4株布魯氏菌弱毒株對(duì)小鼠毒力及免疫保護(hù)力的評(píng)價(jià)

（石河子大學(xué)，新疆石河子 107590）

4株布魯氏菌弱毒株對(duì)小鼠毒力及免疫保護(hù)力的評(píng)價(jià)

劉升蘭，關(guān) 團(tuán)，王 震，王月麗，劉 洋，劉志科，孟露萍，張 輝，陳創(chuàng)夫

（石河子大學(xué)，新疆石河子 107590）

為檢測(cè)國內(nèi)外已有的布魯氏菌疫苗株S19、M5、S2和 RB51的胞內(nèi)存活力、毒力、免疫保護(hù)力以及抗體消長(zhǎng)水平，將上述4種疫苗株，分別以100:1的MOI侵染小鼠巨噬細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RB51的胞內(nèi)存活力最強(qiáng)；以1×106CFU/只免疫昆明小白鼠，測(cè)定各疫苗株在小鼠脾臟中的定居力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)M5的定居力最強(qiáng)；待疫苗株在小鼠體內(nèi)被清除后，以1×105CFU/只腹腔接種2308毒株，進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，檢測(cè)各疫苗株的保護(hù)力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)M5的保護(hù)效果最好；免疫后連續(xù)10周采集血清，用ELISA檢測(cè)血清中的IgG滴度、IFN-γ的表達(dá)水平及抗體消長(zhǎng)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S2、M5組的IgG水平高于其他組，而各組間的IFN-γ水平差異不顯著（P＞0.05）；分別用虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）和標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗(yàn)（SAT）檢測(cè)血清凝集狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S2、S19組的抗體持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)；剖檢各疫苗株對(duì)小鼠脾臟、肝臟、腎臟等組織引起的病理學(xué)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)M5引起的病變程度最強(qiáng)。

布魯氏菌；疫苗；毒力；免疫保護(hù)力；小鼠

布魯氏菌病是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種常見的人獸共患傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為須通報(bào)動(dòng)物疫病我國將其列為二類動(dòng)物疫病。

目前，布魯氏菌病的主要預(yù)防措施是接種疫苗。國內(nèi)應(yīng)用的疫苗主要是畜用羊種布魯氏菌M5、豬種布魯氏菌S2和牛種布魯氏菌S19。此外，歐美一些國家還廣泛應(yīng)用粗糙型流產(chǎn)布魯氏菌疫苗RB51（B. abortusRB51）。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平和動(dòng)物水平，對(duì)目前應(yīng)用的商業(yè)化疫苗弱毒株（M5、S19、RB51、S2）進(jìn)行比較，來評(píng)價(jià)其免疫效果，為實(shí)踐應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。布魯氏菌疫苗株S19、M5、S2、RB51及2308強(qiáng)毒株均由本研究室保存。

1.1.2 主要試劑。2種培養(yǎng)基，均購自美國BD公司；布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)試管凝集抗原，購自中國疾病預(yù)防控制中心 ；布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原，購自青島易邦生物工程有限公司；小鼠IFN-γ細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)試劑盒，購自美國GBD公司；布魯氏菌IgG ELISA檢測(cè)試劑盒，購自美國RD公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。100只昆明系小白鼠，購自石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 布魯氏菌胞內(nèi)存活力試驗(yàn)

1.3 動(dòng)物毒力試驗(yàn)

1.3.1 脾臟指數(shù)法測(cè)定細(xì)菌毒力。選取6～10周齡昆明系雌性小白鼠，分為5組；將S19、M5、S2和RB51疫苗株，均以1×106CFU/只分別腹腔接種于昆明小鼠，200 μL/只，另設(shè)PBS對(duì)照組。將各試驗(yàn)組小鼠分別于1、3、5、7周后稱量體重處死，無菌分離脾臟，稱重并記錄。

1.3.2 測(cè)定各疫苗菌株在小鼠脾臟內(nèi)的定居力。在小鼠被處死后，無菌分離脾臟，研磨，稀釋成不同的濃度梯度，涂布于布魯氏菌血清鑒定培養(yǎng)基；取各組平均值，計(jì)算菌落形成單位（CFU），觀察各疫苗株的定居力。

1.4 各疫苗株抗血清反應(yīng)試驗(yàn)

分離M5、S19、RB51、S2組小白鼠免疫后1～10周的血清，將各時(shí)間段的血清分別進(jìn)行RBPT和SAT試驗(yàn)。

1.5 小鼠動(dòng)物免疫保護(hù)力試驗(yàn)

這句，看你怎么狡辯！為什么不回我？有什么跟我說，不管怎樣，我都不會(huì)傷害你，我會(huì)盡力讓你快樂的。還有這句，我覺得愛是刻在心里的痕跡，愛得越深，刻痕也越深。領(lǐng)導(dǎo)大人，解釋啊，為什么給下屬的短信要愛啊愛的？

1.5.1 疫苗株保護(hù)力測(cè)定。分別在S2、RB51免疫小鼠6周后，M5免疫16周后，S19免疫14周后，用強(qiáng)毒株2308攻毒，進(jìn)行保護(hù)力測(cè)定試驗(yàn)。

1.5.2 測(cè)定免疫后小鼠血清IgG水平。分別在疫苗弱毒株免疫1、3、5、7、9周后，用ELISA方法檢測(cè)M5、S19、RB51、S2組的IgG滴度水平。

1.5.3 測(cè)定免疫后小鼠血清細(xì)胞因子IFN-γ水平。分別在疫苗弱毒株免疫1、3、5、7、9周后，檢測(cè)M5、S19、RB51、S2組的細(xì)胞因子IFN-γ的消長(zhǎng)水平。

1.6 利用組織切片技術(shù)觀察小鼠感染后的組織病理學(xué)變化

配制組織貯存液、染液，采集并保存小鼠肝、脾、肺、腎臟組織，制作病理組織切片，封固、晾干后顯微鏡下觀察。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 疫苗株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活力

胞內(nèi)復(fù)制試驗(yàn)結(jié)果顯示，各布魯氏菌疫苗株在侵染巨噬細(xì)胞后，細(xì)菌數(shù)量明顯減少，S2顯著低于S19，而且S2和S19均低于M5和RB51（圖1）。

2.2動(dòng)物毒力試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 脾臟指數(shù)法測(cè)定細(xì)菌毒力。接種M5和S19疫苗株小鼠的脾臟腫大明顯（P＜0.05），而接種S2和RB51疫苗株的不明顯（P＜0.05）（圖2）。

2.2.2 疫苗株在小鼠脾臟的定居力。統(tǒng)計(jì)免疫小鼠不同時(shí)期脾臟內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量，計(jì)算平均值，lgCFU±SD即為每組的細(xì)菌含量。結(jié)果可見，布魯氏菌 M5菌株和S19菌株可持長(zhǎng)時(shí)間存留在小鼠體內(nèi)，而RB51與S2菌株在7周后就會(huì)被清除（圖3）。

2.3 虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）和標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗(yàn)（SAT）結(jié)果

分別對(duì)各疫苗弱毒株免疫1～10周后的小鼠血清，進(jìn)行RBPT和SAT試驗(yàn)，檢測(cè)產(chǎn)生凝集抗體的持續(xù)時(shí)間，并確定免疫后的具體檢測(cè)時(shí)間（表1、表2）。

圖1 各疫苗株侵染小鼠巨噬細(xì)胞情況

圖2 各組和空白組的脾臟指數(shù)（數(shù)量級(jí)為1.0×10-3）

圖3 各疫苗株在小鼠脾臟的定居力

表1 RBPT試驗(yàn)結(jié)果

表2 SAT試驗(yàn)結(jié)果

SAT試驗(yàn)結(jié)果顯示，M5疫苗株在免疫3周后開始出現(xiàn)凝集，并持續(xù)至第9周，S2、S19疫苗株均于1周后開始出現(xiàn)凝集，并持續(xù)10周甚至更久，而RB51始終不出現(xiàn)凝集。

2.4 免疫保護(hù)力試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 各疫苗株保護(hù)力測(cè)定結(jié)果。用2308菌株攻毒各免疫組小鼠，發(fā)現(xiàn)RB51與S2組第1～3周的保護(hù)效果明顯弱于S19（P＜0.05），而S19第1～2周的效果明顯弱于M5（P＜0.05），具體結(jié)果見圖4。

2.4.2 免疫后小鼠血清特異性IgG水平測(cè)定

2.4.2.1 小鼠布魯氏菌IgG ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）。用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450值，并生成標(biāo)準(zhǔn)方程：y=0.0511x+ 0.1153。

2.4.2.2 小鼠血清中IgG含量。分別用ELISA試劑盒檢測(cè)免疫后第1、3、5、7、9周及攻毒后的第1～3周血清中的IgG含量，用酶標(biāo)儀測(cè)定檢測(cè)值。計(jì)算各時(shí)間段每個(gè)樣本的IgG含量。結(jié)果可見，各疫苗株均能刺激小鼠產(chǎn)生IgG抗體，且抗體水平隨著時(shí)間延長(zhǎng)而升高，但有一定的波動(dòng)；在免疫后第1、3、7、9周，S2、M5組抗體水平顯著高于對(duì)照組和其他組（P＜0.05），而在第3周時(shí)，S2組抗體水平明顯高于M5組（P＜0.05）；免疫菌株在小鼠體內(nèi)被清除后，用相同劑量的標(biāo)準(zhǔn)株攻毒，第1～3周的S2、M5組抗體水平均顯著高于其他組（P＜0.05）；而S19組、RB51組的抗體水平差異不明顯（P＜0.05），具體結(jié)果見圖6。

圖4 小鼠免疫后攻毒脾臟載菌量

圖5 小鼠布魯氏菌病IgG ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 小鼠血液IgG的含量

2.4.3 免疫后小鼠血清細(xì)胞因子IFN-γ 水平。小鼠細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)值標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7。用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中的IFN-γ含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各時(shí)間段、各樣本的IFN-γ含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各疫苗株均能刺激小鼠產(chǎn)生抗體，但抗體水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，差異越來越不明顯（圖8）。小鼠體內(nèi)的抗體被清除后，用相同劑量的2308強(qiáng)毒株攻毒，發(fā)現(xiàn)1、3周后的小鼠抗體水平顯著高于PBS組（P＜0.05）；而在2周后，S2、RB51組的抗體水平高于其他組（P＜0.05）。

圖7 小鼠布魯氏菌病IFN-γ ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖8 小鼠血液IFN-γ的含量

2.5 病理學(xué)切片觀察結(jié)果

感染15 d后，各組小鼠的肝臟都出現(xiàn)不同程度的病理變化：S19組出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹、脂肪變性，細(xì)胞核溶解或消失及出現(xiàn)少量結(jié)節(jié)；S2組出現(xiàn)結(jié)節(jié)，部分細(xì)胞壞死；RB51組沒有出現(xiàn)明顯病變（圖9）。

圖9 布魯氏菌感染的小鼠肝組織病理學(xué)觀察（HE400×）

感染15 d后4組小鼠脾臟也出現(xiàn)不同程度的病理變化。其中，M5組出現(xiàn)脾臟淋巴細(xì)胞增生，炎性細(xì)胞浸潤，部分出現(xiàn)紅髓充血；S19組髓質(zhì)中出現(xiàn)大量紅細(xì)胞，局部出現(xiàn)結(jié)節(jié)；RB51組出現(xiàn)數(shù)量較多、大小不等的結(jié)節(jié)，髓質(zhì)部有淤血；S2組呈現(xiàn)彌漫性散在性出血，其它病變不明顯（圖10）。

圖10 布魯氏菌感染的小鼠脾組織病理學(xué)觀察（HE400×）

感染15 d后，4組小鼠肺臟都出現(xiàn)不同程度的病理變化。其中，M5組小鼠肺泡腔間質(zhì)增寬，有少量炎性細(xì)胞浸潤；S19組有明顯的肺間質(zhì)增生、大量炎性細(xì)胞，肺泡腔內(nèi)有大量紅細(xì)胞；RB51組肺泡腔出現(xiàn)炎性細(xì)胞、散在紅細(xì)胞，支氣管周圍形成支氣管周圍炎；S2組病變不明顯（圖11）。

圖11 布魯氏菌感染的小鼠肺組織病理學(xué)觀察（HE400×）

感染15 d后，4組小鼠腎臟都出現(xiàn)了腎小管上皮管內(nèi)徑變小。其中，RB51、M5和S2組較明顯；RB51和S2組部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹、溶解，腎間質(zhì)出血、充血；S19組病變相對(duì)不明顯（圖12）。

圖12 布魯氏菌感染的小鼠腎組織病理學(xué)觀察（HE400×）

3 結(jié)果分析

本研究基于布魯氏菌弱毒株的免疫保護(hù)性，以小鼠為動(dòng)物模型，對(duì)市場(chǎng)商業(yè)化的疫苗弱毒株（M5、S19、RB51、S2）進(jìn)行系統(tǒng)比較?？傮w來說，M5、S19、S2、RB51作為現(xiàn)用的布魯氏菌疫苗株，均有一定的免疫保護(hù)效果。RB51在小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活力最強(qiáng)；M5在小鼠脾臟中的定居力最強(qiáng)；攻毒后保護(hù)力試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)M5的保護(hù)效果最好；S2、M5的抗體免疫消長(zhǎng)水平總體較高；RBPT和SAT試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，S2、S19的抗體持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)；M5對(duì)小鼠脾臟、肝臟、腎臟等組織產(chǎn)生的病變最明顯?？傊?，這幾種疫苗株在不同方面各有優(yōu)點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Evaluation on the Virulence and Immunological Protection of 4 Brucella Attenuated Strains in Mice

Liu Shenglan，Guan Tuan，Wang Zhen，Wang Yueli，Liu Yang，Liu Zhike，Meng Luping，Zhang Hui，Chen Chuangfu
（Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 107590）

To compare some characteristics of the 4 existingBrucellosisvaccine strains of S19，M5，S2 and RB51，a study was carried out on their viability of living in cells，virulence，immunological protection and the kinetics of antibody levels. Firstly，murine macrophage cells were inoculated with the above 4 vaccine strains（MOI=100：1），results showed strain RB51 had the longest survival time. Then immunizing Kunming white mice（1×106CFU per mouse）with the 4 strains to measure their ability of proliferating in spleen，and strain M5 displayed the strongest proliferation ability. After clearing away the immunized vaccines existing in mice，immunological protection of the vaccines was detected by peritoneal injection of virulent strain 2308 with 1×105CFU，results showed strain M5 worked the best. Subsequently，serum samples were collected for 10 consecutive weeks after vaccination，then the IgG titer，expression levels of cytokine IFN-γ and kinetics of antibodies were tested by ELISA. Results showed the IgG levels of group S2 and M5 were higher than others，while the IFN-γ expression of the 4 groups had no signifi cant difference（P＞0.05）.Serum agglutination was observed by both Bengal plate agglutination test（RBPT）and the standard tube agglutination test（SAT），results manifested that antibodies from group S2 and S19 were of long duration. At last，pathological autopsy of the immunized mice was conducted to observe the changes in spleen，liver，kidney and other tissues，and results showed pathogenic changes caused by M5 were severest than by other strains.

Brucella；vaccine；virulence；immunological protection；mice

S852.23

：A

：1005-944X（2017）05-0094-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.05.026

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31660705）

陳創(chuàng)夫