黃芪提取物對(duì)老年癡呆大鼠NF-κB和IκB-a蛋白表達(dá)的影響

單鐵強(qiáng)，單鐵英，高立威，董 洋，鄭秀清，董 靜，鄭海萍，王雪丹，蘇安英

黃芪提取物對(duì)老年癡呆大鼠NF-κB和IκB-a蛋白表達(dá)的影響

單鐵強(qiáng)1，單鐵英2，高立威3，董 洋3，鄭秀清4，董 靜4，鄭海萍2，王雪丹2，蘇安英2

目的 研究黃芪提取物(EA)對(duì)老年性癡呆(AD)大鼠核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)和NF-κB抑制蛋白(IκB-a)蛋白的影響。方法 大鼠海馬內(nèi)注射Aβ25-35制備AD大鼠模型，實(shí)驗(yàn)分4組：對(duì)照組、模型組、黃芪組和西藥治療組。黃芪組和西藥治療組分別用黃芪提取物和腦復(fù)康灌胃，對(duì)照組和模型組用等量生理鹽水灌胃。用Morris水迷宮測(cè)定各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，Western blot測(cè)定各組大鼠海馬NF-κB、IκB-a和caspase-3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 模型組的逃避潛伏期延長(zhǎng)，單位時(shí)間內(nèi)跨越原平臺(tái)次數(shù)減少，NF-κB和caspase-3蛋白表達(dá)升高，而IκB-a蛋白表達(dá)降低，與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；黃芪組的逃避潛伏期縮短，單位時(shí)間內(nèi)跨越原平臺(tái)次數(shù)增多，NF-κB和caspase-3蛋白表達(dá)降低，而IκB-a蛋白表達(dá)升高，與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，其作用效果與西藥治療組相當(dāng)(P>0.05)。 結(jié)論 黃芪提取物通過提高AD大鼠海馬區(qū)IκB-a的含量，使游離NF-κB的含量減少，激活caspase-3受到抑制，從而抑制了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

阿爾茨海默病；黃芪提取物；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；NF-κB抑制蛋白；caspase-3

老年性癡呆又稱阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，是一種進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能退行性疾病，也是中老年人常見的一種疾病，病人常表現(xiàn)為認(rèn)知障礙、智力減退和人格改變，如果得不到有效治療，最終會(huì)引起多種并發(fā)癥導(dǎo)致死亡。目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，也無治療本病的特效藥。本研究采用大鼠雙側(cè)海馬注射β-淀粉樣蛋白25-35 (β-amyloid protein25-35，Aβ25-35)建立AD模型，主要探討黃芪提取物(extract of astragalus，EA) 對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶力的影響，檢測(cè)大鼠海馬區(qū)核轉(zhuǎn)錄因子-κB (nuekear factor kappa B，NF-κB)、NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB-a)和caspase-3蛋白的表達(dá)水平，分析EA對(duì)AD的學(xué)習(xí)記憶改善情況，為臨床上預(yù)防和治療AD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠購自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，雄性，月齡為11個(gè)月～13個(gè)月，體重為359.6 g±16.3 g，共30只。

1.2 儀器與試劑 腦立體定向儀：江灣Ⅰ型C，上海川沙花木農(nóng)機(jī)廠制造。EA購自合肥市恒星藥物研究所，先用少量<0.2%無水乙醇溶解，再加適量雙蒸水，高壓滅菌，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

Aβ25-35購自美國Sigma公司，加入適量無菌生理鹽水，配制其濃度為10 g/L，在37 ℃條件下孵育72 h，呈聚集狀態(tài)，4 ℃?zhèn)溆?。NF-κB、IκB-a和caspase-3抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與AD模型的建立 將大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、模型組、黃芪組和西藥治療組，每組10只。參照張佳等[1]的方法建立大鼠AD模型，模型組和黃芪組均于雙側(cè)海馬CA1區(qū)注射Aβ25-35各1 mL(10 mg)，正常對(duì)照組則注射等量的生理鹽水。首先，在AD模型建立后的第2天，各組大鼠分別用Morris水迷宮進(jìn)行測(cè)試，以確定AD模型的建立是否成功。然后，黃芪組用EA灌胃，劑量為80 mg/(kg·d)，西藥治療組用吡拉西坦(腦復(fù)康)灌胃，劑量為430 mg/(kg·d)，模型組和對(duì)照組給予等量生理鹽水。治療時(shí)間為18 d。在第19天時(shí)，再進(jìn)行一次時(shí)間為5 d的Morris水迷宮測(cè)試，次日殺死大鼠取出各組的海馬組織用于Western blot檢測(cè)。

1.4 Morris水迷宮檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力 水迷宮為黑色內(nèi)壁的圓形水池，直徑120 cm，高55 cm，水深42 cm，距池壁35 cm處放置一圓形站臺(tái)，直徑8 cm，高40 cm。實(shí)驗(yàn)共5 d，前1 d先進(jìn)行2 min的自由游泳以適應(yīng)環(huán)境，以后每天在上午和下午各訓(xùn)練一段，每段3次，連續(xù)訓(xùn)練4 d。訓(xùn)練時(shí)把大鼠面向池壁隨機(jī)放入一個(gè)入水點(diǎn)開始計(jì)時(shí)，在120 s內(nèi)找到站臺(tái)的時(shí)間作為潛伏期；若在120 s內(nèi)未找到站臺(tái)則將其引至站臺(tái)，潛伏期記為120 s。在第5天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，觀察并記錄其上站臺(tái)的潛伏期。

上述實(shí)驗(yàn)完成后，大鼠休息3 h，撤去站臺(tái)，把大鼠面向池壁在同一入水點(diǎn)放入水中，記錄其在120 s內(nèi)穿越站臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)。

1.5 Western blot檢測(cè)NF-κB、IκB-a和caspase-3蛋白的表達(dá)水平 用上樣緩沖液5×SDS與各組大鼠海馬組織總蛋白提取物50 μg均勻混合，100 ℃煮沸5 min，冰上冷卻，加入PAGE凝膠孔內(nèi)，進(jìn)行恒壓為120 V電泳。在77 V恒壓和185 mA的條件下分別用45 min將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用TTBS 20 mL和1 g奶粉封閉2 h。將膜分別浸入兔抗鼠多克隆抗體NF-κB(1∶250)、IκB-a(1∶300)和caspase-3(1∶250)溶液，4 ℃孵育過夜。TTBS溶液洗膜3次，每次10 min，將膜浸入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液(1∶10 000)，37 ℃孵育2 h，TTBS溶液洗膜3次，每次10 min，化學(xué)發(fā)光法顯色。

2 結(jié) 果

2.1 EA對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 大鼠模型建立后，在未進(jìn)行任何處理之前4組模型大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：模型組、黃芪組和西藥治療組的逃避潛伏期均明顯高于對(duì)照組，而穿臺(tái)次數(shù)均明顯低于對(duì)照組(見表1)，表明AD模型建立成功。定位航行實(shí)驗(yàn)：隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組尋找站臺(tái)的潛伏期越來越短，表明4組大鼠通過學(xué)習(xí)，均可對(duì)水下的站臺(tái)產(chǎn)生空間定位記憶。在訓(xùn)練第1天～第4天，模型組大鼠的平均潛伏期明顯大于對(duì)照組(P<0.05)；與模型組比較，黃芪組的潛伏期在訓(xùn)練第3天～第4天均顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，黃芪組與西藥治療組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

空間探索實(shí)驗(yàn)：與對(duì)照組相比，模型組大鼠穿越站臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，黃芪組大鼠穿越站臺(tái)次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，黃芪組與西藥治療組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶行為比較(±s)

表2 EA對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響(±s)

2.2 EA物對(duì)大鼠海馬NF-κB、IκB-a和caspase-3蛋白表達(dá)的影響 Western blot顯示：模型組NF-κB和caspase-3蛋白表達(dá)升高，而IκB-a蛋白表達(dá)降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黃芪組NF-κB和caspase-3蛋白表達(dá)降低，而IκB-a蛋白表達(dá)升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1、表3。

圖1 Western blot檢測(cè)海馬組織NF-κB、IκB-a 和caspase-3蛋白表達(dá)(n=10)

表3 大鼠海馬組織NF-κB、IκB-a和 caspase-3蛋白表達(dá)(±s)

3 討 論

AD的學(xué)習(xí)和記憶能力減退。Morris水迷宮能夠檢測(cè)腦的學(xué)習(xí)記憶功能，成為診斷和評(píng)價(jià)AD的重要手段。本研究的水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組的定位航行潛伏期顯著延長(zhǎng)，說明Aβ25-35具有神經(jīng)毒性，造成大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，經(jīng)過EA治療后，AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力得到了明顯提高。

AD中神經(jīng)細(xì)胞的死亡以凋亡為主。NF-κB是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[2-3]。研究表明在AD病人腦組織中退變的神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞以及早期老年斑周圍的神經(jīng)細(xì)胞中NF-κB被激活[4-5]，可以推測(cè)β-淀粉樣蛋白可能是NF-κB的強(qiáng)激化劑。IκB可以和NF-κB結(jié)合形成復(fù)合物，抑制NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，在細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，此復(fù)合體無活性，當(dāng)外界信號(hào)刺激細(xì)胞后，激活I(lǐng)κB激酶復(fù)合體(IκB kinase，IKK)，使IκB磷酸化，NF-κB成為游離狀態(tài)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合特異性基因序列并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄。caspase-3參與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過程，作為一種剪切酶，使DNA酶激活裂解DNA，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：模型組大鼠海馬組織IκB-a的表達(dá)顯著減少，caspase-3的表達(dá)明顯增加，提示在AD大鼠腦組織中，IκB激酶復(fù)合體激活從而使IκB磷酸化，IκB-a與NF-κB分離，磷酸化IκB被降解，造成IκB-a的含量減少；NF-κB成為游離狀態(tài)并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活了caspase-3的轉(zhuǎn)錄，使caspase-3表達(dá)水平明顯升高。經(jīng)EA治療后AD大鼠海馬區(qū)IκB-a的表達(dá)水平明顯升高，而caspase-3表達(dá)水平明顯降低，說明EA通過提高AD大鼠腦內(nèi)IκB-a的含量，使NF-κB與IκB-a結(jié)合，抑制NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，不能使caspase-3的轉(zhuǎn)錄激活，從而降低了caspase-3表達(dá)水平，抑制了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

綜合上述，EA可能使神經(jīng)細(xì)胞中IκB-a的蛋白表達(dá)水平升高，增加NF-κB與IκB-a的結(jié)合，使游離狀態(tài)的NF-κB減少，抑制其進(jìn)入細(xì)胞核激活caspase-3的轉(zhuǎn)錄，阻止了其下游caspase-8、caspase-9的活化，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。但是EA是如何提高神經(jīng)細(xì)胞中IκB-a的表達(dá)水平，其機(jī)制還不清楚，尚需進(jìn)一步的研究。

[1] 張佳，宋立剛，孔衛(wèi)娜，等.紅景天苷對(duì)Aβ1-40所致阿爾茨海默病模型大鼠認(rèn)知功能改善作用及機(jī)制探討[J].中國中藥雜志，2012，37(14)：2122-2126.

[2] 姜波.補(bǔ)陽還五湯膠囊對(duì)AD大鼠NF-κB信號(hào)調(diào)控及對(duì)覓形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[D].哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

[3] 姚麗芬.Aβ1-40誘導(dǎo)癡呆大鼠腦海馬及皮質(zhì)基因表達(dá)譜差異的實(shí)驗(yàn)研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2005.

[4] 孫建英，關(guān)新華，張秀清，等.兩種給藥途徑致癇大鼠海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷及caspase3的表達(dá)特征[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2007，23 (6)：565-570.

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(本文編輯郭懷印)

The Influence of Astragalus Extract on the Protein Expression of NF-κB and IκB-a in Rats with Alzheimer’s Disease

Shan Tieqiang，Shan Tieying，Gao Liwei，Dong Yang，Zheng Xiuqing，Dong Jing，Zheng Haiping，Wang Xuedan，Su Anying

Harbor Hospital of Qinhuangdao，Qinhuangdao 066000，Hebei，China

Objective To study the effects of astragalus extract(EA) on the protein expression of nuclear factor-κB (NF-κB) and IκB-a in rats with Alzheimer’s disease (AD).Methods The AD model rats were established by injecting Aβ25-35 into districts of hippocampuses.The rats were divided into 4 groups：control group，model group，EA group，piracetam group.The rats in EA group and piracetam group were treated with EA and piracetam lavage respectively，with isodose physiological saline lavage in control group and model group.The ability of learning and memory was detected by Morris water maze.The protein expression level of NF-κB，IκB-a and caspase-3 in the hippocampus was detected by western blot.Results Compared with control group，the incubation period of avoiding was lengthened，the frequency of passing through platform was decreased，the expression level of NF-κB and caspase-3 was increased，while the expression level of IκB-a was decreased in model group(P<0.05).Compared with the model group，the incubation period of avoiding was obviously shorten，the frequency of passing through platform was increase，the expression level of NF-κB and caspase-3 was decreased，while the expression level of IκB-a was increased in EA group (P<0.05 or P<0.01).Its effect was similar with western medicine treatment group (P>0.05).Conclusion EA can increase the content of IκB-a and decrease the content of free NF-κB in the hippocampus of AD rat，and restrained the activation of caspase-3，inhibit the apoptosis of nerve cells.

astragalus extract；Alzheimer’s disease；nuclear factor-kB；IκB-a；caspase-3

1.河北省秦皇島市海港醫(yī)院(河北秦皇島 066000)，E-mail：sty751218@163.com；2.河北工程大學(xué)；3.河北省邯鄲市中心醫(yī)院；4.河北省邯鄲市疾病預(yù)防控制中心

引用信息：?jiǎn)舞F強(qiáng)，單鐵英，高立威，等.黃芪提取物對(duì)老年癡呆大鼠NF-κB和IκB-a蛋白表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(7)：802-804.

R743 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.07.010

1672-1349(2017)07-0802-03

2016-11-11)