活血止痛膏有效成分經(jīng)皮滲透性研究

楊暢+杜守穎+白潔+李鵬躍+崔雅華+楊冰

[摘要] 建立透皮接收液中丹皮酚、丁香酚及胡椒堿的含量測(cè)定方法并對(duì)活血止痛橡膠膏劑經(jīng)皮滲透性進(jìn)行研究。利用HPLC測(cè)定透皮接收液中丹皮酚、丁香酚及胡椒堿的含量；以24 h累積透過(guò)量、經(jīng)皮滲透速率及皮膚刺激性為指標(biāo)，優(yōu)選透皮接收液；采用Franz擴(kuò)散池法考察活血止痛橡膠膏劑體外透皮特征及規(guī)律。結(jié)果表明，以聚乙二醇-乙醇-生理鹽水 3∶3∶4為透皮接收液，丹皮酚、丁香酚及胡椒堿的累積透過(guò)量和經(jīng)皮滲透速率均較丙二醇-乙醇-生理鹽水 3∶3∶4和乙醇-生理鹽水 3∶7作為接收液高，皮膚刺激性較丙二醇-乙醇-生理鹽水 3∶3∶4作為接收液??；活血止痛橡膠膏劑中丹皮酚、丁香酚及胡椒堿 24 h累積透過(guò)量分別為2.84，19.9，0.753 μg·cm-2，三者經(jīng)皮滲透速率分別為0.18，1.22，0.02 μg·cm-2·h-1。由此，活血止痛橡膠膏劑中丹皮酚、丁香酚及胡椒堿的透皮過(guò)程與其在膏中含量無(wú)關(guān)，且這一過(guò)程為擴(kuò)散過(guò)程。

[關(guān)鍵詞] 丹皮酚；丁香酚；胡椒堿；經(jīng)皮滲透性；活血止痛膏

Transdermal permeation of effective components in Huoxue Zhitong patch

YANG Chang， DU Shou-ying*， BAI Jie*， LI Peng-yue， CUI Ya-hua， YANG Bing

（Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] To establish a determination method for the contents of paeonol， eugenol and piperine in receptor liquid and to research the transdermal permeability of Huoxue Zhitong patch. The contents of paeonol， eugenol and piperine in receptor liquid were determined by high pressure liquid chromatography（HPLC）； and the receptor liquid was optimized by taking accumulative amount penetrated within 24 hours， percutaneous permeation rate and skin irritation as indexes. In vitro Franz diffusion experiment was applied to assess the percutaneous penetration characteristics and regularity of Huoxue Zhitong patch. The results showed that the accumulative penetration amount and penetration rate by using PEG 400-ethanol-normal saline 3∶3∶4 as receptor liquid were higher than those by using propylene glycol∶ethanol∶normal saline 3∶3∶4 and ethanol-normal saline 3∶7， the and skin irritation of PEG 400-ethanol-normal saline 3∶3∶4 was smaller than propylene glycol：ethanol： normal saline 3∶3∶4. Results of percutaneous permeability experiments displayed that the accumulative amount penetrated of paeonol， eugenol and piperine within 24 hours was 2.84， 19.9， and 0.753 μg·cm-2 respectively in Huoxue Zhitong patch and the penetration rate was 0.18， 1.22， and 0.02 μg·cm-2·h-1 respectively. Thus， the permeation of paeonol， eugenol and piperine through the skin was a diffusion process， which was irrelevant to their content in patch.

[Key words] paeonol； eugenol； piperine； transdermal permeation； Huoxue Zhitong patch

活血止痛膏是安徽安科余良卿藥業(yè)有限公司自主研發(fā)的一種橡膠膏劑，現(xiàn)收載于2015年版《中國(guó)藥典》一部[1]。其由牡丹皮、胡椒、丁香等20多味藥組成，能夠活血止痛、舒筋通絡(luò)，臨床上廣泛用于筋骨疼痛、肌肉麻等的治療。作為外用給藥劑型，有效成分穿過(guò)皮膚屏障（角質(zhì)層）到達(dá)靶部位是發(fā)揮治療作用的前提。通常認(rèn)為，橡膠膏劑載藥量小[2]，有效成分是否能到達(dá)皮下及皮下組織，將直接影響治療效果，因此有必要對(duì)活血止痛膏有效成分的經(jīng)皮滲透性進(jìn)行研究。

體外透皮實(shí)驗(yàn)法操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)條件易于控制，在經(jīng)皮給藥制劑經(jīng)皮滲透性研究中得到廣泛的應(yīng)用[4]。該方法通常采用人體皮膚、動(dòng)物皮膚或人工膜模擬在體皮膚環(huán)境，以生理鹽水作為接收液，用Franz擴(kuò)散池來(lái)評(píng)價(jià)藥物的釋放和皮膚滲透性[3]。但由于活血止痛膏中存在大量的脂溶性成分，在生理鹽水中的溶解度很小，難以滿足漏槽條件，因此本課題對(duì)透皮接受液進(jìn)行篩選，建立活血止痛膏透皮接受液中丹皮酚（paeonol，Pae）、丁香酚（eugenol，Eug）、胡椒堿（piperine，Pip）的HPLC，并對(duì)活血止痛膏的經(jīng)皮滲透性進(jìn)行研究，為其進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津，含1690型柱溫箱和SPD-20A型紫外檢測(cè)器）；BT125D型電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；TK-20B型透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；KQ5200DA 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA2245電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；RE-539C雷瓦電動(dòng)理發(fā)器（上海雷瓦電器有限公司）；Quanta 250掃描電子顯微鏡（美國(guó)FEI 公司）。

丹皮酚對(duì)照品（成都曼斯特生物科技有限公司中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，批號(hào)MUST-15020401）；丁香酚對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110725-201414）；胡椒堿對(duì)照品（成都曼斯特生物科技有限公司中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，批號(hào)MUST-15071310）；活血止痛膏（安科余良卿藥業(yè)有限公司）。甲醇（Fisher公司，色譜純）；純凈水（娃哈哈集團(tuán)有限公司）；乙酸（Fisher公司，色譜純）；無(wú)水乙醇（北京化工廠，分析純）；聚乙二醇-400（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；1，2-丙二醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；戊二醛溶液25%（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸異戊酯（北京化工廠，分析純），其他試劑均為分析純。

雄性KM小鼠，體重（20±1） g，由維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK（京）2012-0001。

2 方法

2.1 色譜條件

2.1.1 丁香酚和丹皮酚的色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇為流動(dòng)相A，以酸水（乙酸調(diào)節(jié)pH至2.8）為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～20 min，55%～40% B；20～25 min，40%～20% B；25～30 min，20% B；30～35 min，20%～55% B），流速1.0 mL·min-1；分別以274，280 nm 作為丹皮酚、丁香酚的檢測(cè)波長(zhǎng)；柱溫30 ℃。

2.1.2 胡椒堿的色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇-酸水（乙酸調(diào)節(jié)pH至2.8）（77∶23）為流動(dòng)相，流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)343 nm；柱溫30 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱定丹皮酚、胡椒堿及丁香酚適量，置于10 mL 量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度，分別制備成質(zhì)量濃度為 0.593，0.983，1.056 g·L-1的對(duì)照品母液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用無(wú)水乙醇將上述對(duì)照品母液制備成不同濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度C （mg·L-1）為橫坐標(biāo)，以待測(cè)成分峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到Pae，Eug，Pip的標(biāo)準(zhǔn)曲線。Pae在0.094 85～9.485 mg·L-1線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=48 607C-1 233.9，r=0.999 8；Eug在0.08 448～8.448 mg·L-1線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=10 177C-903.7，r=0.999 2；Pip在0.039 31～3.931 mg·L-1線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=75 507C-4 529.6，r=0.999 3。

2.4 離體皮膚的制備

取雄性KM小鼠，斷頸椎處死，除去腹部鼠毛，確保角質(zhì)層完好，分離腹部皮膚，用脫脂棉擦去脂肪組織和結(jié)締組織，生理鹽水沖洗干凈。用鋁箔包裹后-20 ℃冷凍保存，1周內(nèi)用完。

2.5 Franz 擴(kuò)散池法[5]

將2.4所制備的離體皮膚自然解凍，備用。將鼠皮固定在滲透擴(kuò)散裝置的供給室與接收室之間，角質(zhì)層朝向供給室（有效擴(kuò)散面積3.46 cm2），分別加入20 mL透皮接收液，池內(nèi)置磁力攪拌子，轉(zhuǎn)速350 r·min-1，溫度（32.5±0.2） ℃下平衡30 min，排盡皮膚下的空氣，濾紙吸干皮膚表面的液體。將剪好的活血止痛膏置于離體皮膚上方，使其與皮膚緊密接觸。分別于不同時(shí)間點(diǎn)取樣0.4 mL，同時(shí)補(bǔ)加等體積同溫度的新鮮接收液。所取接收液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，按上述色譜方法進(jìn)行HPLC測(cè)定，按下述公式計(jì)算相應(yīng)時(shí)間丹皮酚、丁香酚及胡椒堿的累計(jì)透過(guò)量（Qn）和透皮速率（Jss）。

Qn=（VCn+1.0×∑n-1i-1Ci）/S

公式中Qn為第n個(gè)時(shí)間點(diǎn)的單位面積累積透過(guò)量（μg），V為接收液的體積（20 mL），Cn為取樣點(diǎn)接收液的質(zhì)量濃度（mg·L-1），S為擴(kuò)散池的有效面積（3.46 cm2）。

以累計(jì)透過(guò)量Qn縱坐標(biāo)，t為橫坐標(biāo)，繪制累積透過(guò)量-時(shí)間曲線，其斜率為透皮速率Jss[6]。

2.6 皮膚標(biāo)本的制備[7]

按2.4所述方法制備離體皮膚，隨機(jī)分成4組，按2.5所述方法將其固定于滲透擴(kuò)散裝置的供給室與接收室之間，分別將30%聚乙二醇400-30%乙醇-40%生理鹽水（PEG-Et-NS）、30%丙二醇-30%乙醇-40%生理鹽水（PG-Et-NS）以及30%乙醇-生理鹽水（Et-NS）作為透皮接收液。12 h后用眼科剪迅速將不同組離體皮膚于相同部位剪下面積為0.5 cm×0.5 cm的小塊，迅速置于2.5%戊二醛溶液中固定。12 h 后用去離子水清洗3次，乙醇梯度脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，真空濺射儀噴金，掃描電子顯微鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 透皮接收液的篩選

3.1.1 不同接收液滲透量、滲透速率比較研究 分別以PEG-Et-NS，PG-Et-NS，Et-NS作為透皮接收液，活血止痛膏中丹皮酚、胡椒堿及丁香酚透皮吸收情況見(jiàn)圖1，2。

由圖可知，以PEG400-Et-NS 3∶3∶4為接收液，丹皮酚的Q24和Jss略大于以PG-Et-NS 3∶3∶4為接收液，明顯高于以Et-NS 3∶7為接收液；丁香酚的Q24和Jss明顯高于以PG-Et-NS 3∶3∶4，Et-NS 3∶7為接收液；胡椒堿的Q24略大于以Et-NS 3∶7為接收液，明顯高于以PG-Et-NS 3∶3∶4為接收液，但3種接收液條件下Jss無(wú)明顯差異。

3.1.2 不同接收液皮膚刺激性比較研究 取2.6項(xiàng)下皮膚樣本，于掃描電鏡下觀察不同接收液條件下，小鼠皮膚下表面微觀結(jié)構(gòu)變化情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。

NS組：皮膚下表面膠原纖維豐滿，呈緊密堆積排列；Et-NS組：皮膚下表面膠原纖維較豐滿，排列整齊；PG-Et-NS組：皮膚下表面膠原纖維稀疏，排列紊亂，纖維較細(xì)，能看到纖維下皮膚有明顯的褶皺；PEG400-Et-NS組：皮膚下表面膠原纖維較稀疏，排列紊亂，纖維較細(xì)。

綜上所述，以PEG400-Et-NS 3∶3∶4為活血止痛膏經(jīng)皮透過(guò)研究的透皮接收液。

3.2 活血止痛膏經(jīng)皮滲透性研究

以PEG400-Et-NS 3∶3∶4為透皮接受液，活血止痛膏24 h累計(jì)經(jīng)皮滲透量隨時(shí)間變化規(guī)律見(jiàn)圖4，表1。分別采用零級(jí)模型、一級(jí)模型、Higuchi 模型、Hixson-Crowell 模型對(duì)活血止痛膏經(jīng)皮滲透曲線進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

本課題組通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以生理鹽水作為活血止痛膏透皮接收液，所收集的樣品中Pae，Eug，Pip的濃度均不能達(dá)到HPLC的定量限。結(jié)合前期研究對(duì)微透析灌流液的篩選，以30%乙醇生理鹽水作為灌流液，微透析探針對(duì)Pae，Eug，Pip均無(wú)明顯吸附[8]，同時(shí)參考于娟等[9]活血止痛凝膠體外釋放和經(jīng)皮滲透性研究中的透皮接收液，選擇30%乙醇生理鹽水作為透皮接收液。又因?yàn)樵?個(gè)成分尤其是Pip 的脂溶性較強(qiáng)，為增加三者在透皮接收液中的溶解度，對(duì)透皮接收液進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。

本研究所制備的離體皮膚下緣處于真皮深層的網(wǎng)狀層，與透皮接收液接觸的下表面主要由各種纖維構(gòu)成，以膠原纖維為主。本研究主要以纖維的排列規(guī)則度、稀疏程度、粗細(xì)為指標(biāo)對(duì)透皮接收液的皮膚刺激性進(jìn)行評(píng)判。由結(jié)果可知，Et-NS組皮膚下表面纖維更飽滿，排列更規(guī)則，更接近生理鹽水組；PG-Et-NS組皮膚下表面纖維細(xì)，稀疏，排列紊亂，最偏離皮膚正常結(jié)構(gòu)。因此，透皮接收液皮膚刺激性由大到小為：PG-Et-NS 3∶3∶4>PEG-Et-NS 3∶3∶4> Et-NS 3∶7。結(jié)合累計(jì)透過(guò)量和透過(guò)速率兩指標(biāo)，最終選擇PEG-Et-NS 3∶3∶4為透皮接收液。

由透皮接收液的篩選結(jié)果可以看出，同比例的PEG400和丙二醇，PEG400對(duì)3種成分的溶解作用更強(qiáng)。經(jīng)分析，PEG400同丙二醇均可與生理鹽水、乙醇組成潛溶劑，從而增加脂溶性成分在透皮接收液中的溶解度。但PEG400作為一種非離子表面活性劑，除有潛溶作用外，還可以與脂溶性化合物形成膠束[10]，因此增溶作用更強(qiáng)。

由方程模型擬合結(jié)果可以看出，接收液中Pae，Eug，Pip的濃度變化規(guī)律均符合零級(jí)模型，說(shuō)明藥物的透皮過(guò)程與膏中藥物濃度無(wú)關(guān)；又因?yàn)槿逪iguchi模型的相關(guān)系數(shù)r均大于Hixson-Crowell模型，因此可以推測(cè)3種成分是從活血止痛膏中擴(kuò)散到達(dá)皮膚表面的。因活血止痛橡膠膏劑基質(zhì)主要是橡膠、松香等，要經(jīng)過(guò)混煉的步驟將基質(zhì)和中藥浸膏進(jìn)行均勻混合，隨后經(jīng)歷精煉、烘膠等步驟使藥物被嚴(yán)密的包裹在以橡膠為骨架的混合基質(zhì)中[11]。因?yàn)橄鹉z、松香等均不宜溶于水中，不會(huì)出現(xiàn)凝膠（膏）劑中藥物在擴(kuò)散和骨架溶蝕雙重作用[12]下釋放的現(xiàn)象。

由活血止痛膏橡膠膏劑經(jīng)皮滲透性研究結(jié)果可以看出，3種成分24 h累積透過(guò)量較低、滲透速度較慢，尤其是胡椒堿Q24為0.753 μg·cm-2，Jss為0.02 μg·cm-2·h-1。同時(shí)與于娟等[9]研究結(jié)果相比，丹皮酚的Jss約為凝膠膏劑中丹皮酚Jss的1/10，這與其他研究[13-14]所得橡膠膏劑透皮性能較差相一致。另外，橡膠膏劑還存在皮膚刺激性、皮膚殘留性等缺點(diǎn)，提示為提高活血止痛膏的生物利用度及藥效，可尋找新型、安全、高效的載藥體系。

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[責(zé)任編輯 曹陽(yáng)陽(yáng)]