凝膠過濾/離子交換全二維液相色譜系統(tǒng)的構(gòu)建與評價(jià)

張 政, 唐 濤, 楊三東, 孫元社, 李 彤, 張維冰

(1. 齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院, 黑龍江 齊齊哈爾 161006; 2. 大連依利特分析儀器有限公司,遼寧 大連 116023; 3. 華東理工大學(xué) 上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200237)

研究論文

凝膠過濾/離子交換全二維液相色譜系統(tǒng)的構(gòu)建與評價(jià)

張 政1,2, 唐 濤2, 楊三東2, 孫元社2, 李 彤2, 張維冰1,3*

(1. 齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院, 黑龍江 齊齊哈爾 161006; 2. 大連依利特分析儀器有限公司,遼寧 大連 116023; 3. 華東理工大學(xué) 上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200237)

基于蛋白質(zhì)的尺寸及帶電性質(zhì),將凝膠過濾色譜(GFC)與離子交換色譜(IEC)兩種分離模式結(jié)合,采用雙捕集柱接口構(gòu)建了GFC/2×IEC二維液相色譜(2-D LC)分離系統(tǒng),同時(shí)考慮離子交換色譜分離蛋白質(zhì)對等電點(diǎn)范圍的限制,進(jìn)一步結(jié)合中心切割平行柱的方法實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)的全二維分離。為與后續(xù)蛋白質(zhì)在線酶解、多肽分離及質(zhì)譜鑒定匹配,系統(tǒng)中采用常規(guī)柱以保證蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定對樣品量的要求,3種常規(guī)分離柱分別選用凝膠過濾色譜柱TSK-GEL G3000SWXL(300 mm×7.8 mm, 5 μm)、強(qiáng)陰離子交換色譜柱Hypersil SAX(100 mm×4.6 mm, 10 μm)和強(qiáng)陽離子交換色譜柱Hypersil SCX(100 mm×4.6 mm, 10 μm)。最終以酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)提取液為樣品,對構(gòu)建的二維系統(tǒng)加以評價(jià),在總蛋白質(zhì)濃度13.5 mg/mL、上樣體積100 μL的條件下,將第一維分離等時(shí)間切割17次,并將切割餾分全部導(dǎo)入第二維繼續(xù)分離,二維系統(tǒng)在148 min內(nèi)獲得的總峰容量達(dá)到884。說明所構(gòu)建的系統(tǒng)可以用于蛋白質(zhì)的在線全二維分離。

全二維液相色譜;凝膠過濾色譜;離子交換色譜;強(qiáng)陰離子交換;強(qiáng)陽離子交換;蛋白質(zhì);酵母

蛋白質(zhì)組學(xué)研究目前已成為生命科學(xué)乃至自然科學(xué)領(lǐng)域的重大科學(xué)命題,與人體代謝及疾病的預(yù)測、診斷、治療等密切相關(guān)。蛋白質(zhì)和多肽等生物樣品的高效分離分析是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵與難點(diǎn)。高效液相色譜是常用的生物樣品分離手段,但隨著研究的深入,為獲得更大的峰容量和更高的分辨率,二維液相色譜(two-dimensional LC, 2-D LC)獲得了廣泛的關(guān)注,并在復(fù)雜生物樣品的分離分析中取得了令人矚目的成果。

前期工作中,我們已完成了離子交換色譜/反相色譜(IEC/RPC)[1,2]、強(qiáng)陰離子交換-五氟苯酚/反相色譜(SAX-PFP/RPC)[3]等2-D LC系統(tǒng)的構(gòu)建,并在蛋白質(zhì)、白酒和中藥等復(fù)雜樣品的應(yīng)用中取得了良好的分離效果。此外,其他學(xué)者建立的RPC/RPC[4,5]、親水作用色譜/反相色譜(HILIC/RPC)[6]、柱切換循環(huán)體積排阻色譜/反相色譜(csrSEC/RPC)[7]、陣列式(array-based)2-D LC[8]等二維分離系統(tǒng)已成功用于復(fù)雜生物樣品的研究中。SEC和IEC因具有良好的生物兼容性,已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中[9,10]。SEC和IEC分別與RPC結(jié)合所構(gòu)建的二維液相色譜系統(tǒng)也常被應(yīng)用于復(fù)雜樣品的分離分析[11,12],但將SEC和IEC這兩種分離模式彼此結(jié)合的研究仍較少。Bushey等[13]構(gòu)建了IEC/SEC全二維液相色譜系統(tǒng),通過對分離系統(tǒng)的自動化控制和方法優(yōu)化,在分離9種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的過程中獲得了126的峰容量；Elkin等[14]構(gòu)建了SEC/IEC二維系統(tǒng),采用中心切割法對復(fù)雜基質(zhì)中的肌醇六磷酸進(jìn)行二維分離,靈敏度和重復(fù)性均能滿足分析需求。與IEC/RPC或SEC/RPC二維液相色譜系統(tǒng)相比,SEC/IEC二維分離系統(tǒng)的分辨率略顯不足,但二者的結(jié)合除了具有良好的生物兼容性外,還具有良好的正交性,可以提供互補(bǔ)的樣品信息,其流動相的兼容性也可使樣品直接從一維轉(zhuǎn)移到另一維,無需特殊處理。

本文基于分子尺寸及帶電性質(zhì)的差異,將凝膠過濾色譜(GFC)與IEC兩種分離模式結(jié)合,同時(shí)考慮到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(pI)范圍對離子交換色譜分離的限制,進(jìn)一步在第二維并聯(lián)強(qiáng)陰離子交換和強(qiáng)陽離子交換(SCX)常規(guī)分析柱,以實(shí)現(xiàn)全等電點(diǎn)范圍蛋白質(zhì)的分離,最終將構(gòu)建的GFC/2×IEC全二維液相色譜分離系統(tǒng)應(yīng)用于酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)提取液的分離分析,在總分離時(shí)間148 min內(nèi),二維系統(tǒng)共獲得了884的峰容量。該系統(tǒng)可用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究中蛋白質(zhì)在線分離、在線酶解、肽段在線分離及質(zhì)譜鑒定分析平臺的蛋白質(zhì)初分離。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

全二維液相色譜分離系統(tǒng)(包括ichrom P5102高壓恒流泵、ichrom M5102組織器、ichrom D5101紫外-可見檢測器、P1201高壓恒流泵各兩臺)、Hypersil SAX色譜柱(100 mm×4.6 mm, 10 μm)、Hypersil SCX色譜柱(100 mm×4.6 mm, 10 μm)、Hypersil SAX捕集柱(10 mm×4.6 mm, 10 μm)、Hypersil SCX捕集柱(10 mm×4.6 mm, 10 μm)均由大連依利特分析儀器有限公司提供;TSK-GEL G3000SWXL凝膠過濾色譜柱(300 mm×7.8 mm, 5 μm,日本TOSOH公司);兩位十通閥(美國Valco Instruments公司);Rheodyne 7725i型進(jìn)樣閥(美國IDEX公司); CPX 130 SERIAL超聲波破碎儀(美國Cole-Parmer公司); MK3酶標(biāo)儀(美國Thermo公司); Allegra 64R離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)。

鹽酸胍(美國Sigma公司);磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、氯化鈉(NaCl)和磷酸(H3PO4)(分析純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司); 0.45 μm水系微孔濾膜(上海迪清過濾技術(shù)有限公司)。實(shí)驗(yàn)用酵母細(xì)胞由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所提供;實(shí)驗(yàn)室用純水為超純水機(jī)(德國Merck公司)制備。

1.2 酵母細(xì)胞中蛋白質(zhì)的提取

酵母細(xì)胞用6 mol/L鹽酸胍溶解,超聲破碎6 min,于4 ℃以20 000 g離心30 min,移取上清液,于-80 ℃保存待用。

1.3 流動相的配制

SAX的流動相A:準(zhǔn)確量取190 mL 10 mmol/L NaH2PO4溶液和810 mL 10 mmol/L Na2HPO4溶液,混勻,配制10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5); SCX的流動相A:準(zhǔn)確量取948 mL 10 mmol/L NaH2PO4溶液和52 mL 10 mmol/L Na2HPO4溶液,混勻,配制10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 5.6); SAX和SCX的流動相B:分別向1 L 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)和1 L 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 5.6)中加入58.44 g NaCl,配制SAX和SCX的流動相B。所有流動相經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后使用。

2.6 香菇普通粉、超微粉持水性比較 由圖6可見，香菇普通粉和超微粉的持水性指數(shù)存在顯著性差異(P<0.05)。這是因?yàn)殡S著粉體粒徑的減小，粉體分子變小，其對水分子的束縛力也變小，因而持水能力下降。此外，超微粉碎后粉末，由于破壁效應(yīng)，水溶性分子變多，也會使持水能力下降。

1.4 色譜條件

1.4.1 GFC分離體系

色譜柱:TSK-GEL G3000SWXL(300 mm×7.8 mm, 5 μm);流動相:10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5);等度洗脫;總分析時(shí)間:142 min;流速:0.1 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;檢測波長:280 nm;餾分切割次數(shù):17次。

1.4.2 SAX分離體系

色譜柱:Hypersil SAX(100 mm×4.6 mm, 10 μm);流動相A: 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5);流動相B: 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)-1 mol/L NaCl。梯度洗脫程序:0～4.50 min, 0%B～100%B; 4.50～4.51 min, 100%B～0%B; 4.51～6.00 min, 0%B。流速:2.0 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;檢測波長:280 nm。

1.4.3 SCX分離體系

色譜柱:Hypersil SCX(100 mm×4.6 mm, 10 μm);流動相A: 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 5.6);流動相B: 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 5.6)-1 mol/L NaCl。其他色譜條件同1.4.2節(jié)。

圖 1 全二維液相色譜系統(tǒng)及閥切換的示意圖Fig. 1 Schematic diagrams of comprehensive 2-D LC system and valves switcha. 1-10 positions; b. 1-2 positions; P1: HPLC constant flow pump; C1: gel filtration chromatography (GFC) analytical column; P2 and : HPLC gradient pump; T1 and : strong anion exchange (SAX) trap column; C2: SAX analytical column; UV and UV′: UV detector; P3: dilution pump; T2 and : strong cation exchange (SCX) trap column; : SCX analytical column; W: waste fluid.

1.5 GFC/2×IEC全二維液相色譜分離系統(tǒng)的構(gòu)建

2 結(jié)果與討論

2.1 GFC/2×IEC全二維液相色譜的分離原理

表 1 兩個十通閥的狀態(tài)及流動相在3種分離模式中的流路

本實(shí)驗(yàn)中,針對蛋白質(zhì)組成復(fù)雜、相對豐度差異大的特點(diǎn),第一維采用GFC常規(guī)分析柱,將蛋白質(zhì)按尺寸不同進(jìn)行分離;第二維采用IEC常規(guī)分析柱,將第一維洗脫餾分根據(jù)離子交換能力的不同進(jìn)一步分離。常規(guī)柱的柱容量較大,相比小柱容量的色譜柱,能夠提高進(jìn)樣量,從而提高檢測靈敏度。同時(shí)常規(guī)色譜柱的使用還可獲得更好的重復(fù)性和穩(wěn)定性,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)在線酶解、肽段在線分離及質(zhì)譜鑒定做好鋪墊。在全二維液相色譜中,第一維的流出組分需被第二維分離3次以上才能保證第一維的分辨率基本不變[15],因此第一維采用低流速(0.1 mL/min, 142 min)等度洗脫,第二維采用高流速(2.0 mL/min, 6 min)梯度洗脫。基于對蛋白質(zhì)等電點(diǎn)范圍的考慮,進(jìn)一步結(jié)合中心切割平行柱的方法,在第二維并聯(lián)SAX和SCX分析柱,實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)全等電點(diǎn)范圍的全二維分離。

2.2 色譜條件的優(yōu)化及性能評價(jià)

在凝膠過濾色譜分離中,當(dāng)流動相一定時(shí),流速對生物大分子的分辨率影響較小[16]。實(shí)驗(yàn)考察了不同流速下,酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)提取液在GFC中的分離情況。結(jié)果表明,酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)在低流速和高流速下的色譜峰形基本一致,考慮到兩維之間分析時(shí)間和分離速度的匹配性,最終選擇0.1 mL/min的洗脫流速進(jìn)行等度洗脫。同時(shí)考慮到兩維之間流動相的匹配性,GFC分離體系選擇與SAX分離體系中初始條件相同的流動相作為洗脫溶劑,排除流動相的不兼容問題。酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)的色譜圖見圖2。

圖 2 采用GFC時(shí)酵母蛋白質(zhì)的色譜圖Fig. 2 Chromatogram of the yeast protein by using GFC1-17: cutting times; column: TSK-GEL G3000SWXL (300 mm×7.8 mm, 5 μm); mobile phase: 10 mmol/L phosphate buffer (pH 7.5); isocratic elution; flow rate: 0.1 mL/min; injection volume: 5 μL; UV detection wavelength: 280 nm.

第二維IEC的分離情況受流動相的pH、鹽濃度和流速等因素的影響較大。為調(diào)節(jié)流動相的pH,緩沖液選擇緩沖范圍較寬的NaH2PO4和Na2HPO4緩沖體系。第二維IEC使用硅膠基質(zhì)型色譜柱,pH適用范圍為2.0～8.0,因此將第二維SAX分離體系流動相的pH設(shè)為7.5,對pI值小于7.5的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離;第二維SCX作為并聯(lián)色譜柱與SAX色譜柱同時(shí)使用,用來分離pI值大于或等于7.5的蛋白質(zhì),所以流動相的pH設(shè)為5.6。分別將流動相的pH設(shè)為5.6和7.5，不但可以實(shí)現(xiàn)全等電點(diǎn)范圍的蛋白質(zhì)的分離需求,還可滿足生物樣品對生存環(huán)境的要求,具有良好的生物兼容性。為使第二維能夠快速完成分離,選擇在流動相中加入1 mol/L的NaCl，并以2 mL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫,由于捕集柱與分析柱填料相同,而且是柱長分別為10 mm和100 mm的常規(guī)色譜柱,所以在高流速的分離過程中壓力相對較低,系統(tǒng)適用性良好。為使第二維的SAX和SCX分離同步,選擇相同的洗脫程序,優(yōu)化后的洗脫程序見1.4.2和1.4.3節(jié)。采用SAX和SCX色譜柱時(shí),酵母蛋白質(zhì)的色譜圖分別見圖3a和圖3b,可以看出,酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)在SAX色譜柱中保留較強(qiáng),因此在第二維分離中將SAX色譜柱置于SCX色譜柱前,構(gòu)成兩根分析柱并聯(lián)的結(jié)構(gòu)。

圖 3 酵母蛋白質(zhì)在(a)SAX和(b)SCX色譜柱中的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of the yeast protein by (a) the SAX and (b) SCX columnsa. column: Hypersil SAX (100 mm×4.6 mm, 10 μm); mobile phase A: 10 mmol/L phosphate buffer (pH 7.5); mobile phase B: 1 mol/L NaCl in 10 mmol/L phosphate buffer (pH 7.5); gradient elution: 0-4.50 min, 0%B-100%B, 4.50-4.51 min, 100%B-0%B, 4.51-6.00 min, 0%B; flow rate: 2.0 mL/min; injection volume: 5 μL; UV detection wavelength: 280 nm. b. column: Hypersil SCX (100 mm×4.6 mm, 10 μm); mobile phase A: 10 mmol/L phosphate buffer (pH 5.6); mobile phase B: 1 mol/L NaCl in 10 mmol/L phosphate buffer (pH 5.6); other conditions are the same as SAX separation.

二維在線分離系統(tǒng)良好的重復(fù)性是進(jìn)行分離分析的首要基礎(chǔ),根據(jù)文獻(xiàn)[7]對二維分離系統(tǒng)重復(fù)性的評價(jià)方法,選擇酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)提取液作為樣品，對全二維液相系統(tǒng)的重復(fù)性進(jìn)行評價(jià)。分別對第一維GFC分離體系和第二維SAX和SCX分離體系進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn),并對酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)的保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行分析。結(jié)果表明,在GFC分離體系中選取4個色譜峰進(jìn)行評價(jià)(見圖4),其保留時(shí)間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.03%～0.34%和2.57%～7.62%(n=3);在SAX分離體系中選取5個色譜峰進(jìn)行評價(jià)(見圖5a),其保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為0.24%～1.25%和1.26%～4.81%(n=5);在SCX分離體系中選取5個色譜峰進(jìn)行評價(jià)(見圖5b),其保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為0.03%～0.59%和1.27%～7.51%(n=5)。結(jié)果表明,第一維和第二維色譜分離均具有良好的重復(fù)性,為酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)提取液的二維分離分析奠定了良好基礎(chǔ)。

圖 4 采用GFC時(shí)酵母蛋白質(zhì)的色譜圖(n=3)Fig. 4 Chromatograms of the yeast protein by using GFC (n=3)Analytical conditions were the same as in Fig. 2.Peaks 1-4 represent four levels of the yeast protein from large to small according to the molecular weight.

圖 5 酵母蛋白質(zhì)采用(a)SAX和(b)SCX色譜柱時(shí)的色譜圖(n=5)Fig. 5 Chromatograms of the yeast protein by using (a) SAX and (b) SCX columns (n=5)Analytical conditions were the same as in Fig. 3.Peaks 1-5 represent five levels of the yeast protein from positive charge to negative charge and less to more (in Fig. 5a), or negative charge to positive charge and less to more (in Fig. 5b) according to the electric properties, respectively.

2.3 酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)的全二維分離

本文將GFC和IEC兩種分離模式結(jié)合,構(gòu)建的在線二維分離系統(tǒng)在第二維并聯(lián)兩根保留機(jī)理不同的離子交換柱實(shí)現(xiàn)了全二維分離,大大提高了峰容量和分離能力。此外,在線的分離模式[17]相比于離線分離模式[18],可減少樣品損失、節(jié)省分析時(shí)間并實(shí)現(xiàn)分離系統(tǒng)的自動化運(yùn)行。實(shí)驗(yàn)所用的酵母蛋白質(zhì)通過BCA(bicinchonininc acid)濃度測定法測得其濃度為13.5 mg/mL。實(shí)驗(yàn)所用酵母提取液中存在1 484種蛋白質(zhì)[19],其種類繁多,分子尺寸和等電點(diǎn)分布廣泛[20],適合用來評價(jià)二維分離系統(tǒng)的分離能力。

在二維分離過程中,樣品先通過進(jìn)樣閥進(jìn)入第一維GFC分析柱中,將蛋白質(zhì)按相對分子質(zhì)量大小進(jìn)行初篩,當(dāng)?shù)谝痪S分析的死時(shí)間結(jié)束時(shí),帶有不同帶電性質(zhì)的蛋白質(zhì)依次被SAX和SCX捕集柱捕集,進(jìn)而被兩個十通閥切換到第二維SAX和SCX分析柱中進(jìn)一步分離。本實(shí)驗(yàn)在第一維GFC分離體系中分別嘗試了12 min和6 min的捕集時(shí)間,第二維SAX和SCX分離體系的分析時(shí)間對其應(yīng)。當(dāng)?shù)谝痪SGFC分離體系的捕集時(shí)間為12 min時(shí),第一維餾分切割了8次,切割的餾分全部導(dǎo)入第二維SAX和SCX分離體系繼續(xù)分離,對應(yīng)的酵母蛋白質(zhì)的色譜圖見圖6;當(dāng)?shù)谝痪SGFC分離體系的捕集時(shí)間為6 min時(shí),第一維餾分切割了17次,對應(yīng)色譜圖見圖7?？梢钥闯?酵母蛋白質(zhì)經(jīng)過17次切割后,獲得了更多的色譜峰,體現(xiàn)出二維分離體系在分離復(fù)雜樣品時(shí)具有較強(qiáng)的分離能力。

圖 7 第一維餾分切割17次時(shí)酵母蛋白質(zhì)的色譜圖Fig. 7 Chromatograms of the yeast protein of the first dimensional fractions by cutting 17 timesFirst dimensional GFC separation (injection volume 100 μL) was cut for 17 times, and the other analytical conditions were the same as in Fig. 3.

峰容量可以更加直觀地體現(xiàn)二維系統(tǒng)的分離能力,同時(shí)也是描述二維系統(tǒng)分離能力的指標(biāo)[21,22]。一維峰容量的計(jì)算方法[2]為nc=L/(4σ),式中nc、L(min)及4σ(min)分別表示一維峰容量、有效洗脫時(shí)間及平均峰寬;二維系統(tǒng)總峰容量計(jì)算方法[2]為nc′=nc×ct,式中nc′及ct分別表示二維峰容量和一維切割次數(shù)。本實(shí)驗(yàn)考察了第一維分別進(jìn)行8次和17次切割時(shí),第二維IEC對應(yīng)的總峰容量(根據(jù)二維系統(tǒng)峰容量公式計(jì)算),結(jié)果見表2。可以看出,第一維經(jīng)過17次切割后,無論是一維峰容量還是二維系統(tǒng)的總峰容量均高于切割8次后的峰容量。在總分離時(shí)間148 min內(nèi),第一維GFC分離體系餾分經(jīng)過17次切割,二維系統(tǒng)獲得的峰容量總和達(dá)到了884,與參考文獻(xiàn)[2]中的峰容量890相差無幾,且單位時(shí)間內(nèi)同樣獲得了可觀的峰容量,體現(xiàn)出該系統(tǒng)在蛋白質(zhì)分離分析中具有一定的應(yīng)用前景。

表 2 第二維SAX和SCX分離的總峰容量及相關(guān)參數(shù)

3 結(jié)論

本文基于酵母蛋白質(zhì)的尺寸及帶電性質(zhì),構(gòu)建了GFC/2×IEC全二維液相色譜分離系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了全等電點(diǎn)范圍酵母蛋白質(zhì)的分離。同時(shí)考慮到蛋白質(zhì)在后續(xù)酶解、分離、質(zhì)譜鑒定等一系列實(shí)驗(yàn)中對樣品量的要求,在二維系統(tǒng)的構(gòu)建中選擇了常規(guī)尺寸的分析柱,保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的樣品量。因此構(gòu)建的全二維分離系統(tǒng)可用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺中蛋白質(zhì)的初分離。

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Construction and evaluation of gel filtration/ion exchange comprehensive two-dimensional liquid chromatography system

ZHANG Zheng1,2, TANG Tao2, YANG Sandong2, SUN Yuanshe2,LI Tong2, ZHANG Weibing1,3*

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,QiqiharUniversity,Qiqihar161006,China;2.DalianEliteAnalyticalInstrumentsCo.,Ltd.,Dalian116023,China; 3.ShanghaiKeyLaboratoryofFunctionalMaterialsChemistry,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China)

A two-dimensional liquid chromatography (2-D LC) system was developed with gel filtration chromatography (GFC) and ion exchange chromatography (IEC) based on the sizes and electric properties of proteins. A double-trap-column interface was used in the GFC/2×IEC 2-D LC system. To achieve the comprehensive 2-D separation, heart-cutting parallel columns were used in the second dimension considering the isoelectric point range of proteins. A general proteomic platform was established with protein separation, online digestion, peptide separation and mass identification. A TSK-GEL G3000SWXLcolumn (300 mm×7.8 mm, 5 μm), a Hypersil SAX column (100 mm×4.6 mm, 10 μm) and a Hypersil SCX column (100 mm×4.6 mm, 10 μm) were used to separate the yeast protein samples. The GFC/2×IEC 2-D LC system was evaluated with the yeast protein samples (100 μL) of concentration of 13.5 mg/mL. First dimensional GFC fractions were cut for 17 times within 148 min and transferred continuously to the second dimension to continue the separation. Under the optimized conditions, the total peak capacity of 2-D LC system reached 884. The results demonstrated that the 2-D LC system can be used for on-line protein separation. The protein separation module has a great prospect in the field of proteomic research.

comprehensive two-dimensional liquid chromatography (2-D LC); gel filtration chromatography (GFC); ion exchange chromatography (IEC); strong anion exchange (SAX); strong cation exchange (SCX); protein; yeast

10.3724/SP.J.1123.2016.12006

2016-12-04

國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)(2012YQ12004406).

Foundation item: National Major Instrument and Equipment Special Project (No. 2012YQ12004406).

O658

A

1000-8713(2017)05-0526-07

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(021)64252145,E-mail:weibingzhang@ecust.edu.cn.