花藥培養(yǎng)在中美水稻雜交新品系選育中的應用

余波+李闖+曾生元++景德道+林添資+錢華飛++周義文++姚維成+孫立亭+杜燦燦++龔紅兵

摘要：以5份中國稻種質資源、2份美國稻種質資源為親本，靈活運用單交、回交、花藥培養(yǎng)等育種手段，實現(xiàn)中美水稻親本之間有利基因的互補、疊加、純合。通過對MS培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分及其濃度進行精量調整，促進愈傷組織的誘導、分化，提高成苗率，選育出具有高產、優(yōu)質、多抗、光溫鈍感廣適性水稻新品系24份，按其株葉形態(tài)分為2類，其中改良型中國水稻18份，改良型美國水稻6份。

關鍵詞：水稻；花藥培養(yǎng)；美國稻；育種

中圖分類號：S511.03文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2017）06-0065-03

水稻是我國最主要的糧食作物之一，我國有50%以上人口以稻米為主食，隨著農業(yè)生產的發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，稻谷在糧食中的比重將繼續(xù)增長。但是，在耕地資源有限的前提下，如何提高水稻單位面積的產量，對保障我國的糧食安全具有重要的意義。當前，水稻育種中產量長期停滯不前，品質和抗性也有待提高，其中一個重要的原因在于目前我國各地的主栽品種基因的遺傳基礎狹隘，育種工作者所選用的雜交親本遺傳差異小，很難使當前水稻的發(fā)展更上一個臺階。近年，有學者對中美兩國水稻的基因遺傳背景進行調查，發(fā)現(xiàn)其多態(tài)率（遺傳差異）高達93.65%[1]。因此，推動水稻育種的國際化，使用不同國家水稻資源尤其是中美水稻材料進行雜交[2]，擴大雜交親本之間的遺傳差異，充分提高水稻的雜種優(yōu)勢，對當前的水稻育種乃至世界糧食的安全都有巨大的推動作用。

中美水稻親緣關系較遠，雜交后代分離瘋狂且難于穩(wěn)定[3]，育種選擇難度大，如何提高中美水稻雜交的選育效果，加速后代穩(wěn)定是一個需要解決的問題?；ㄋ幣囵B(yǎng)是一種雙單倍體育種方法，具有提高選擇效率、縮短育種年限、純合目標性狀等眾多優(yōu)勢，通過花藥培養(yǎng)技術與常規(guī)育種技術相結合，可以快速穩(wěn)定中美水稻雜交后代。本研究以中美兩國水稻為親本，靈活運用單交、回交等育種手段，實現(xiàn)中美水稻親本之間有利性狀的互補、疊加；借助花藥培養(yǎng)技術快速穩(wěn)定目標性狀，實現(xiàn)中美水稻優(yōu)良基因的聚合。

1材料與方法

1.1材料

中國稻種質資源5份：鎮(zhèn)稻88、鎮(zhèn)稻16號、鎮(zhèn)稻18號、嘉禾218、H6/511；美國稻種質資源2份：DG9911772、P1002。

1.2方法

通過中國水稻與美國水稻單交、回交，取BC1F1、BC1F1′、F2稻穗進行花藥離體培養(yǎng)，一方面選育適宜在中國種植的具有優(yōu)質、高光效、光溫鈍感、綜合農藝性狀優(yōu)良的中國水稻品系，另一方面選育適宜在美國生長的結實率高、單產高的美國水稻品系。

2中美水稻選育流程

以下以鎮(zhèn)稻88與DG9911772雜交選育為例，結合圖1、表1說明中美2種類型水稻新品系的選育流程。

（1）中美水稻雜交配組：使用江蘇品種鎮(zhèn)稻88，美國水稻資源材料DG9911772進行雜交配組F1代。

（2） 將步驟（1）中得到的F1代分別與鎮(zhèn)稻88和美國稻資源材料DG9911772回交得到BC1F1、BC1F1′，再從BC1F1、BC1F1′中選單株分別進行花藥離體培養(yǎng)，選育具有優(yōu)質、高光效、光溫鈍感、綜合農藝性狀傾鎮(zhèn)稻88的改良型單株，選育具有結實率高、單產高的傾DG9911772的改良型單株。

（3） 從F2中選綜合農藝性狀傾鎮(zhèn)稻88、DG9911772單株分別進行花藥離體培養(yǎng)，根據需要選育具有優(yōu)質、高光效、光溫鈍感、綜合農藝性狀傾鎮(zhèn)稻88的改良型單株；選育結實率高、單產高的傾DG9911772改良型單株，具有優(yōu)勢性狀但還需要改良的中間材料分別與鎮(zhèn)稻88和美國水稻DG9911772雜交，再利用花藥培養(yǎng)加速穩(wěn)定，實現(xiàn)目標性狀的

改良。

（4）品系鑒定篩選：綜合考慮產量、品質、抗性、光溫反應等性狀，選出最優(yōu)品系進行優(yōu)勢鑒定。

3花藥培養(yǎng)流程

由于中美水稻基因遺傳背景的差異，花藥培養(yǎng)使用三步成苗法，對誘導、分化、生根3個不同發(fā)育階段的營養(yǎng)成分及濃度進行精量調整，促進愈傷組織的誘導、分化，提高成苗率。

3.1改良型MS培養(yǎng)基成分

3.1.1供試水稻材料花藥培養(yǎng)所用培養(yǎng)基母液按10倍濃度計算，母液A（大量元素）包括如下組分：KNO3 30 g/L、NH4NO3 16.5 g/L、KH2PO4 5 g/L、MgSO4·7H2O 3.7 g/L、CaCl2 4.4 g/L。按100倍濃度計算，母液B（微量元素）包括如下組分：ZnSO4·7H2O 500 mg/L、MnSO4·H2O 1 000 mg/L、H3BO3 500 mg/L、CuSO4·5H2O 2.5 mg/L、KI 83 mg/L、Na2MoO4·2H2O 25 mg/L、CoCl2·6H2O 2.5 mg/L。按100倍濃度計算，母液C（鐵鹽）包括如下組分：Na2-EDTA 5.6 g/L、Fe2（SO4）3·7H2O 4.3 g/L。按100倍濃度計算，母液D（有機元素）包括如下組分：肌醇10 g/L、煙酸0.05 g/L、鹽酸硫胺素0.05 g/L、鹽酸吡哆醇0.05 g/L、甘氨酸0.2 g/L。

3.1.2供試水稻材料愈傷組織誘導培養(yǎng)基利用上述培養(yǎng)基母液配成1 L誘導培養(yǎng)基，包括：母液A 100 mL、母液B 10 mL、母液C 10 mL、母液D 10 mL、濃度為 1 mg/mL 的2，4-D 5 mL、蔗糖40 g、瓊脂6 g、水解酪蛋白 1 g、山梨糖醇20 g、0.1 mg/mL的玉米素0.8 mL，pH值為58。

3.1.3供試水稻材料愈傷組織分化培養(yǎng)基利用上述培養(yǎng)基母液配成1 L分化培養(yǎng)基，包括：母液A 100 mL、母液B 10 mL、母液C 10 mL、母液D 10 mL、濃度為 2 mg/mL 的 6-BA 2 mL、濃度為0.5 mg/mL的NAA 0.5 mL、蔗糖30 g、瓊脂6 g、水解酪蛋白1 g、山梨糖醇10 g，pH值為5.8。

3.1.4供試水稻材料生根培養(yǎng)基利用上述培養(yǎng)基母液配成1 L的生根培養(yǎng)基，包括如下組分：母液A 100 mL、母液B 10 mL、母液C 10 mL、母液D 10 mL、蔗糖30 g、瓊脂6 g、水解酪蛋白1 g、山梨糖醇10 g、多效唑2 mg，pH值為5.8。

3.2花藥接種方法

3.2.1誘導培養(yǎng)取孕穗期劍葉葉枕距3～5 cm的幼穗，在8～12 ℃預處理8～10 d，消毒；取花粉處于單核時期的花藥接種在誘導培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)；接種結束后將誘導培養(yǎng)基移至智能光照培養(yǎng)箱，關閉培養(yǎng)箱中燈管，并用報紙或黑布遮蓋培養(yǎng)箱透光處，防止外界光線射入，設定箱內溫度為 24～27 ℃，進行為期22～35 d的暗處理，形成愈傷組織。

3.2.2分化培養(yǎng)將誘導培養(yǎng)基中得到的愈傷組織轉接到分化培養(yǎng)基上，將分化培養(yǎng)基移至智能光照培養(yǎng)箱，設定溫度為24～27 ℃，設定光照時間為14 h/d，暗處理時間10 h/d。

3.2.3生根培養(yǎng)愈傷組織在分化培養(yǎng)基上經過16 d左右分化形成根和芽，長出綠色小苗，將綠色小苗從分化培養(yǎng)基中轉接到生根培養(yǎng)基上；將生根培養(yǎng)基移至智能光照培養(yǎng)箱，設定溫度為27 ℃，設定光照時間為14 h/d，暗處理時間 10 h/d。

3.2.4煉苗移植綠色小苗轉入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，所有試管苗均開始發(fā)根，當試管苗綠苗長至6～8 cm，具有6～10條長0.5～1.0 cm的根時，從試管中取出綠苗，洗去根部培養(yǎng)基，清水培養(yǎng)；隔日移栽至花培苗圃中事先做好的秧田里，使用遮陽網遮蓋；1周后移種大田。

3.3花培苗選育

綜合考慮產量、品質、抗性、光溫反應性，選出最優(yōu)株系，次年進行鑒定篩選。通過2種美國水稻與5種中國水稻單交、回交、花藥培養(yǎng)，共篩選出改良型株系24份（表2），按其株葉形態(tài)分為2類，其中改良型中國水稻18份，改良型美國水稻6份。

4討論

4.1中美水稻雜交育種的優(yōu)點

（1）有利于拓寬雙親的遺傳距離，提高有利性狀的遺傳效應。借助單交、回交、聚合育種逐步實現(xiàn)中美優(yōu)良性狀（基因）的互補，無論是用我國的秈稻還是粳稻與美國水稻雜交，產量、品質、抗性等有利性狀都得到極大提高。

（2）雙親親和性好[4-5]，容易實現(xiàn)品種間雜交。由于仍然屬于亞種內雜交，中美水稻之間雜交表現(xiàn)出較好的親和性，如本研究中所用2個美國水稻（P1002、DG9911772）同5個中國水稻（鎮(zhèn)稻88、 鎮(zhèn)稻16號、鎮(zhèn)稻18號、嘉禾218、H6/511）雜交，F(xiàn)1結實率都在70%以上。

（3）有利于品質改良、選育穩(wěn)定的優(yōu)質品種[6]。美國水稻所攜帶的優(yōu)質基因不同于中國水稻品種，其優(yōu)質性狀受光

溫條件影響小，如P1002、DG9911772在江蘇種植和在海南種植其品質性狀（尤其是堊白）均表現(xiàn)同一水平的優(yōu)質，利用美國水稻這一特性，可使我國水稻的品質得以進一步改良，實現(xiàn)中美水稻優(yōu)中選優(yōu)。

（4）有利于培育光溫鈍感性品種，提高品種適應性。從表3可以看出，2個美國水稻材料分別在江蘇句容與海南陵水種植，播種到齊穗所用時間僅相差3～6 d，表現(xiàn)為光溫鈍感；而中國水稻對光溫條件表現(xiàn)為敏感，在江蘇句容與海南陵水種植，播種到齊穗所用時間相差14～26 d。利用美國水稻對光溫鈍感這一特性，可以培育我國的光溫鈍感性品種，提高我國水稻品種的適應性。

（5）有利于培育綜合性狀優(yōu)良的水稻新品系。美國水稻還具有抗倒伏性好[7-8]、葉片厚、對強光適應性強、光合效率高、成穗率高等優(yōu)點，是改良我國水稻品種的理想材料。

4.2MS培養(yǎng)基改良效果

（1）同MS培養(yǎng)基相比，在誘導培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基中添加了水解酪蛋白（CH）、山梨糖醇這2種成分。水解酪蛋白（CH）是多種氨基酸的混合物，對胚狀體、不定芽的分化有良好的促進作用，能提高誘導分化效率；山梨糖醇能夠改善愈傷組織的質量，使綠苗分化率顯著提高。

（2）同MS培養(yǎng)基相比，在誘導培養(yǎng)基中添加了玉米素。玉米素在與植物激素2.4-D混用的條件下，能快速促進愈傷組織的誘導。

（3）同MS培養(yǎng)基相比，在分化培養(yǎng)基中添加了NAA。NAA在與植物激素6-BA混用的條件下，可以快速促進愈傷組織的分化。

（4）同MS培養(yǎng)基相比，在生根培養(yǎng)基中添加了2 mg/L多效唑?？梢钥朔M織培養(yǎng)中試管苗長勢較弱，根系不發(fā)達的缺點，降低苗高，促進根系發(fā)育，健壯幼苗，提高移栽后成活率。

（5）使用三步成苗法，對誘導、分化、生根3個不同發(fā)育

階段的營養(yǎng)成分及其濃度進行精量調整，更加有利于愈傷組織的誘導、分化，花藥培養(yǎng)成苗、壯苗。

4.3花藥培養(yǎng)在中美水稻育種中的意義

（1）有利于育種材料純合，縮短育種年限。中美水稻之間遺傳差異巨大，后代分離瘋狂且難于穩(wěn)定，花藥培養(yǎng)是一種實現(xiàn)育種材料快速穩(wěn)定的技術，借助花藥培養(yǎng)的雙單倍體育種技術，可以快速穩(wěn)定育種材料。

（2） 有利于排除同一基因位點內的顯性效應對后代選育的干擾，提高選擇效率。由于花藥培養(yǎng)所得到的組培苗是通過單倍體加倍形成的，其后代全部是純合的基因型，排除了基因位點內的顯性效應對后代選育的干擾，使不同基因位點非等位基因之間的加性效應、上位性效應得以充分表達，提高了選擇效率。

（3）有利于打破優(yōu)良基因與不良基因之間的連鎖，實現(xiàn)中美水稻優(yōu)良基因的聚合。中美水稻具有很多優(yōu)良基因，但這些優(yōu)良基因往往與不良基因之間存在著連鎖關系，通過花藥培養(yǎng)可以打破優(yōu)良基因與不良基因之間的連鎖，實現(xiàn)中美水稻優(yōu)良基因的聚合。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.016