重組酶聚合酶擴增技術(shù)及其在動物病毒病檢測中的應(yīng)用

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

重組酶聚合酶擴增技術(shù)及其在動物病毒病檢測中的應(yīng)用

秦立得，南文龍，陳義平

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

重組酶聚合酶擴增技術(shù)是近年來建立起的一種常溫DNA擴增技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強、反應(yīng)速度快、所需儀器簡單等優(yōu)點。本文介紹了該技術(shù)的檢測原理、引物及探針設(shè)計和影響因素，分析了該技術(shù)在動物病毒病檢測方面的應(yīng)用，指出該技術(shù)具有良好的現(xiàn)場快速檢測與多重及大量樣品檢測的應(yīng)用前景。

重組酶聚合酶擴增技術(shù)；動物病毒??；研究進展；展望

1 RPA檢測原理

在目的DNA片段擴增的過程中，引物與uvsX重組酶形成的復(fù)合物與DNA結(jié)合并沿DNA鏈尋找引物的同源序列，完成定位后發(fā)生鏈交換反應(yīng)并打開2條DNA單鏈間的氫鍵，單鏈綁定蛋白（SSB）與單鏈DNA鏈結(jié)合，阻止形成雙鏈，之后Bsu聚合酶從發(fā)生鏈交換反應(yīng)的位置開始復(fù)制DNA；同時反應(yīng)體系中含有uvsY酶，能與uvsX結(jié)合并促進uvsX與單鏈DNA更加緊密的結(jié)合，以發(fā)生鏈交換反應(yīng)，如此循環(huán)，從而完成了對目的DNA片段的擴增（圖1）。

圖1 RPA擴增目的DNA過程

在RPA反應(yīng)體系中加入RNA逆轉(zhuǎn)錄酶體系，可實現(xiàn)對RNA的檢測（RT-RPA）；加入nfo、 exo或fpg等DNA損傷修復(fù)酶和相應(yīng)的熒光探針，可建立熒光定量RPA（Real-time RPA ，qRPA）和熒光定量反轉(zhuǎn)錄RPA（Real-time RT-RPA ，RT-qRPA）。反應(yīng)結(jié)束后，若采用瓊脂糖凝膠電泳進行結(jié)果判定，則首先需要回收DNA，以排除反應(yīng)組份造成的干擾；但是使用exo酶的RPA反應(yīng)無法使用該方法判定結(jié)果，因為反應(yīng)體系會降解擴增產(chǎn)物。qRPA和RT-qRPA通過實時監(jiān)測的熒光值來準(zhǔn)確判定結(jié)果，此外采用nfo酶的RPA還可采用側(cè)流層析試紙條（LFD-RPA）來判定結(jié)果。

2 RPA引物及探針設(shè)計

2.1 擴增DNA片段選取

RPA能夠擴增長約1.5 kb的DNA片段，但通常擴增長度在80～400 bp之間才可提高反應(yīng)靈敏性和特異性，且在100～200 bp的效果最佳[1]。同時，為避免非特異性擴增，最好選擇序列相似度小于64%的片段[3]。

2.2 引物設(shè)計

引物的設(shè)計原則包括：引物5′端最好為C，并避免出現(xiàn)連續(xù)的G，3′端最好為C或G；引物中避免出現(xiàn)回文序列、連續(xù)重復(fù)序列以及發(fā)卡結(jié)構(gòu)；引物GC含量控制在30%～70%；引物長度控制在45 nt內(nèi)，最好為30～35 nt，并避免形成引物二聚體。但已發(fā)表的文獻顯示，引物設(shè)計并沒有完全滿足上述條件要求。Daher等[2]對已發(fā)表的204對RPA引物進行分析統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，9% 的 RPA引物長度不足30 nt，7%的引物長度大于35 nt，10%的引物GC含量小于30%，但也有引物GC含量大于65%的情況。

2.3 探針設(shè)計

設(shè)計RPA探針時應(yīng)盡量避免引物和探針形成DNA互補，同時探針3′端必須添加阻斷物，防止誘導(dǎo)Bsu聚合酶擴增非目的DNA。當(dāng)熒光探針同時含有熒光基團和淬光基團時，不產(chǎn)生熒光信號；熒光探針與DNA鏈結(jié)合后，DNA損傷修復(fù)酶（nfo、exo和 fpg）識別特異位點，以切除淬光基團，熒光基團產(chǎn)生熒光信號并通過儀器讀取數(shù)值。其中，nfo和exo分別為大腸桿菌核酸內(nèi)切酶IV和外切酶III，能夠識別并切割探針上的四氫呋喃分子（THF ，dSpacer）的刪除淬光基團，fpg能夠識別并切除探針上與脫氧核糖相連的淬光基團。探針長度有所差異，通常exo和nfo探針長度為46～52 nt，fpg探針長度為35 nt左右。Daher等[2]統(tǒng)計分析已發(fā)表的64條RPA探針相關(guān)文獻時發(fā)現(xiàn)，75%為exo探針，14%為fpg探針，11%為nfo探針；17%的exo探針長度為34～44 nt，短于推薦的46～52 nt。

小流域面積相對較小，河道比降大，洪水匯流速度非?？欤樗笣q陡落，各小流域之間又相互關(guān)聯(lián)，加上山區(qū)小河流水文資料缺乏，目前預(yù)報方法不多。

3 RPA的影響因素

RPA作為一種分子檢測技術(shù)，其檢測靈敏度受復(fù)雜背景DNA的影響。2014年Brittany Rohrman等[4]運用RPA檢測血液中人類免疫缺陷病毒時，發(fā)現(xiàn)血液中背景復(fù)雜的DNA會影響反應(yīng)的靈敏度，在存在復(fù)雜DNA背景的條件下，延長反應(yīng)時間或增加引物濃度對提升RPA反應(yīng)靈敏度的效果不明顯；通過特異富集目的DNA并去除非特異的背景DNA，可有效提高反應(yīng)靈敏度。RPA擴增需要引物與重組酶形成復(fù)合物，尋找引物的同源序列并發(fā)生鏈交換反應(yīng)，引物以及與待擴增DNA相似度高的其他序列也會影響RPA。2014年，Daher等[3]研究證明RPA反應(yīng)同PCR等分子擴增技術(shù)相似，也能夠非特異擴增高度相似的基因；引物3′端僅存在1個與目的基因非配對脫氧核苷酸堿基，會影響RPA反應(yīng)，在引物3′端、5′端或中間位置存在3個及以上的與目的基因非配對脫氧核苷酸堿基，同樣會影響RPA反應(yīng)。

4 RPA在動物病毒病檢測方面的應(yīng)用

RPA技術(shù)在動物病毒檢測方面得到了開發(fā)與應(yīng)用，實驗證明這些方法都具有良好的敏感性和特異性，但相關(guān)研究較少（表1）。

4.1 豬病病毒檢測

2016年，Wang等[5]建立了檢測豬圓環(huán)病毒II型（PCV-2）的qRPA方法。該方法最低可檢測100個PCV-2基因組，靈敏度與qPCR 相同，較普通PCR提高了10倍，平行檢測48份病料樣品，RPA與qPCR結(jié)果一致，與普通PCR符合率為93.7% （45/48） 。2016年，Yang等[6]設(shè)計出了檢測豬細(xì)小病毒（PPV）NS1基因的qRPA和LFD方法。該方法最低可分別檢測到300 和400個含NS1基因的重組質(zhì)粒，平行檢測101份病料和27份陰性樣品，qRPA和LFD與qPCR結(jié)果符合率分別為94.4%和 100%。2016年，Yang等[7]研究了檢測高致病性豬藍耳病病毒的qRPA方法。該方法最低可分別檢測到70個含目的基因的重組質(zhì)粒，平行檢測125份臨床樣品，qRPA與qPCR檢測結(jié)果敏感性和特異性分別為97.6 %和100 %。

表1 RPA在動物病毒病檢測方面的應(yīng)用及結(jié)果統(tǒng)計

4.2 反芻動物病病毒檢測

2013年，El Wahed等[8]建立了檢測口蹄疫病毒的RT-qRPA和RT-qPCR方法，使用這2種方法平行檢測27份臨床樣品，發(fā)現(xiàn)RPA方法檢測靈敏度與PCR方法無顯著差異，檢測靈敏度分別為100% 和98%。2015年，Yang等[9]建立了檢測羊口瘡病毒的qRPA方法。該方法最低可以檢測到100個含目的基因的重組質(zhì)粒，使用該方法和qPCR方法平行檢測35份樣品， qRPA檢測敏感性和特異性分別為86%和100%；Yang等[10]還建立了LFD-RPA方法。該方法最低可以檢測到80個含目的基因的重組質(zhì)粒，使用該方法和qPCR方法平行檢測90份樣品，LFD-RPA與qPCR的檢測結(jié)果一致。此外Andrea Aebischer等[11]開發(fā)了可同時檢測牛腹瀉病毒和施馬倫貝格病毒的RPA方法，Amera等[12]開發(fā)了檢測牛冠狀病毒的RT-RPA方法，通過實驗證明這2種方法都具有良好的敏感性和特異性。

4.3 禽病病毒檢測

2015年，Nahed Yehia等[13]建立了檢測H5N1亞型禽流感HA基因的RT-qRPA方法。該方法最低可檢測到1個編碼禽流感HA基因的RNA分子，平行檢測30份樣品，檢測結(jié)果與qPCR一致。2015年， El Wahed等[14]研究了檢測H7和N9亞型流感病毒的RT-qRPA方法。該方法可分別檢測到10個H7亞型病毒RNA或100個N9亞型病毒RNA。

4.4 寵物病病毒檢測

2016年，Wang等[15]建立了檢測犬細(xì)小病毒的RPA方法。該方法最低可檢測到10個病毒基因組DNA，使用該方法和PCR平行檢測57份樣品，RPA檢測結(jié)果符合率為92.9 % 。

4.5 水生動物病病毒檢測

2014年，Xia等[16]建立了檢測白斑綜合征病毒的RPA方法。該方法最低可檢測到10個含目的基因的重組質(zhì)粒，使用該方法檢測34份臨床樣品，檢測結(jié)果與qPCR一致。2014年，Jaroenram等[17]研發(fā)了檢測傳染性皮下和造血器官壞死病毒的LFD-RPA方法。該方法最低可檢測到100個含目的基因的重組質(zhì)?；?00 pg病料提取DNA，使用該方法和PCR同時檢測117份樣品，RPA敏感性和特異性分別為100% 和94.12% 。2016年，Meagan等[18]建立了檢測錦鯉皰疹病毒的普通RPA和LFD-RPA方法。這2種方法可有效檢出處于潛伏期鯉魚的錦鯉皰疹病毒，最低可分別檢測到10個和50個病毒基因組，使用普通RPA和qPCR同時檢測13份已知病料，RPA方法結(jié)果檢測出所有12份陽性樣品，而qPCR方法僅檢出1份。

5 RPA應(yīng)用前景

5.1 現(xiàn)場快速檢測

目前有研究人員設(shè)計出了便攜式RPA儀器等快捷檢測工具，便于在野外或條件差的地區(qū)開展現(xiàn)場檢測。針對許多艾滋病高發(fā)區(qū)環(huán)境惡劣甚至沒有供電的情況，Lillis等[19]設(shè)計了用自然溫度或簡單裝置進行RPA反應(yīng)的方法，Crannell等[20]設(shè)計了在人腋窩處用體溫進行RPA反應(yīng)的方法，經(jīng)實驗證明這2種方法敏感性強，檢測結(jié)果與qPCR相符。2014年，在幾內(nèi)亞暴發(fā)埃博拉病毒疫情，科研人員設(shè)計出了以太陽能電池供能的用RT-RPA方法檢測埃博拉病毒的便攜式手提箱。該手提箱中包含RPA反應(yīng)和結(jié)果檢測所需的所有儀器設(shè)備，在實際運用中發(fā)現(xiàn)該手提箱檢測結(jié)果與qPCR結(jié)果一致，但應(yīng)用較qPCR更方便快捷，更適合于現(xiàn)場快速檢測[21]。

5.2 多重及大量樣品檢測

針對常見病原或經(jīng)常發(fā)生混合感染的疫病，設(shè)計不同的RPA檢測方法，并實現(xiàn)多重檢測，從而有效地提高檢測效率，擴大檢測范圍。目前通過將芯片技術(shù)與RPA整合實現(xiàn)了多重檢測，并且通過計算機軟件進行結(jié)果分析。若對該技術(shù)進一步開發(fā)，則可實現(xiàn)對大量樣品的自動化檢測，提高檢測效率。目前，RPA芯片技術(shù)已經(jīng)在食源性細(xì)菌和病毒檢測方面得到了開發(fā)與應(yīng)用。2014年，Kersting等[22]設(shè)計了可同時檢測淋病奈瑟菌、沙門氏菌和耐甲氧西林葡萄球菌的RPA芯片；2016年，Kunze等[23]通過在芯片上布置DNA陣列，實現(xiàn)了同時對多種病毒或細(xì)菌進行檢測的RPA方法；2016年，Choi等[24]成功開發(fā)出可同時檢測牛奶中沙門氏菌、大腸桿菌O157和副溶血性弧菌的RPA芯片。

[1] PIEPENBURG O，WILLIAMS C H，STEMPLE D L，et al. DNA Detection Using Recombination Proteins[J]. PLoS biology，2012，4（7）：e204.

[2] DAHER R K，STEWART G，BOISSINOT M，et al. Recombinase Polymerase Amplification for Diagnostic Applications[J]. Clinical Chemistry，2016，62（7）：947.

[3] DAHER R K，STEWART G，BOISSINOT M，et al. Influence of sequence mismatches on the specificity of recombinase polymerase amplification technology[J]. Molecular & Cellular Probes，2015，29（2）：116.

[4] ROHRMAN B A，RICHARDS K，et al. Inhibition of Recombinase Polymerase Amplification by Background DNA：A Lateral Flow-Based Method for Enriching Target DNA[J]. Analytical Chemistry，2015，87（3）：1963.

[5] WANG J，WANG J，LIU L，et al. Rapid detection of Porcine circovirus-2 by recombinase polymeraseamplification[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2016，28（5）：1-4.

[6] YANG Y，QIN X，ZHANG W，et al. Rapid and specifi c detection of porcine parvovirus by isothermal recombinase polymerase amplification assays[J]. Molecular and Cellular Probes，2016，30（5）：300-5.

[7] YANG Y，QIN X，SUN Y，et al. Rapid detection of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus by a fluorescent probe-based isothermal recombinase polymerase amplifi cation assay[J]. Virus Genes，2016，52（6）：883-886.

[8] WAHED A A E，ELDEEB A，ELTHOLOTH M，et al. A Portable Reverse Transcription Recombinase Polymerase Amplification Assay for Rapid Detection of Foot-and-Mouth Disease Virus[J]. Plos One，2013，8（8）：e7164 2.

[9] YANG Y，QIN X，WANG G，et al. Development of a fl uorescent probe-based recombinase polymerase amplifi cation assay for rapid detec tion of Orf virus[J]. Virology Journal，2015，12（1）：206.

[10] YANG Y，QIN X，WANG G，et al. Development of an isothermoal amplifi cation-based assay for rapid vi sual detection of an Orf virus[J]. Virology Journal，2016，13（1）：1-6.

[11] AEBISCHER A，WERNIKE K，HOFFMANN B，et al. Rapid Genome Detection of Schmallenberg Virus and Bovine Viral Diarrhea Virus by Use of I sothermal Amplifi cation Methods and High-Speed Real-Time Reverse Transcriptase PCR[J]. Journal of Clinical Microbiology，2014，52（6）：1883.

[12] AMER H M，ABD E W A，SHALABY M A，et al. A new approach for diagnosis of bovine coronavirus using a reverse transcription recombinase polymerase amplification assay[J]. Journal of Virological Methods，2013，193（2）：337-340.

[13] YEH IA N，ARAFA A S，WAHED A A E，et al. Development of reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for avian influenza H5N1 HA gene detection[J]. Journal of Virological Methods，2015，223（2）：45-49.

[14] ABD E L WAH ED A，WEIDMANN M，et al. Diagnostics-in-a-Suitcase：Development of a portable and rapid assay for the detection of the emerging avian infl uenza A（H7N9） virus[J]. Journal of Clinical Virology ：the offi cial publication of the Pan American Society for Clinical Virology，2015，69：16-21.

[15] WANG J，WANG J，LIU L， et al. Rapid detection of Porcine circovirus 2 by recombinase polymerase amplifi cation[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation：offi cial publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians，Inc，2016，28（5）：574-578. [16] XIA X，YU Y，WEIDMANN M，et al. R apid detection of shrimp white spot syndrome virus by real time，isothermal recombinase polymerase amplification assay[J]. PloS One，2014，9（8）：e104667.

[17] JAROENRAM W，OWENS L. Recombinase polyme rase amplification combined with a lateral flow dipstick for discriminating between infectious Penaeus stylirostris densovirus and virus-related sequences in shrimp genome[J]. Journal of Virological Methods，2014，208：144-151.

[18] PRESCOTT M A，REED A N，JIN L，et al. Rapid De tection of Cyprinid Herpesvirus 3 in Latently Infected Koi by Recombinase Polymerase Amplifi cation[J]. Journal of Aquatic Animal Health，2016，28（3）：173-180.

[19] LILLIS L，LEHMAN D，SINGHAL M C，et al. Non-instrument ed incubation of a recombinase polymerase amplification assay for the rapid and sensitive detection of proviral HIV-1 DNA[J]. PloS One，2014，9（9）：e108189.

[20] CRANNELL Z A，ROHRMAN B，RICHARDSKORTUM R. Equipment-Free Inc ubation of Recombinase Polymerase Amplification Reactions Using Body Heat[J]. PloS One，2014，9（11）：e112146.

[21] FAYE O，F(xiàn)AYE O，SOROPOGUI B，et al. Development and deployment of a r apid recombinase polymerase amplifi cation Ebola virus detection assay in Guinea in 2015[J]. European Communicable Disease Bulletin，2015，20（44）：120.

[22] KERSTING S，RAUSCH V，BIER F F，et al. Multiplex isothermal solid-phase recom binase polymerase amplification for the specifi c and fast DNA-based detection of three bacterial pathogens[J]. Mikrochimica Acta，2014，181（13-14）：1715-1723.

[23] KUNZE A，DILCHER M，ABD EL WAHED A，et al. On-Chip Isothermal Nucleic Acid Amplifi cat ion on Flow-Based Chemiluminescence Microarray Analysis Platform for the Detection of Viruses and Bacteria[J]. Analytical Chemistry，2016，88（1）：898-905.

[24] CHOI G，JUNG J H，PARK B H，et al. A centrifugal direct recombinase polymerase amplification （direct-RPA）microdevice for multiplex and real-time identifi cation of food poisoning bacteria[J]. Lab On a Chip，2016，16（12）：2309-2316.

（責(zé)任編輯：杜憲）

Recombinase Polymerase Amplif cation and Its Application in Detection of Animal Diseases

Qin Lide，Nan Wenlong，Chen Yiping
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

In recent years，a novel DNA amplifi cation technique named Recombinase polymerase amplifi cation（RPA）has been established，which possesses advantages of high sensitivity，strong specificity，fast reaction and simple apparatus needed in operation. Here，its detection principles，design of primers and probes and influence factors were introduced，its application in detection of animal viral diseases was also analyzed. Results showed that RPA had promising prospects in rapid detection at the spot，as well as the multiple and large-scale sample detection.

RPA；animal viral disease；research progress；prospect

S851.34

：A

：1005-944X（2017）05-0081-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.05.023

科技部種禽場疾病綜合防控與凈化技術(shù)體系評估、論證和推廣研究（2016YFD0501609）