蒲葵中化合物EHHM對肝癌HepG2細胞增殖作用的研究

程新生+邵明+王欣+繆丁丁+高金亭

[摘要] 目的 探討EHHM對肝癌HepG2細胞增殖能力的抑制作用。 方法 分別用濃度為0.1、1.0、5.0 μg/mL的EHHM培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG2細胞及正常肝細胞LO2，采用等體積超純水培養(yǎng)液培養(yǎng)為對照，采用MTT法、生長曲線法和平皿克隆實驗測定細胞的增殖能力。 結(jié)果 EHHM作用HepG2細胞24、48、72 h后，細胞生長被明顯抑制，與對照比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），并呈現(xiàn)了時間和濃度的依賴性，LO2細胞數(shù)或克隆數(shù)與對照相近（P > 0.05）。 結(jié)論 EHHM可抑制HepG2細胞增殖能力，對正常肝細胞LO2無明顯效果。

[關(guān)鍵詞] 蒲葵；HepG2；生長曲線法；抗癌作用

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）03（a）-0024-04

Study on role of Livistona Chinensis compound EHHM on hepatocellular carcinoma HepG2 cell proliferation

CHENG Xingsheng1 SHAO Ming2 WANG Xin3 MIAO Dingding1 GUO Jinting1

1.Department of Courage Pancreas Surgery， Shenzhen Nanshan Hospital of Guangdong Medical University， Guangdong Province， Shenzhen 518052， China； 2. Department of Anorectal Surgery， Shenzhen Nanshan Hospital of Guangdong Medical University， Guangdong Province， Shenzhen 518052， China； 3.Department of Hematology， Shenzhen Nanshan Hospital of Guangdong Medical University， Guangdong Province， Shenzhen 518052， China

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of EHHM on the proliferation of HepG2 cells. Methods HepG2 cells and normal liver cells LO2 were cultured in EHHM medium with a concentration of 0.1，1.0，5.0 μg/mL respectively， using equivalent voume ultrapure water nutrient solution was as control， the proliferation of cells was measured by MTT assay， growth curve and plate cloning. Results After 24， 48， 72 h of EHHM acts on HepG2 cells， cell growth was inhibited obviously， there was significant difference compared with the control group （P < 0.05）， and it showed a time and concentration dependent， the number of LO2 cells and the number of clones were similar to those of the control group （P > 0.05）. Conclusion EHHM can inhibit the proliferation of HepG2 cells and has no obvious effect on LO2.

[Key words] Livistona chinensis； HepG2； Growth curve； Antitumor effect

肝癌是一種發(fā)病機制復(fù)雜的惡性腫瘤，研究表明，肝癌在我國呈現(xiàn)多發(fā)態(tài)勢，一直嚴重影響著居民生命健康[1]。近年來，針對天然植物有效成分抗癌作用的研究逐漸成為新的熱點[2]。蒲葵（Livistona Chinensis R. Br.），屬于棕櫚科的常綠喬木，作為一種觀賞性植物，廣泛存在于自然環(huán)境[3]。在前期研究中，發(fā)現(xiàn)蒲葵尤其是蒲葵子具有消瘀止血、抗癌敗毒等功效[4]，民間亦常用其治療食管癌、鼻咽癌和白血病等惡疾，有顯著效果[5]。國外文獻針對蒲葵的報道也證實其對腫瘤血管和腫瘤細胞具有較強抑制效果[6]。近年，隨著化學(xué)提純技術(shù)的發(fā)展，對蒲葵有效成分的提取和分析成為可能。前期實驗中，研究者從蒲葵中分離提純出了多種天然單體化合物，通過體外腫瘤抑制實驗篩選到一個能高效特異抑制肝癌細胞系生長增殖的單體化合物，是一種新的天然化合物，命名為E-[6'-（5'-hydroxypenty1）trieosy1]-4-hydroxy-3methoxycinnamate，簡稱為EHHM。為了進一步驗證該化合物能否抑制肝癌細胞生長，本研究通過MTT法、生長曲線法和平皿克隆實驗等方法，對比分析了EHHM對肝癌細胞和正常肝細胞的生長抑制或者促進作用。為發(fā)現(xiàn)蒲葵提取物的有效成分及推動其在臨床上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及材料

人肝癌細胞株HepG2購自美國典型物保藏中心細胞庫，WTT試劑盒購自武漢博士德公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司。其他所涉及試劑均為進口分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)

使用含10%FBS的RPMl l640培養(yǎng)基，在37℃、10%（體積分數(shù)）CO2的溫箱中培養(yǎng)肝癌細胞株HepG2細胞。在相同條件下，使用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)正常肝細胞LO2。EHHM和超純水依據(jù)體積比分別制成培養(yǎng)HepG2和LO2培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

1.3 MTT法檢測EHHM對HepG2細胞生長能力的影響

先饑餓培養(yǎng)HepG2和LO2細胞24 h后，用含胰酶消化處理計數(shù)，然后在96孔培養(yǎng)板中每孔加入150 μL（含有3.5×103個/mL細胞）含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基的細胞懸液，分別加入最終濃度0.1、1.0、5.0 μg/mL的含EHHM的培養(yǎng)液，加入等體積超純水培養(yǎng)液為對照，放置于37℃、10%（體積分數(shù)）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后。棄上清液，每孔加入20 μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸除培養(yǎng)液，每孔再加入100 μL DMSO，震蕩均勻后，選擇490 nm波長，測定每個培養(yǎng)孔的光密度值（OD）。其抑制率或者增殖率的計算公式如下[7]：

腫瘤細胞生長抑制率% =（1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.4 生長曲線法

將HepG2和LO2細胞分別接種于培養(yǎng)基，配成10×103個/mL的細胞懸液，加到96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，在實現(xiàn)組中分別加入最終濃度0.1、1.0、5.0 μg/mL的EHHM培養(yǎng)液，加入等體積超純水培養(yǎng)液為對照，放置于37℃、10%（體積分數(shù)）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后按0、1、2、3、4、5、6、7 d分別取樣，然后使用0.4%臺盼藍液10 μL染色后，計數(shù)活細胞數(shù)，然后繪制細胞生長曲線[8]。

1.5 平皿克隆實驗

按照上述實驗方法，操作后，將HepG2和LO2細胞分別在6孔板中每孔平行加入100、500、1000個細胞，分別用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入等體積超純水培養(yǎng)基為對照，每隔1～2 d補充適量培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)至14周。當對照組的細胞克隆集落即將融合時，終止培養(yǎng)，在處理后，加適量結(jié)晶紫染色液染色10～30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。觀察細胞生長形成的克隆集落數(shù)。參考Li等[9]的方法，將≥50 μm或50個細胞的細胞團視為一個克隆。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EHHM對HepG2細胞生長的抑制作用

不同濃度的EHHM作用于肝癌細胞系HepG2細胞24、48、72 h后，測量得到的OD值見表1；EHHM濃度為0.1、1.0、5.0 μg/mL在培養(yǎng)24 h后，對HepG2細胞的抑制率分別是（2.200±0.008）%、（16.390±0.014）%和（27.800±0.036）%；48 h的抑制率分別是（22.491±0.021）%、（41.264±0.049）%、（68.959±0.063）%；72 h的抑制率分別是（4.470±0.011）%、（38.223±0.038）%和（64.011±0.088）%。在HepG2細胞組的各個時間段，實驗組OD值與對照比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），并呈現(xiàn)了時間和濃度的依賴性。

2.2 EHHM對LO2細胞生長的抑制作用

不同濃度的EHHM作用于正常肝臟LO2細胞24、48、72 h后，測量得到的OD值見表2。EHHM濃度為0.1、1.0、5.0 μg/mL在培養(yǎng)24 h后，對LO2細胞的抑制率分別是（4.052±0.012）%、（3.683±0.031）%和（9.392±0.028）%；48 h的抑制率分別是（20.578±0.058）%、（12.245±0.021）%和（12.010±0.012）%；72 h的抑制率分別是（3.324±0.007）%、（9.570±0.018）%和（6.705±0.012）%。含EHHM的培養(yǎng)基培養(yǎng)LO2細胞的各個時間段的OD值與對照比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），說明EHHM對LO2細胞增殖無影響。

2.3 不同濃度的EHHMr溶液對肝癌HepG2細胞生長過程的影響

根據(jù)不同濃度的EHHM分別作用于肝癌細胞系HepG2細胞和正常肝臟LO2細胞1、2、3、4、5、6、7 d后繪制的生長曲線圖（圖1～3），結(jié)果顯示：隨著EHHM 0.1 μg/mL培養(yǎng)基濃度的增大，肝癌細胞系HepG2細胞數(shù)相對數(shù)值呈增加趨勢，而正常肝臟LO2細胞的細胞數(shù)相對數(shù)值呈下降趨勢；EHHM對肝細胞癌細胞系HepG2生長過程有明顯的抑制作用，并且隨著濃度增加，其抑制作用更明顯，但是對LO2細胞的無明顯抑制作用。

2.4 HepG2細胞在不同濃度的EHHM溶液下克隆形成能力的比較

在同一孔中，不同EHHM濃度下的HepG2細胞的克隆形成率間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），且隨濃度增高，抑制能力越強；但在相同濃度下，不同細胞數(shù)的克隆形成率間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

3 討論

目前，惡性腫瘤已經(jīng)嚴重威脅到人類的身體健康，給人類帶來了巨大的經(jīng)濟負擔和精神壓力。腫瘤的防治也成為世界范圍內(nèi)廣泛重視的課題，世界各國每年投入了大量人力、物力進行研究。其中，原發(fā)性肝癌（PLC）更是一種較常見的惡性腫瘤[10]，有90%屬于肝細胞性肝癌（HCC），HCC在全球范圍內(nèi)均存在較高的發(fā)病率和病死率[11]。而在我國南方部分城市，HCC的發(fā)病率和病死率更是世界水平的3～4倍，嚴重影響我國人民健康水平[12]。肝癌的病因及確切分子機制尚不完全清楚，目前認為其發(fā)病是多因素、多步驟的復(fù)雜過程，受環(huán)境和因此雙重因素影響。而針對惡性腫瘤這類疾病尚缺乏理想安全的治療藥物[13]。近年，隨著科技的不斷發(fā)展，近年來，研究者已將目光轉(zhuǎn)向天然植物，希望從中尋找新的抗腫瘤藥物[14]，這已逐漸成為新藥研究的主要發(fā)展方向之一[15]。

傳統(tǒng)中醫(yī)認為，蒲葵可用于治療各種癌癥。國內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)蒲葵提取物在抑制肝細胞癌上有明顯療效[16-17]。國內(nèi)報道中發(fā)現(xiàn)，蒲葵的乙醇提取物，對宮頸癌細胞株Hela、人胃癌細胞株SGC7901和人肝癌細胞株Bel7402等三種癌細胞均有一定的抑制作用，具有一定的抗癌活性[18-19]。同時，國外也有報道[20]，蒲葵的水提取物對鼠成纖維瘤細胞、人乳腺和結(jié)腸癌細胞具有體外抑制作用，且抑制效果較為明顯。在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，其對小鼠模型的成纖維細胞瘤有較好的治愈效果，且未顯示毒性作用。

本研究采用三種不同的實驗方法，研究了EHHM在體外抗腫瘤的作用。其中MTT法對的結(jié)果表明，EHHM對肝癌細胞系HepG2細胞呈現(xiàn)抑制作用，在給藥24 h內(nèi)效果明顯，EHHM溶液濃度越高對HepG2細胞的抑制作用越大，其中在濃度為5.0 μg/mL時，時間為48 h時，抑制率最大，為48.959%；同時，EHHM對正常肝細胞LO2無明顯抑制作用，表明EHHM對正常肝細胞無毒副作用。生長曲線法可以清晰顯示EHHM對HepG2細胞的抑制隨著濃度和時間增加而增加，而對正常肝細胞LO2無明顯抑制作用。利用平皿克隆實驗發(fā)現(xiàn)，隨著EHHM溶液濃度的增加，對肝癌細胞系HepG2細胞的抑制能力越大。總之，MTT法、生長曲線法和平皿克隆實驗均提示EHHM對肝癌細胞癌細胞系HepG2的有明顯的抑制作用，且抑制效果隨著藥物濃度和時間效應(yīng)增加而相應(yīng)增高。三種實驗方法結(jié)果基本一致，驗證了EHHM的對HepG2細胞的生長抑制效果。

由于藥物對癌細胞的生長抑制作用是一個相對比較復(fù)雜的過程，有膜受體途徑、電機制等等。本研究僅僅對EHHM對肝癌細胞系HepG2細胞的抑制用進行了驗證，但是仍未揭示其內(nèi)在的作用機制。因此，對于后來的研究者，可以針對EHHM對HepG2細胞的生長抑制的機制做進一步的研究。

綜上所述，腫瘤可以通過過度生長，造成局部組織壓迫和侵襲破壞，對機體產(chǎn)生危害。而針對肝癌患者的治療，傳統(tǒng)上主要通過手術(shù)及化療治療，但效果一直不佳。本研究表明，EHHM對肝癌細胞的生長、增殖以及侵襲能力有明顯的抑制作用，對正常細胞不具有抑制作用，因此EHHM可能是潛在的一種無毒副作用的新型抗癌治療藥物，具有一定的藥用價值。不過，針對EHHM抗肝癌的臨床應(yīng)用仍需要進一步的基礎(chǔ)研究作為支撐。

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