氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)暫養(yǎng)水中丁香酚和異丁香酚

◎ 劉朋宇

（沈陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110022）

隨著人們對(duì)高品質(zhì)生活的追求，鮮活水產(chǎn)品成為購(gòu)買水產(chǎn)品的首選。在水產(chǎn)品的運(yùn)輸和批發(fā)過(guò)程中，使用麻醉劑可有效地抑制其過(guò)激反應(yīng)，從而降低物理傷害、減少微生物感染率和維持個(gè)體重量。常用的水產(chǎn)品麻醉劑有二氧化碳、間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）和丁香酚類化合物[1-2]，其中丁香酚和異丁香酚具有價(jià)格低廉、麻醉效果好和代謝時(shí)間短的特點(diǎn)，近年被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品的運(yùn)輸和暫養(yǎng)。各國(guó)對(duì)丁香酚和異丁香酚的監(jiān)管條例各不相同，其中澳大利亞、日本、智利等國(guó)將丁香酚類化合物列為合法的水產(chǎn)品麻醉劑，而出于其存在致癌風(fēng)險(xiǎn)，美國(guó)食品藥品管理局禁止在水產(chǎn)品中使用丁香酚類化合物作為麻醉劑[3]。我國(guó)目前對(duì)丁香酚類化合物在水產(chǎn)品的運(yùn)輸和暫養(yǎng)過(guò)程中的使用量和殘留量沒(méi)有相應(yīng)的規(guī)定。

丁香酚（Eugenol），化學(xué)式為C10H12O2，是無(wú)色或淡黃色液體，異丁香酚（Isoeugenol），分子式是C10H12O2，淡黃色微稠厚液體，為丁香酚的同分異構(gòu)體。目前，測(cè)定水產(chǎn)品和暫養(yǎng)水中丁香酚類化合物的方法主要有氣相色譜法[4]、液相色譜法[5-6]、氣質(zhì)聯(lián)用法[7-9]和液質(zhì)聯(lián)用法[10-12]，其中氣相色譜法和液相色譜法的前處理中存在操作復(fù)雜、耗費(fèi)試劑量大、干擾物難以去除和靈敏度低等缺點(diǎn)。由于丁香酚和異丁香酚為同分異構(gòu)體，增加了液相色譜質(zhì)譜法對(duì)其分離、確證和結(jié)果定量的難度[13]。本實(shí)驗(yàn)選用氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定丁香酚和異丁香酚，能夠有效縮短前處理時(shí)間、提高效率、減少溶劑使用及降低環(huán)境污染，適用于批量檢測(cè)暫養(yǎng)水中丁香酚和異丁香酚化合物。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

水產(chǎn)暫養(yǎng)水，來(lái)源于超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和飯店，裝于塑料密封瓶中，放于-18 ℃冰箱中保存，待用。

丁香酚、異丁香酚，純度均≥98%；正己烷、乙 腈，均為色譜純；氯化鈉，為分析純。

8890-7000D 氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司）、MV5 氮吹儀（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）、MS3 渦旋混合器（德國(guó)IKA 公司）及H1750 離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、Quintix224-1CN 電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和試劑的配制

丁香酚和異丁香酚標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取丁香酚和異丁香酚純品各100 mg 于兩個(gè)100 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度。分別移取上述溶液用乙腈按照使用需求配制成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 前處理方法

取暫養(yǎng)水樣品，常溫解凍，稱取10.0 g試樣于50 mL 塑料離心管中，加入10 mL 正己烷飽和的乙腈，5 g氯化鈉，2 000 r·min-1振蕩10 min，4 000 r·min-1離心 4 min，加入乙腈飽和的正己烷，手動(dòng)振搖1 min， 4 000 r·min-1離心4 min，棄去上層正己烷相，取5 mL乙腈于試管中，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL 乙腈，渦旋混合1 min。過(guò)0.45 μm 有機(jī)濾膜于1.5 mL 樣品瓶中，待測(cè)定。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：DB-1701（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）；升溫程序：100 ℃保持1 min，6 ℃·min-1升至200 ℃，25 ℃·min-1升至260 ℃，保持5 min；載氣：高純氦氣，流速1 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度：230 ℃，進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL[7]。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電子轟擊電離源（EI）；離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲10 min；碰撞氣：氮?dú)?.5 mL·min-1，淬滅氣：氦氣2.25 mL·min-1。采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，離子監(jiān)測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 丁香酚和異丁香酚MRM 采集條件表

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香酚和異丁香酚的質(zhì)譜分析

通過(guò)在暫養(yǎng)水中添加丁香酚和異丁香酚，樣品經(jīng)1.2.2 方法處理，采用選擇離子掃描（SIM）模式進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品中存在較多的干擾物，峰面積與待測(cè)組分部分重合，導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確定性和定量，加標(biāo)樣品SIM 色譜圖見(jiàn)圖1。

通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM 條件的建立和測(cè)定，可有效排除干擾物質(zhì)對(duì)異丁香酚的影響。通過(guò)產(chǎn)物離子掃描和更改碰撞電壓，確定兩者的MRM 采集條件，其中m/z=149 響應(yīng)值高于m/z=131，但由于m/z=149 存在干擾離子，故選擇m/z=131 為定量離子，與翟紋靜等人的研究結(jié)果一致[14]。加標(biāo)樣品的總離子流（TIC）圖和MRM 色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 添加50 μg·kg-1 丁香酚和異丁香酚樣品SIM 色譜圖

圖2 加標(biāo)樣品中丁香酚和異丁香酚的TIC 色譜圖和MRM 色譜圖

2.2 提取凈化

暫養(yǎng)水成分相對(duì)簡(jiǎn)單，根據(jù)丁香酚和異丁香酚的極性，將其提取至乙腈中，添加氯化鈉鹽析，使水中的丁香酚和異丁香酚更充分地轉(zhuǎn)移至乙腈相，乙腈用正己烷飽和，可有效的減少樣品中非極性成分的溶解，同時(shí)采用正己烷凈化，可將水相和乙腈相中的低極性成分分離，起到凈化的作用。

2.3 方法的檢測(cè)限和定量限

將丁香酚和異丁香酚配制成20 μg·L-1、40 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1和500 μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。在1.2.3 條件下測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)、定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，得丁香酚的線性方程為：y=52.665 763x-746.691 700，相關(guān)系數(shù)r=0.997 8：異丁香酚的線性方程為：y=33.295 797x-768.763 021，相關(guān)系數(shù)r=0.997 6，結(jié)果表明，在20 ～500 μg·L-1濃度范圍內(nèi)，兩個(gè)化合物的線性關(guān)系良好。通過(guò)在水樣中添加10 μg·kg-1丁香酚和異丁香酚，經(jīng)前處理和測(cè)定，MRM 色譜圖見(jiàn)圖3。按照3 倍信噪比為檢出限，10 倍信噪比為定量限，計(jì)算得丁香酚和異丁香酚的檢出限均為2 μg·kg-1，定量限均為5 μg·kg-1。

2.4 加標(biāo)回收率和精密度

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和可靠性，在空白水樣中添加3 個(gè)濃度水平的丁香酚和異丁香酚，每個(gè)水平添加6 個(gè)平行樣，經(jīng)過(guò)樣品前處理和測(cè)定，加標(biāo)回收率和精密度（RSD）結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本方法對(duì)20 份水產(chǎn)暫養(yǎng)水進(jìn)行處理和測(cè)定，其中3 份樣品檢出丁香酚，檢出范圍12 ～55 μg·kg-1，檢出最高值為鯉魚(yú)暫養(yǎng)用水，異丁香酚均未檢出。

圖3 樣品中添加10 μg·kg-1 的MRM 色譜圖

表2 丁香酚和異丁香酚回收率和精密度表

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)現(xiàn)有前處理和測(cè)定方法的優(yōu)化，本研究建立了測(cè)定水產(chǎn)暫養(yǎng)水中丁香酚和異丁香酚殘留量的氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法。相較單級(jí)質(zhì)譜方法，本方法可以有效的去除樣品中存在的干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，提高了檢測(cè)的靈敏度，通過(guò)測(cè)定暫養(yǎng)水中丁香酚和異丁香酚的殘留量，即可反應(yīng)其在水產(chǎn)品中的使用情況，可減少水產(chǎn)品的樣本數(shù)量、降低操作難度。該方法前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)，適用于快速批量測(cè)定暫養(yǎng)水及養(yǎng)殖用水中丁香酚和異丁香酚的殘留量。