磷酸肌酸鈉對阿霉素所致大鼠心肌損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

薛梅苓，杜小波

(1.兵器工業(yè)五二一醫(yī)院藥劑科，陜西西安710065；2.西安市華山中心醫(yī)院藥劑科，陜西西安710043)

磷酸肌酸鈉對阿霉素所致大鼠心肌損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

薛梅苓1，杜小波2

(1.兵器工業(yè)五二一醫(yī)院藥劑科，陜西西安710065；2.西安市華山中心醫(yī)院藥劑科，陜西西安710043)

目的觀察磷酸肌酸鈉(SP)對阿霉素(ADM)所致大鼠心肌損傷的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。方法應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將30只雄性SD大鼠分為空白對照組(n=10)、阿霉素組(ADR組，n=10)和磷酸肌酸鈉組(SP組，n=10)。對照組腹腔注射生理鹽水每日一次，ADR組隔日一次腹腔注射阿霉素建立阿霉素心肌損傷模型，SP組隔日一次腹腔注射磷酸肌酸鈉(200 mg/kg)，30 min后注射阿霉素。實驗結(jié)束后應(yīng)用羥胺法測定各組大鼠超氧化物歧化酶(SOD)，應(yīng)用硫代巴比妥法測定各組大鼠丙二醛(MDA)，應(yīng)用ELISA法測定各組心肌酶譜[乳酸脫氫酶(LDH)、心肌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同功酶(CK-MB)]水平。結(jié)果ADR組和SP組大鼠血清SOD水平分別為(47.11±9.64)μg/L、(80.9±17.98)μg/L，顯著低于空白對照組的(89.12±18.23)μg/L，而MDA水平分別為(7.12±1.46)μg/L、(2.3±0.47)μg/L，顯著高于空白對照組的(1.66±0.34)μg/L。SP組大鼠血清SOD水平高于ADR組，MDA水平低于ADR組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。ADR組和SP組大鼠血清心肌酶譜(LDH、AST、CK、CK-MB)水平分別為(1 307.79±267.50)U/L、(476.19±97.40)U/L、(961.29±196.63)U/L、(1 353.33±276.82)U/L和(713.79±146.02)U/L、(164.32±33.61)U/L、(387.09±79.18)U/L、(565.29±115.63)U/L，均明顯高于空白對照組的(691.02±141.35)U/L、(130.68±26.73)U/L、(327.69±67.03)U/L、(487.08±99.63)U/L，而SP組大鼠的上述血清心肌酶譜水平均高于ADR組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論磷酸肌酸鈉干預(yù)可以減輕大鼠阿霉素心肌損傷，其保護(hù)作用的實現(xiàn)，可能是由于清除了氧自由基，增強了SOD的活性，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并修復(fù)了心肌細(xì)胞損傷。

SD大鼠；磷酸肌酸鈉；阿霉素；心肌損傷；氧自由基

阿霉素(adriamycin，ADM)是一種高效、廣譜的抗腫瘤的蒽環(huán)類抗癌藥物之一，對多種實體腫瘤及血液系統(tǒng)惡性腫瘤均有良好的臨床效果，但是阿霉素具有明顯的劑量依賴性，對心臟易產(chǎn)生毒副作用，容易對心臟產(chǎn)生急性、慢性及遲發(fā)性毒性，從而限制了阿霉素的臨床使用[1]。常規(guī)藥物治療阿霉素心臟毒性效果不理想，預(yù)后很差。目前有關(guān)阿霉素心臟毒性的發(fā)生機(jī)制還不清楚，但有研究報道指出，阿霉素所致的心肌損傷與其半醌自由基介導(dǎo)的氧自由基損傷有一定關(guān)系[2]。磷酸肌酸鈉(sodium phosphocreatine，SP)是心肌的化學(xué)儲備能量，目前，在臨床上已作為一項重要的心肌保護(hù)措施廣泛得以應(yīng)用。本實驗通過建立大鼠ADM心肌病模型，并給予磷酸肌酸鈉干預(yù)治療，研究磷酸肌酸鈉對阿霉素心肌損傷的保護(hù)作用，并對其可能的保護(hù)機(jī)制進(jìn)行深入探討，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 動物選取與分組選取成年健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量240～280 g，SPF級(由陜西省動物實驗中心提供)，按清潔級大鼠的要求標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，每天保持12 h照明，自由進(jìn)食、飲水。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后稱重，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為空白對照組、阿霉素組(ADR組)和磷酸肌酸鈉組(SP組)，每組各10只。

1.2 大鼠ADM心肌病模型的建立空白對照組(對照組)：每3 d腹腔注射生理鹽水(NS)10 mL/kg，共10次；阿霉素組(ADR組)和磷酸肌酸鈉組(SP組)：ADR組每3 d腹腔注射同容量的ADR 2 mg/kg，共10次，累積劑量為20 mg/kg，SP組在第6次腹腔注射阿霉素時，同時開始注射磷酸肌酸鈉200 mg·kg-1·d-1，共12 d[3-4]。

1.3 血清指標(biāo)檢測實驗結(jié)束后，經(jīng)心臟抽血迅速處死動物，取3 mL血液標(biāo)本量注入離心管，靜置30 min后，經(jīng)低溫3 000 r/min離心15 min分取血清，并置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用羥胺法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，采用硫代巴比妥法測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。采用全自動生化分析儀測定心肌酶譜，包括心肌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、肌酸激酶同功酶(creatine kinase isozyme，CK-MB)、磷酸肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)，所有操作均參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠血清SOD、MDA水平比較ADR組和SP組大鼠血清SOD水平明顯低于空白對照組，而MDA水平明顯高于空白對照組，SP組大鼠血清SOD水平高于ADR組，MDA水平低于ADR組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 三組大鼠血清SOD及MDA水平比較()

表1 三組大鼠血清SOD及MDA水平比較()

空白對照組ADR組SP組F值P值10 10 10 89.12±18.23 47.11±9.64a80.9±17.98ab22.912 0.000 1.66±0.34 7.12±1.46a2.3±0.47ab108.29 0.000

2.2 三組大鼠血清心肌酶譜水平比較ADR組和SP組大鼠血清心肌酶譜水平均明顯高于空白對照組，而SP組大鼠血清心肌酶譜水平均高于ADR組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與ADR組比較，bP＜0.05。

3 討論

目前有關(guān)阿霉素引起心肌損傷的機(jī)制尚不清楚，有研究認(rèn)為，阿霉素引起心肌損害可能與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、鈣超載、膜分子的抑制、腎上腺功能異常、線粒體損傷、阿霉素繼發(fā)性代謝物等有關(guān)[5]。對阿霉素引起心肌損傷的機(jī)制目前較為公認(rèn)的是自由基學(xué)說。該學(xué)說指出，阿霉素與心肌組織的親和性明顯高于其他組織，容易進(jìn)入心肌細(xì)胞，并被還原為半醌，經(jīng)過氧化反應(yīng)后生成很多自由基，自由基對抗腫瘤作用并不明顯，但卻能夠攻擊心肌細(xì)胞線粒體，損害其形態(tài)結(jié)構(gòu)、損傷原發(fā)性細(xì)胞[6]。有研究表明，阿霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)容易產(chǎn)生大量的自由基和引起與細(xì)胞損傷有關(guān)的氧化反應(yīng)，從而推測可以導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)的各種改變，最終發(fā)生阿霉素心臟毒性[7]。因此，研究阿霉素心肌損傷的相關(guān)機(jī)制，尋求減輕阿霉素心臟毒性的藥物有著重要的現(xiàn)實意義。

磷酸肌酸是維持心臟細(xì)胞功能的重要能源物質(zhì)，在能量代謝過程中有著儲存和轉(zhuǎn)運ATP的雙重作用。磷酸肌酸鈉是一種為機(jī)體提供能量的供給劑，在心外手術(shù)心臟停搏液被廣泛應(yīng)用，能夠保護(hù)心肌缺血狀態(tài)下的心肌代謝異常等。其成分主要為磷酸肌酸二鈉鹽四水合物，再進(jìn)入機(jī)體后能夠迅速分解，為機(jī)體提供能量，可以快速補充阿霉素引起的心肌損傷組織能量合成急劇下降，對心肌毒性物質(zhì)的大量產(chǎn)生進(jìn)行有效的抑制，能夠防止細(xì)胞內(nèi)酶活性的改變，并維持跨膜離子梯度的能量平衡，同時其對保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和減輕細(xì)胞凋零具有重要意義[8-9]。

超氧化物歧化酶是生物機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，SOD活力的高低能夠間接反映動物機(jī)體清除自由基的能力；丙二醛作為細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物，MDA含量的多少能夠反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊損傷程度[10]。相關(guān)報道提示，大鼠阿霉素心肌病能夠使氧化應(yīng)激發(fā)生損傷，導(dǎo)致SOD活性降低及脂質(zhì)過氧化物MDA增高[6]。本文研究結(jié)果表明，ADR組大鼠血清SOD水平顯著低于空白對照組，MDA水平顯著高于空白對照組。這說明阿霉素能夠引起心肌組織SOD活性降低，并引起心肌細(xì)胞清除氧自由基的能力得以下降，最終導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物MDA增高，與該文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致。而經(jīng)SP干預(yù)后，SP組大鼠血清SOD水平顯著上升，MDA水平顯著降低。提示對阿霉素心肌損傷給予SP干預(yù)治療，SP通過一些酶系抑制脂質(zhì)過氧化作用的啟動和終止脂質(zhì)過氧化的發(fā)展，來減輕氧自由基對生物膜的氧化性損害，到達(dá)降低心肌組織脂質(zhì)過氧化水平的目的。

心肌酶譜LDH、AST、CK、CK-MB是反應(yīng)心肌細(xì)胞損傷較為敏感的指標(biāo)。LDH作為糖酵解過程中的一種重要酶，在組織細(xì)胞損傷時，其活力會增加，顧其活力的變化能夠反映心肌損傷的程度[11]。CTnⅠ是心肌收縮的調(diào)節(jié)蛋白，它僅存于心房肌和心室肌中，使cTnI成為心肌特異性抗原和心肌損傷的特異性標(biāo)志物[12]。在心肌細(xì)胞完整的情況下cTnI幾乎不能透過細(xì)胞膜進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)。當(dāng)心肌細(xì)胞因缺血或缺氧等因素發(fā)生變性、壞死時，cTnI會發(fā)生外漏，其可以通過受損的細(xì)胞膜彌散進(jìn)入細(xì)胞間質(zhì)，從而進(jìn)入血管導(dǎo)致血清cTnI的升高。CK-MB均是一種細(xì)胞內(nèi)酶，在心肌細(xì)胞內(nèi)含量高。當(dāng)機(jī)體處理正常狀態(tài)時，CK-MB大多存在細(xì)胞內(nèi)，而血中的含量較低。但當(dāng)心肌缺血或者再灌注損傷時，由于能量供給的障礙引起膜泵功能障礙，從而導(dǎo)致生物膜離子轉(zhuǎn)運障礙和膜通透性升高，此時大量的氧自由基產(chǎn)生，經(jīng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，加速了膜結(jié)構(gòu)破壞和通透性升高。細(xì)胞膜通透性升高能夠引起細(xì)胞內(nèi)的CK、CK-MB大量入血[13-14]。因此，CK和CK-MB能夠特異性地反映心肌細(xì)胞受損的程度，當(dāng)血清中CK與CK-MB升高時，說明心肌受損嚴(yán)重。本研究結(jié)果顯示，ADR組大鼠血清LDH、AST、CK、CK-MB水平顯著高于空白對照組，說明阿霉素可以引起心肌細(xì)胞受損；經(jīng)SP干預(yù)后，SP組大鼠血清心肌酶譜水平顯著降低，與ADR組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表明SP對阿霉素引起心肌細(xì)胞損傷有修復(fù)和保護(hù)作用。

綜上所述，磷酸肌酸鈉干預(yù)可以減輕大鼠阿霉素心肌損傷，其主要機(jī)制可能是由于清除了氧自由基，增強了SOD的活性，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對心肌細(xì)胞損傷進(jìn)行修復(fù)和保護(hù)，從而達(dá)到減輕大鼠阿霉素心肌損傷的目的。

[1]張偉,張加強,孟凡民.磷酸肌酸鈉對肺缺血再灌注致大鼠心肌損傷的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志,2016,36(6):670-672.

[2]Buck CL,Wallman KE,Dawson B,et al.Sodium phosphate as an ergogenic aid[J].Sports Med,2013,43(6):425-435.

[3]王霞.磷酸肌酸鈉治療新生兒窒息后心肌損害43例療效觀察[J].中國醫(yī)藥指南,2013,11(3):96-97.

[4]游森水,陳梅.磷酸肌酸鈉治療新生兒窒息后心肌損害療效觀察[J].中外醫(yī)療,2013,32(25):125-126.

[5]趙文英,陳冬云,邢文,等.磷酸肌酸鈉對小鼠阿霉素心肌損傷的保護(hù)機(jī)制初探[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2011,16(3):259-262．

[6]張雄飛,潘道波.鹽酸戊乙奎醚對大鼠雙下肢缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡的影響[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2011,8(18):38-40.

[7]Yun,Xu Linglei,Jiang Ying,et al.Solid-state characterization and transformation of various creatine phosphate sodium hydrates[J].J Pharm Sci,2014,103(11):3688-3695.

[8]張麗麗,李大偉.磷酸肌酸鈉對阿霉素所致大鼠心肌損傷的保護(hù)作用[J].中國醫(yī)藥指南,2015,13(30):36-37.

[9]桂靜,陳瑩,李永鳳,等.磷酸肌酸鈉對缺氧幼鼠腦組織中鈣調(diào)蛋白、一氧化氮水平的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2012,47(1): 63-66.

[10]Mishra OP,Ashraf QM,Delivoria-Papadopoulos M.Mechanism of increased tyrosine(Tyr(99))phosphorylation of calmodulin during hypoxia in the cerebral cortex of newborn piglets:the role of nNOS-derived nitric oxide[J].Neurochem Res,2010,35(1):67-75.

[11]楊琦,楊立瓊.環(huán)磷腺苷葡胺與磷酸肌酸鈉治療新生兒窒息后心肌損害的臨床觀察[J].中國醫(yī)藥指南,2013,11(23):19-20.

[12]趙強,周曉敏,辛晴,等.磷酸肌酸鈉對阿霉素所致心肌損傷大鼠急性期心肌組織連接蛋白43表達(dá)的影響[J].中國醫(yī)藥指南,2014,12 (10):59-60.

[13]張彤.磷酸肌酸鈉對新生兒心肌損傷的療效觀察[J].醫(yī)學(xué)綜述, 2012,18(22):3872-3874.

[14]張偉山,何忠承,邢祖民.骨科手術(shù)肢體缺血再灌注后肌鈣蛋白I的動態(tài)變化及臨床意義[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2012,31(14):82-83.

Experimental study of sodium phosphocreatine to protect against adriamycin-induced cardiotoxicity injury in rats and its mechanism.

XUE Mei-ling1,DU Xiao-bo2.1.Department of Pharmacy,the 521 Hospital of Weapon Industry,Xi'an 710065,Shaanxi,CHINA;2.Department of Pharmacy,Xi'an Huashan Central Hospital,Xi'an 710043,Shaanxi, CHINA

ObjectiveTo investigate the effect and possible mechanisms of sodium phosphocreatine(SP)to protect against adriamycin-induced cardiotoxicity injury in rats.MethodsThirty cases of male SD rats were randomly divided into blank control group(n=10,intraperitoneal injection of saline once a day),adriamycin group(n=10,intraperitoneal injection of doxorubicin every other day to establish adriamycin myocardial injury model)and SP group(n=10,intraperitoneal injection of SP every other day 200 mg/kg 30 min after the injection of doxorubicin).At the end of the experiment,the levels of superoxide dismutase(SOD)in each group were measured by hydroxylamine method.Malondialdehyde(MDA)was determined by thiobarbital method.The myocardial enzymes such as lactate dehydrogenase(LDH), asparate aminotransferase(AST),creatine kinase(CK),creatine kinase-MB isoenzyme(CK-MB)levels were measured. ResultsThe levels of serum SOD in ADR group and SP group were(47.11±9.64)μg/L,(80.9±17.98)μg/L,significantly lower than(89.12±18.23)μg/L in control group(P＜0.05).The levels of serum MDA in ADR group and SP group were (7.12±1.46)μg/L,(2.3±0.47)μg/L,significantly higher than(1.66±0.34)μg/L in control group(P＜0.05).The level of serum SOD in SP group was higher than that in ADR group,and the level of MDA in SP group was significantly lower than that in ADR group(P＜0.05).The levels of serum myocardial enzymes(LDH,AST,CK,CK-MB)were(1 307.79± 267.50),(476.19±97.40),(961.29±196.63)and(1 353.33±276.82)in ADR group and(713.79±146.02),(164.32±33.61), (387.09±79.18),(565.29±115.63)in SP group,which were significantly higher than(691.02±141.35),(130.68±26.73), (327.69±67.03),(487.08±99.63)in the control group(P＜0.05).The levels of serum myocardial enzymes(LDH,AST, CK,CK-MB)in SP group were significantly higher than those in ADR group(P＜0.05).ConclusionSP has protective effect on adriamycin-induced cardiotoxicity injury,maybe through scavenging oxygen free radicals,enhancing the SOD activity,reducing lipid peroxidation and repairing myocardial cell damage.

SD rats;Sodium phosphocreatine;Adriamycin;Myocardial injury;Oxygen free radicals

R-332

A

1003—6350（2017）07—1033—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.07.001

2016-10-26)

杜小波。E-mail：3128109520@qq.com