)催化過程進行了全程模擬，獲得的自由能變化全景圖見圖4(a)17。整個酶催化過程包括底物氰醇到酶活性位點的輸運、羥氰裂解成丙酮和氫氰酸和產(chǎn)物釋放三個步驟。

對于底物/產(chǎn)物的輸運等非化學步，通過RAMD MD模擬，探明了反應物進入活性位點和產(chǎn)物釋放的可能通道及其重要性17。計算模擬中，定義中心碳原子為丙酮氰醇、丙酮和HCN的近似質(zhì)心，采用 20.9、18.8、16.7、14.65、12.56、10.47和8.37 kJ·nm－1·g－1的加速度和0.0005 nm的閾值來驅動底物/產(chǎn)物的傳遞和可能通道確定。對于底物輸運和產(chǎn)物釋放，分別獲得28條軌跡，并發(fā)現(xiàn)三條可能通道(分別定義為通道A、B、C)。通道A位于殘基180－190和Trp128之間，通道B位于殘基115－130和Trp128之間，通道C位于殘基115－130和210－225之間，三個通道距離蛋白質(zhì)邊緣的距離分別為1.2、1.2和1.5 nm。而且，通道A的口袋比B和C寬，由此推測通道A是最具有優(yōu)勢的傳遞通道(見圖4(b))。通過對底物的通過幾率進行統(tǒng)計，進一步驗證了通道A具有絕對的優(yōu)勢。在底物和產(chǎn)物的輸運過程中，通道A的貢獻在百分之八十以上，而落到通道B和通道C的軌跡非常少。在此基礎上，通過MM MD方法結合傘形采樣技術，對底物/產(chǎn)物通過主要通道輸運的能量性質(zhì)進行了計算分析，分別獲得了一維和二維相對自由能圖(見圖4(c))及其詳細的輸運機制。

計算模擬揭示，反應物結合至活性位點依據(jù)Trp128的翻轉可分為四步(見圖4(b))。首先，反應物逐漸靠近蛋白質(zhì)，并與Gln181和Trp128分別形成氫鍵和非鍵相互作用，推動底物進入蛋白質(zhì)通道，此時，Trp128和Met147處于關閉的狀態(tài)；然后，Trp128逐漸翻轉，通道打開，底物和Trp128的共軛環(huán)形成lone pair…π和π…π相互作用，并與Met147形成靜電相互作用；接下來，底物的―CH3基團和Trp128形成―CH3…π相互作用，Trp128逐漸關閉；最后，底物結合至活性位點，與Thr11、Ser80和 Lys237形成氫鍵相互作用，Ile12、Leu149、Leu158和Ile120形成疏水口袋來容納反應物的―CH3基團，此時，Trp128完全關閉。

HCN和丙酮的釋放可分為六個階段。第一階段，HCN離開活性位點，朝著通道開關移動，Trp128在“開-關”態(tài)之間轉換；第二階段，HCN穿過通道開關區(qū)域，Trp128逐漸關閉；第三階段，HCN完全釋放，體系能量到達局域最小值點；第四階段，丙酮試圖離開活性位點，并與Trp128形成―CH3…π、lone pair…π和π…π相互作用，驅使Trp128由閉態(tài)轉換為開態(tài)；第五階段，丙酮沿通道離出，Trp128逐漸恢復關閉狀態(tài)；最后，丙酮完全釋放，暴露于水環(huán)境中，通道完全關閉。

酶催化化學反應過程可分為三步(見圖4(d))，首先是雙質(zhì)子轉移，即質(zhì)子由底物傳遞給Ser80，Ser80又將自身的質(zhì)子傳遞給His236，形成兩性離子中間體組態(tài)IM1，經(jīng)過采樣統(tǒng)計，明確了雙質(zhì)子轉移是同時發(fā)生的；其次是C―CN鍵斷裂，形成中間體IM2，此時，氰根陰離子(CN－)形成，并被Lys237的―NH3+基團穩(wěn)定，形成強靜電相互作用；最后是HCN的生成，即Pc態(tài)，也經(jīng)歷了雙質(zhì)子轉移，即質(zhì)子由His236傳遞至Ser80，隨后Ser80將自身質(zhì)子傳遞給CN－。

從構造的自由能變化全景圖來看，反應物從酶外部進入活性位點，形成底物結合的B態(tài)，釋放51.9 kJ·mol－1能量，是整個酶催化過程的驅動力之一；催化化學反應步的能壘主要來自于C―C鍵的斷裂和HCN的生成，自由能跨度約為71.6 kJ· mol－1，決定了整個酶催化的進程；產(chǎn)物釋放二維自由能圖(見圖4(c))揭示，HCN的釋放先于丙酮，HCN釋放能壘約為8.4 kJ·mol－1，且放熱19.7 kJ· mol－1；丙酮釋放能壘約為41.9 kJ·mol－1，在一定程度上影響了酶催化效率，當釋放的產(chǎn)物分子進入到水介質(zhì)環(huán)境，強的溶劑化作用將釋放出顯著的能量，有助于酶催化過程的進行。

3.2 核苷水解酶催化過程自由能變化全景圖的構造

圖4 (a)催化過程自由能變化全景圖17；(b)底物輸運過程中具有代表性態(tài)的關鍵殘基及構象變化17；(c)產(chǎn)物釋放自由能變化圖17；(d)酶催化中的化學反應過程17Fig.4 (a)Free energy profile of the whole enzymatic catalysis17;(b)key residues and their conformational changes at the representative states in the main channel17;(c)free energy profile of product release17; (d)chemical reaction steps involved in enzymatic process17

核苷水解酶(nucleoside hydrolases，NHs)是一類含金屬離子Ca2+的金屬酶，在病原生物體嘌呤補救中扮演重要角色150,151，可以有效催化核糖核苷N-糖苷鍵水解生成核糖和堿基，因此，成為非常具有吸引力的抗寄生蟲靶標152,153，其水解反應過渡態(tài)類似物常用來設計NHs抑制劑。肌苷-腺苷-鳥苷-核苷水解酶(IAG-NH)是NHs中的一類，傾向于催化肌苷(inosine)、腺苷(adenosine)和鳥苷(guanosine)的水解154。實驗預測IAG-NH的催化過程可分為四個步驟，分別為底物結合至酶活性位點、化學反應、堿基釋放和核糖釋放155－157，其中核糖釋放可能是整個過程的決速步驟155,158。近期，Wu等11,15,159對IAGNH的催化過程進行了詳細研究，構造了其自由能全景圖(見圖5(a))。

QM/MM計算模擬表明11，肌苷在IAG-NH的催化作用下水解生成糖環(huán)和堿基，其中，糖環(huán)和堿基之間C―N鍵的斷裂以及糖環(huán)和水分子之間的C―O鍵生成是同時發(fā)生的(見圖5b)，底物N7位的質(zhì)子化可以顯著地降低化學步的能壘，預測的自由能能壘約為29.3 kJ·mol－1；隨后，堿基釋放所需的能量約為23.4 kJ·mol－1，顯然這些過程對整個酶催化過程影響不大159。最后，核糖的釋放包括核糖脫離Ca2+的配位形成自由態(tài)、周邊水分子替代核糖參與Ca2+配位和核糖穿過酶通道完全釋放三個步驟15。其中，自由態(tài)核糖通過通道完全釋放能壘約為54.4 kJ·mol－1，與估算的實驗值15569.9 kJ·mol－1較為吻合，是整個催化過程的決速步驟。

圖5 (a)催化過程自由能變化全景圖11,15,159；(b)IAG-NH催化肌苷水解機制11；(c)產(chǎn)物傳遞過程具有代表性態(tài)的關鍵殘基及構象變化15Fig.5 (a)Free energy profile of the whole enzymatic catalysis11,15,159;(b)hydrolytic mechanism of inosine catalyzed by IAG-NH11;(c)key residues and their conformational changes at the representative states for the product release15

為了深入了解糖基釋放決速步驟的相關信息，應用RAMD MD方法對核糖釋放通道進行了詳細研究15，動力學模擬采用了20.9、12.6和8.4 kJ·nm－1·g－1的加速度及0.0002和0.0004 nm的閾值，獲得18條軌跡。計算發(fā)現(xiàn)兩條通道(見圖5b)，主要通道在loop 1和loop 2之間，有13條軌跡落在其中，比例為72%；次要通道在loop 2和殘基17－184之間，軌跡比例為28%。值得注意的是酶活性位點距離主要通道和次要通道的距離分別為1.1和0.6 nm，為了探索距離長的反倒成為主要通道的原因，分別對它們進行了詳細研究，發(fā)現(xiàn)主要通道以極性殘基為主，如Asn12、Asp14、Glu82、His246和Arg252等，而次要通道則以非極性殘基為主，如 Trp185、Trp260、Phe79和Phe175，后者位阻較大，而且從通道寬度而言，主要通道優(yōu)于次要通道。此外，研究通過MM MD方法和傘形采樣技術獲得了糖環(huán)釋放過程主要通道的熱動力學性質(zhì)，結果顯示，隨著Trp83的“開-關”振動，一些水分子逐漸進入通道，造成糖環(huán)與通道殘基形成直接或間接的氫鍵相互作用，尤其是與Arg252之間的氫鍵相互作用導致其駐留時間增長；而且，通道主要殘基側鏈芳環(huán)較大，有較強的位阻效應。因此，二者共同阻礙了糖環(huán)的釋放，是核糖釋放能壘的主要來源。

3.3 底物及殘基質(zhì)子化對催化的影響

圖6 SmuNagB催化GlcN6P開環(huán)自由能曲線Fig.6 Relative free energy profiles of the ring-opening reaction along the reaction coordinate for SmuNagB color online

6-磷酸葡糖胺脫氨酶(NagB)屬于醛酮異構酶，能夠催化6-磷酸葡糖胺(GlcN6P)轉化為6-磷酸果糖(F6P)和氨分子，決定了N-乙酰胺葡萄糖(GlcNAc)的代謝方向160。實驗上對其蛋白質(zhì)結構、動力學性質(zhì)、lid區(qū)柔韌度、變構調(diào)節(jié)、基因重組、功能分析和催化機理進行了廣泛研究161－167，并發(fā)現(xiàn)其催化活性與pH值密切相關，在pH=7.5－9.5時，酶的催化速率達到最大(kcat＞30 s－1)，當pH〈6時，完全失去酶活性162。根據(jù)質(zhì)子化葡糖胺的pKa值168，GlcN6P的氨基存在兩種質(zhì)子化態(tài)，分別為―NH2和―NH3+。因此，理論上，針對這兩個態(tài)，分別建立去質(zhì)子化態(tài)模型和質(zhì)子化態(tài)模型，并采用QM/MM MD方法結合傘形采樣技術對兩個模型的GlcN6P的催化開環(huán)機理進行研究，獲得了二者參與開環(huán)過程的自由能圖(見圖6)。QM/MM MD結果顯示，對于去質(zhì)子化態(tài)模型而言，GlcN6P將質(zhì)子傳遞給His130與環(huán)C1―O5鍵斷裂是同時發(fā)生的，能壘約為87.9 kJ·mol－1。對于質(zhì)子化態(tài)的底物模型，開環(huán)為分步過程。首先，質(zhì)子從底物的O1轉移至His130的Nε，產(chǎn)生兩性離子中間體(IM1)，能壘為8.8 kJ·mol－1，此時，底物―NH3+能夠穩(wěn)定O1－。隨后，六元環(huán)C1―O5鍵斷裂，形成開環(huán)中間體IM2，能壘為75.4 kJ·mol－1，為開環(huán)反應的決速步驟。因此，質(zhì)子化的底物GlcN6P比去質(zhì)子化態(tài)的形式更易發(fā)生開環(huán)反應，且形成的中間體更穩(wěn)定。開環(huán)產(chǎn)物分解釋放氨并與介質(zhì)水強的溶劑化作用，將顯著地穩(wěn)定產(chǎn)物態(tài)，促進酶催化開環(huán)過程。

對于來自橡樹(HbHNL)和木薯(MeHNL)的羥氰裂解酶(hydroxynitrile lyases，HNLs)，兩類酶具有很高的同源性(77%sequence identity)33，然而，基于酶與復合物突變體系的晶體結構，實驗上建議兩類酶催化具有不同的反應機制。在HbHNL催化過程中，活性區(qū)域賴氨酸的質(zhì)子化態(tài)被認為具有十分重要的作用，然而對于MeHNL催化，實驗基于Ser80Ala突變體與氰醇復合物的晶體構型(PDB ID:1E8D)，認為活性位點賴氨酸對催化并無作用33。為了探明兩類酶催化機制的差異，基于MM MD模擬獲取的wild type酶與底物復合物的穩(wěn)定構象，采用QM/MM MD方法，并結合傘形采樣技術，我們對HbHNL和MeHNL的催化反應機理進行了系統(tǒng)研究16,17。計算模擬中，通過指定活性位點關鍵殘基賴氨酸不同的質(zhì)子化狀態(tài)，構建兩類酶的質(zhì)子化和去質(zhì)子化計算模型，以調(diào)查賴氨酸在催化過程中扮演的角色。我們的研究表明，對兩類酶催化過程，賴氨酸的質(zhì)子化狀態(tài)顯著地影響酶催化微觀機制。當酶活性區(qū)的賴氨酸處于質(zhì)子化狀態(tài)時，其化學步包含雙質(zhì)子傳遞(底物→Ser80→His236)、C―C鍵斷裂和HCN形成三個步驟，其中，一個顯著特點是在C―C斷裂之后，氰根陰離子(CN－)生成，并與活性位點賴氨酸的形成強靜電相互作用；對于去質(zhì)子化態(tài)模型而言，首先經(jīng)歷了雙質(zhì)子傳遞，隨后，C―C鍵斷裂和HCN生成是同時發(fā)生的，并且由于賴氨酸的―NH2基團為中性，無法穩(wěn)定CN－，因此，催化反應中并無CN－

生成。從反應能壘上看，HbHNL和MeHNL的質(zhì)子化態(tài)模型的總能壘分別為75.4和71.2 kJ·mol－1，而去質(zhì)子化態(tài)模型分別為92.1和129.8 kJ·mol－1。由此可見，活性位點賴氨酸的質(zhì)子化態(tài)在兩類酶催化反應中都具有重要作用。

上述實例討論了底物或殘基質(zhì)子化狀態(tài)的改變對酶催化過程的影響，很明顯，關鍵基團質(zhì)子化形式的改變，不但影響了整個酶催化效率，甚至完全改變了催化反應機制，這種現(xiàn)象是酶催化蛋白質(zhì)環(huán)境效應之一，也可能出現(xiàn)在其他的酶催化體系中。

3.4 殘基質(zhì)子化態(tài)對酶關鍵區(qū)域構象動態(tài)行為的影響

近幾年，來自大腸桿菌(Escherichia coli)和人類(Homo sapiens)的NagB六聚體及來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和變形鏈球菌(Streptococcus mutants)的NagB單體的晶體結構被相繼確定，但在現(xiàn)有的晶體中，僅有一個為酶-底物復合物的形式(PDB ID:2RI1)162(來 自 Streptococcus mutants，SmuNagB)，它是在酸性溶液中獲得的。晶體結構揭示，在活性區(qū)域結合口袋開口邊緣處存在一個靈活易變的lid motif，可以導致結合口袋處于“開態(tài)(open state)”或穩(wěn)定的“閉態(tài)(close state)”161,169。一旦活性口袋處在閉態(tài)，底物和產(chǎn)物無法進出酶催化活性區(qū)域。實驗上，SmuNagB酶催化D-葡糖胺-6-磷酸(GLcN6P)脫氨的活性與pH值密切相關，最高活性出現(xiàn)在pH=8.0－8.5的區(qū)間。為了理解lid motif調(diào)控活性口袋開關態(tài)的微觀機制及酶催化活性與pH值關系的本質(zhì)，我們對這類酶催化進行了廣泛的計算模擬研究。

基于SmuNgaB酶的apo態(tài)及SmuNagB-GlcN6P酶-底物復合物的晶體結構(PDB ID:2RI0，2RI1)162，建立了兩類計算模型18，分別代表酶的自由態(tài)和復合態(tài)，酸性條件下模型為Model A和Model B，堿性條件下的模型為Model C和Model D。為了減少計算量，僅考慮其中一條鏈。模擬研究發(fā)現(xiàn)，當體系平衡之后，底物進入酶的活性位點(Model B)，lid motif處于結合口袋上方，形成close態(tài)；然而在其他三個模型中，活性區(qū)域口袋均為open態(tài)。殘基結構漲落(RMSF)分析顯示，對于Model B，lid motif(由殘基152－168組成)的柔韌度非常小，而Model C和D柔韌度相似。進一步，活性區(qū)域結合口袋體積估算結果顯示，在酸溶液中，當?shù)孜锝Y合至活性位點時，lid motif經(jīng)歷了從open到close的動態(tài)變化(圖7)。但是，Liu研究組162獲得的酶-底物復合物晶體結構中的lid motif構型與apo態(tài)近似。通過比較MD模擬中不同階段的構象變化及RMSF值，我們發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，隨著模擬的進行，lid motif逐漸靠近底物存在的結合口袋，逐漸導致close態(tài)的形成，其柔韌度也逐漸降低，與EcoNagB及BsuNagB類似，都在底物結合時經(jīng)歷了類似的構象變化。和酸性溶液中不同的是，在堿性條件下，酶結合底物后，lid motif仍遠離活性通道，結合口袋處于open態(tài)。

圖7 酸性(a)和堿性(b)溶液中，SmuNagB的apo態(tài)(藍)和復合態(tài)(紅)的疊合圖、口袋表面圖和對應的RMSF值18Fig.7 Overlap for the apo state(blue)and the enzyme-substrate complex(red)in acidic(a)and basic solutions(b)along with RMSF values of the backbone and surface of the active site pocket18RMSF:root mean square fluctuation.color online

為了進一步理解lid motif動態(tài)行為的pH依賴性，理論上對活性口袋和lid motif之間的氫鍵網(wǎng)絡進行了統(tǒng)計。如圖8所示，在酸性溶液中，對復合態(tài)而言，Asn157和底物之間通過水分子形成了氫鍵網(wǎng)絡，使lid motif向活性位點靠近。而且Thr150&Glu135，Asn134&Hip145形成氫鍵的概率分別為32%和99.7%。在采樣過程中，四個殘基對lid motif的關閉起到誘導作用。但在apo態(tài)中，并未見此現(xiàn)象，lid motif始終停留在open態(tài)。因此，酸性溶液中，lid motif的構象變化來源于底物的結合。在堿性溶液中，無論酶的復合態(tài)還是apo態(tài)，lid motif總是停留在open態(tài)。而lid motif和活性位點之間的區(qū)域并無氫鍵網(wǎng)絡使lid區(qū)關閉，預測堿性和酸性溶液中的行為有所不同，可能在一定程度上受到了His145質(zhì)子化狀態(tài)的影響。His145雙質(zhì)子化使lid motif區(qū)與活性位點附近殘基形成氫鍵網(wǎng)絡，導致酸性溶液中的close狀態(tài)。但是，在堿性溶液中，氫鍵相互作用消失，lid motif區(qū)為open態(tài)。因此，從理論上可以推測出lid motif在酸堿條件下的不同動力學行為主要來源于His145的質(zhì)子化態(tài)及其導致活性位點氫鍵網(wǎng)絡的重排。

3.5 關鍵殘基在酶催化過程中的調(diào)控作用

圖8 Model B(a)，ModelA(b)和Model D(c)的活性位點及l(fā)id motif區(qū)氫鍵網(wǎng)絡詳情18Fig.8 Hydrogen bond networks around the active site and the lid region of Model B(a),ModelA(b),and Model D(c)18

實驗研究表明，催化三聯(lián)體(Asn128-His130-Glu135)，在NagB酶催化GlcN6P的開環(huán)反應中扮演了重要角色，其中，His130是中性的，它在開環(huán)過程中，誘發(fā)質(zhì)子轉移，且Asn128及Glu135單突變均能完全改變酶反應活性162。為了合理評估Asn128及Glu135在催化反應中的作用，理論上分別對Asn128Ala和Glu135Ala的單突變及雙突變體系進行了QM(B3LYP)/MM計算18。

對于雙突變體而言，去質(zhì)子化態(tài)雙突變體系能壘比原生物酶體系高42.7 kJ·mol－1，質(zhì)子化態(tài)雙突變體系質(zhì)子傳遞及C5―O1鍵斷裂比原生物酶體系高18.0和167.1 kJ·mol－1。酶活性消失主要來自于突變造成的活性位點氫鍵及極化相互作用的改變。對質(zhì)子化態(tài)模型而言，Asn128和Glu135突變將明顯降低酶活性，這與實驗觀測一致，同時也意味著質(zhì)子化態(tài)模型在催化過程中比重較大。在單突變體中，對去質(zhì)子化模型而言，Asn128Ala突變體的能壘比原生體系高40.0 kJ·mol－1，而Glu135Ala突變體則與原生體系較為接近；對質(zhì)子化模型而言，Asn128Ala和Glu135Ala單突變體系質(zhì)子轉移的能壘相對原生物酶體系分別增加25.5和12.6 kJ·mol－1，C5―O1鍵斷裂的能壘則分別增加210.2和193.8 kJ·mol－1。兩個結果都顯示Asn128在催化過程中比Glu135起到更重要的作用。此外，電荷分析證明Glu135Ala突變體較Asn128Ala而言，更能加強C1―O5鍵的極化作用，在一定程度上解釋了Glu135Ala單突變體鍵斷裂能壘與Asn128Ala相比較低的現(xiàn)象。

對于HbHNL酶催化，實驗上推測，如果將Trp128突變?yōu)锳la，將有利于更大的芳香氰醇進入活性位點170,171。理論上，通過MM MD模擬并結合傘形采樣技術，也證實Trp128在底物輸運中起到開-關的作用16。為了進一步探索Trp 128在底物結合及產(chǎn)物釋放中的功能及其對酶催化效率的影響，預測了Trp128Ala突變體系中底物輸運的自由能圖，發(fā)現(xiàn)底物釋放需要跨過33.5 kJ·mol－1的能壘，僅是原生酶體系(～67.0 kJ·mol－1)的一半。很明顯，雖然其他疏水殘基氫鍵網(wǎng)絡在一定程度上影響了底物傳遞，但Trp128的吲哚環(huán)帶來的位阻效應及其翻轉仍是能壘的主要來源。

除此之外，關鍵殘基在底物結合中同樣起著十分重要的作用。例如，在HbHNL酶催化的反應機理研究中，Gruber等33指出，Lys236、Ser80和Thr11與底物存在強的氫鍵及靜電相互作用，在底物結合中起著重要作用。為了進一步了解每個殘基的影響，我們對K236A、S80A、T11A突變體系和原生HbHNL體系的底物結合自由能進行了估算與分析16。計算結果表明，范德華、靜電相互作用和非極性溶劑效應為底物結合提供了主要驅動力；而極性溶劑化能和熵效應則起了負作用。強靜電相互作用抵消了極性溶劑化能的作用，對C―CN鍵的活化及斷裂而言非常重要。和原生HbHNL體系相比，K236A，S80A和T11A突變體系的結合自由能分別減小了12.4、19.8和5.1 kJ·mol－1，這可能主要來自于靜電相互作用。此外，從per-residue模式對各個殘基進行了自由能能量分解來看，位于活性位點的Ile12、Cys81、Leu157和His235對底物結合有顯著作用，其中，范德華及非極化溶劑能為主要貢獻。

4 結論與展望

本文簡要總結了我們近年關于幾類酶催化過程全程模擬研究的進展。通過構建合理的MM和QM/MM多尺度模型，基于經(jīng)典和量子-經(jīng)典動力學模擬，實現(xiàn)了對整個酶催化過程微觀機理的理論描述。模擬研究不僅可以預測酶催化化學反應過程的機理，而且能夠獲得底物輸運與產(chǎn)物釋放過程的分子機制及其能量學性質(zhì)，探明蛋白質(zhì)構象變化和關鍵殘基對酶催化的影響，為酶活性的調(diào)控、酶抑制劑的合理設計、仿酶催化新體系的發(fā)展等酶工程領域的相關研究提供理論依據(jù)。

基于全程模擬，可以獲得底物輸運通道的完整圖像和關鍵殘基的作用機制，有助于對酶和底物的結構進行針對性的改造，加強或減弱底物與通道側鏈殘基間的相互作用，實現(xiàn)底物選擇性的傳遞。對生物逆合成有機分子而言，在關鍵殘基的驅使下，使得具有不同官能團的有機分子進入酶活性位點，可以在一定程度上豐富分子合成的種類。在藥物分子設計中，可以根據(jù)獲得的殘基和底物作用模式，設計具有特定官能團的藥物分子，延長藥物-靶標作用時間，藥物-靶標作用時間的調(diào)控在藥物結合動力學中具有重要意義，這也是實驗研究較為關心的問題之一172。此外，基于對酶催化化學反應步模擬獲得的過渡態(tài)電子結構及其與周圍氨基酸殘基結合模式等信息，可以設計一個過渡態(tài)類似物，使其與酶緊密結合，而設計出的分子極有可能成為該酶的抑制劑，這也是基于機制或結構的現(xiàn)代計算機輔助藥物設計方法之一173－175。近期，Zhou等176通過QM/MM MD模擬，探明了HDAC酶催化反應的微觀機理，并發(fā)展了一種基于反應機理設計抑制劑的策略，設計出HDAC2選擇性抑制劑β-羥甲基查爾酮，而且，通過實驗驗證其結合能力較強，是HDAC1的20倍。

量子-經(jīng)典力學(QM/MM)組合方法是目前研究酶催化反應最為流行的方法之一，但隨著QM區(qū)域的增大，計算量也會顯著增加，尤其是QM/MM MD模擬，很難采用大的QM分區(qū)。此外，在QM/ MM中，MM部分的原子電荷一般都是非極化的，無法正確地描述QM和MM區(qū)域的相互作用，影響QM/MM的計算結果。目前的QM/MM方法仍存在許多挑戰(zhàn)，還需要發(fā)展理論新方法，合理描述QM/MM方法中多尺度邊界和長程QM-MM Coulomb相互作用，實現(xiàn)低標度QM計算和多尺度的快速Q(mào)M/MM MD模擬，提高QM/MM計算和QM/ MM MD模擬方法的精確性和效率。

近年來基于分塊的量子力學計算方法的發(fā)展為大的QM分區(qū)提供了可能177,178，并在QM/MM計

算中獲得應用。利用大分子體系內(nèi)的“化學局域性”，將較大的QM區(qū)域分塊處理，在減少計算量的同時獲取更為精確的結果，目前已經(jīng)逐步應用于蛋白質(zhì)-配體結合自由能和蛋白質(zhì)NMR化學位移等問題的計算，在藥物設計中具有重要應用價值178－181。粗?；肿觿恿W能夠在有限的計算能力下，對大尺度的分子體系進行描述，目前已經(jīng)應用于生物膜及蛋白質(zhì)生物合成等問題的計算中，在生物化學和分子生物學的理解中具有重要意義182,183，通過和QM/MM方法的結合，拓展多尺度模擬方法的應用。增強抽樣方法的發(fā)展有助于改進QM/MM MD方法掃描蛋白質(zhì)構象和預測其熱力學性質(zhì)的能力，使得理論與實驗的直接可比性更強184－186。介觀動力學的發(fā)展使宏觀熱力學與微觀動力學有效結合，在藥物運輸?shù)确矫婢哂惺种匾膽脙r值187。總之，這些多尺度計算模擬方法的發(fā)展和結合，可以突破現(xiàn)有方法在體系大小、時間尺度、準確性等方面的局限，實現(xiàn)復雜生物體系和酶催化過程的多尺度全程模擬。

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Global Simulations of Enzymatic Catalysis

ZHAO Yuan1CAO Ze-Xing2,*
(1KeyLaboratoryofNaturalMedicineandImmuno-Engineering,HenanUniversity,Kaifeng475004,HenanProvince,P.R.China;2Fujian Provincial Key Laboratory of Theoretical and Computational Chemistry,College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University,Xiamen 360015,Fujian Province,P.R.China)

Enzymatic catalytic processes generally involve substrate delivery,selective catalytic reaction,and product release.Owing to the complex protein environment effect,any nonchemical or chemical step may determine the enzyme activity.Herein,to comprehensively understand enzymatic activity,extensive combined quantum mechanics/molecular mechanics(QM/MM)and molecular mechanics(MM)molecular dynamics(MD) simulations were carried out on several kinds of enzymes.Possible reaction mechanisms,roles of the conserved residues,and effects of the protein environment on the whole enzymatic process are discussed in detail,which will enrich the knowledge of reactivity in proteins.With the improvement and development of multiscale models and computational methods,it is expected that global simulations of extremely large and complicated enzymes will enable and lend support to enzyme engineering.

Enzymatic catalysis;Substrate delivery;Free energy calculations;QM/MM MD simulation; Random acceleration molecular dynamics(DAMD)simulation

O641

Zhang,X.;Houk,K.Acc.Chem.Res.2005,38,379.

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doi:10.3866/PKU.WHXB201612191

Received:October 28,2016;Revised:December 19,2016;Published online:December 19,2016.

*Corresponding author.Email:zxcao@xmu.edu.cn;Tel:+86-592-2186081.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21133007,21373164,21172053).國家自然科學基金(21133007,21373164,21172053)資助項目