卡巴他賽脂質(zhì)體制備、質(zhì)量控制及穩(wěn)定性研究

張海軍，王英杰，劉留成

卡巴他賽脂質(zhì)體制備、質(zhì)量控制及穩(wěn)定性研究

張海軍，王英杰，劉留成

目的 通過不同方法制備卡巴他賽脂質(zhì)體，建立其質(zhì)量控制方法并考察其穩(wěn)定性。 方法 將氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、PEG2000-DSPE及卡巴他賽以質(zhì)量比為100∶5∶8，通過不同制備工藝制備脂質(zhì)體。采用低速離心法測定包封率，動態(tài)光散射法測定粒度分布，氣相色譜法測定有機(jī)溶劑殘留。 結(jié)果 脂質(zhì)體平均粒徑為(155±5)nm，多項分散系數(shù)(PdI)均小于0.20；脂質(zhì)體包封率均大于95.0%；所制得樣品于25 ℃±2 ℃條件下放置6個月，各項考察指標(biāo)均未發(fā)生明顯變化。結(jié)論 采用制備工藝3所制得的樣品具有較高的藥脂比，該制劑處方工藝可行，質(zhì)量可控，穩(wěn)定性良好；體外釋放曲線表明脂質(zhì)體有緩釋、靶向及長效作用。

卡巴他賽；脂質(zhì)體；制備；質(zhì)量控制；穩(wěn)定性

前列腺癌是男性常見惡性腫瘤，常發(fā)病于老年男性(美國NCI定義)，它在美國是除皮膚癌之外第二大常見男性癌癥。據(jù)疾病防控中心最新統(tǒng)計，2013年美國約有238 590例男性患前列腺癌，其中29 720例因此而死亡。卡巴他賽注射液經(jīng)美國FDA優(yōu)先審評后獲得批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性激素難治性前列腺的二線治療藥物，該藥物在二線治療中是首個也是唯一一個提供顯著生存獲益的治療藥物?？ò退愖⑸湟河糜谂c潑尼松聯(lián)合治療既往接受過含卡巴他賽方案治療的轉(zhuǎn)移性激素難治性前列腺癌病人[1-2]。

目前，卡巴他賽只有普通注射液上市，為了改善卡巴他賽的水溶性，在處方中加入吐溫-80，在臨床配伍中加入13%乙醇專用溶劑，在臨床使用過程中出現(xiàn)嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，如中性粒細(xì)胞減少、貧血、白細(xì)胞減少、腹瀉等[3-4]。因此該藥不能用于治療對卡巴他賽或吐溫-80有嚴(yán)重超敏史的病人，另外，大于65歲的人群用藥風(fēng)險會大于收益。為了避免組合溶劑和吐溫-80的使用，降低藥物的毒副作用，本研究把卡巴他賽包裹于磷脂雙分子層內(nèi)，將其制成脂質(zhì)體，所使用的輔料為人體細(xì)胞膜組成成分磷脂，大大降低了卡巴他賽普通注射液的毒副作用，提高病人的順應(yīng)性[5]。

1 材料與方法

1.1 儀器 島津高效液相色譜儀系統(tǒng)包括LC-20ATvp泵，SPD-20Avp紫外檢測器，LCsolution色譜工作站；EF-C3型高壓擠出儀(奧維斯汀公司)； S-3400NⅡ掃描電子顯微鏡(日本Hitachi)；CAD4/PC單晶X射線衍射儀(荷蘭Enraf Noius公司)；Nano-ZS型激光粒度測定儀(英國馬爾文公司)；PHS-3C型精密數(shù)顯pH計(上海精科)；303-1電熱培養(yǎng)箱(江蘇東臺儀器廠)。

1.2 試藥 注射用卡巴他賽脂質(zhì)體(規(guī)格：每瓶20 mg，批號：121101、121102、121103)由江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司提供，α-生育酚(批號：BY6JC，東京化成工業(yè)株式會社)，F(xiàn)A-PEG2000-DSPE(批號：100801，公司自制)、氫化磷脂酰膽堿(HSPC，批號：256277，德國Lipoid公司)，葡萄糖(批號：201210031，山東祥瑞藥業(yè)有限公司)，磷酸氫二鈉(批號：100901，湖南華納藥業(yè)有限公司)，磷酸二氫鈉(批號：100906，湖南華納藥業(yè)有限公司)，甲醇、乙醇(色譜級，美國天地試劑公司)；三氯甲烷(色譜級，美國ACROS公司)；注射用水(自制)。

1.3 方法

1.3.1 注射用卡巴他賽脂質(zhì)體的制備工藝1 精密稱取質(zhì)量比為100∶5∶8的HSPC、PEG2000-DSPE及卡巴他賽溶解于適量叔丁醇中，冷凍干燥24 h后，得脂質(zhì)混合物，用PBGS緩沖液充分水化脂質(zhì)混合物，高壓均質(zhì)(1 500bar)5次，過0.4 μm聚碳酸酯膜去除未包裹的游離卡巴他賽，55 ℃過0.1 μm聚碳酸酯膜2次整粒，將卡巴他賽脂質(zhì)體分裝于西林瓶中，冷凍干燥得注射用卡巴他賽脂質(zhì)體(批號：121101)。

洗脫液即PBGS緩沖液組成：精密稱取葡萄糖(Mw=180.16)486.1 g，加入已冷卻的注射用水7.2 L使溶解，并定容至9 L；取出上述葡萄糖溶液6 L，加入磷酸氫二鈉十二水合物(Mw=358.14)10.744 g，攪拌使溶解；剩余葡萄糖溶液3 L，加入磷酸二氫鈉二水合物(Mw=156.01)4.680 g，攪拌使溶解；兩相逐步混合，調(diào)節(jié)最終溶液的pH值為7.0，即得PBGS緩沖液。

1.3.2 注射用卡巴他賽脂質(zhì)體的制備工藝2 精密稱取質(zhì)量比為100∶5∶8的HSPC、PEG2000-DSPE及卡巴他賽溶解于適量乙醇-氯仿(體積比為1∶2)中，此為油相溶液。將適量PBGS緩沖液加溫至45 ℃，乳化劑攪拌(3500 r/min)，將油相溶液緩慢滴入其中，控制油水相比為2%(V/V)，繼續(xù)乳化15 min，該乳狀液繼續(xù)攪拌(500 r/min)12 h去除大部分有機(jī)溶劑，高壓均質(zhì)(1 500bar)5次，過0.4 μm聚碳酸酯膜去除未包裹的游離卡巴他賽，55 ℃過0.1 μm聚碳酸脂膜2次整粒，將卡巴他賽脂質(zhì)體分裝于西林瓶中，冷凍干燥得注射用卡巴他賽脂質(zhì)體(批號：121102)。

1.3.3 注射用卡巴他賽脂質(zhì)體的制備工藝3 精密稱取質(zhì)量比為100∶8的HSPC、卡巴他賽溶解于適量乙醇-氯仿(體積比為1∶2)中，此為油相溶液。將適量PBGS緩沖液加溫至45 ℃，乳化劑攪拌(3500 r/min)，將油相溶液緩慢滴入其中，控制油水相比為2%(V/V)，繼續(xù)乳化15min，該乳狀液繼續(xù)攪拌(500 r/min)12 h去除大部分有機(jī)溶劑，高壓均質(zhì)(1 000bar)5次，過0.4 μm聚碳酸酯膜去除未包裹的游離卡巴他賽，加入5份PEG2000-DSPE于此乳狀液中，60 ℃孵化(攪拌速度300 r/min)20 min，孵化好的藥業(yè)于55 ℃過0.1 μm聚碳酸酯膜2次整粒，將卡巴他賽脂質(zhì)體分裝于西林瓶中，冷凍干燥得注射用卡巴他賽脂質(zhì)體(批號：121103)。

2 結(jié) 果

2.1 分散時間 將上述各制備工藝所得的卡巴他賽脂質(zhì)體各1瓶，加純化水10 mL，輕輕振搖，在15 min內(nèi)完全分散均勻，無未分散的固體物。

2.2 粒度及粒度分布、Zeta電位的測定 將上述各制備工藝所得的卡巴他賽脂質(zhì)體各1瓶，加純化水10 mL使內(nèi)容物分散均勻，作為供試品溶液。取供試品溶液20 μL至潔凈的聚苯丙乙烯比色杯中，加純化水980 μL，輕搖混勻，排除氣泡，放入儀器檢測室內(nèi)，按照中國藥典2010年版二部附錄Ⅸ E中的有關(guān)規(guī)定，用動態(tài)光散射法，用Nano-ZS Malvern納米粒度儀測定樣品粒度和粒度分布。

卡巴他賽脂質(zhì)體粒徑測定結(jié)果顯示：制備工藝1未冷凍干燥前樣品[平均粒徑為133.5 nm，D(10)91.0 nm，D(50)143 nm，D(90)228 nm，PdI為0.109]；制備工藝1[平均粒徑為152.3 nm，D(10)92.9 nm，D(50)160 nm，D(90)280 nm，PdI為0.164]；制備工藝2[平均粒徑為158.9 nm，D(10)100 nm，D(50)170 nm，D(90)294 nm，PdI為0.175]；制備工藝3[平均粒徑為160.0 nm，D(10)102 nm，D(50)169 nm，D(90)287 nm，PdI為0.177]。詳見圖1～圖4。

圖1 卡巴他賽脂質(zhì)體粒度及粒度分布圖(未凍干)

圖2 卡巴他賽脂質(zhì)體粒度及粒度分布圖(制備工藝1)

圖3 卡巴他賽脂質(zhì)體粒度及粒度分布圖(制備工藝2)

圖4 卡巴他賽脂質(zhì)體粒度及粒度分布圖(制備工藝3)

精密移取980 μL供試品溶液至潔凈的聚苯丙乙烯U形管中，在加注樣品過程中避免有氣泡進(jìn)入U形管內(nèi)，放入儀器檢測室內(nèi)，按照中國藥典2010年版二部附錄Ⅸ E中的有關(guān)規(guī)定，用Nano-ZS Malvern納米粒度儀測定樣品Zeta電位。制備工藝1 Zeta電位為-8.47 mV；制備工藝2 Zeta電位為-9.13 mV；制備工藝3 Zeta電位為-5.42 mV。

2.3 殘留溶劑測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：100%聚二甲基硅氧烷為固定相的毛細(xì)管柱(60 m×0.32 mm，5 μm)；程序升溫：70 ℃保持10 min，以每分鐘20 ℃的速度升溫至200 ℃，保持15 min；以氮氣為載氣，流速1.7 mL/min；進(jìn)樣口溫度：150 ℃；檢測器(FID)溫度：250 ℃；采用頂空進(jìn)樣法，頂空瓶加熱溫度：85 ℃，傳輸管溫度：115 ℃，平衡時間20 min。制備6份對照品溶液，分別進(jìn)樣，無水乙醇和三氯甲烷峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。

2.3.2 測定法 取水1 995 mL，置2 000 mL量瓶中，加入無水乙醇(20 ℃，相對密度為0.789)1.26 mL與三氯甲烷(20 ℃，相對密度為1.484)40 μL，加水稀釋至刻度，磁力攪拌30 min，精密量取10 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置頂空進(jìn)樣瓶中，作為對照品溶液；另精密稱取本品0.25 g，置頂空進(jìn)樣瓶中，精密加入水5 mL，作為供試品溶液；分別取供試品溶液和對照品溶液，頂空進(jìn)樣1 min，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算，供試品中含無水乙醇不得過0.1%，含三氯甲烷不得過0.006%。制備工藝1未檢出乙醇及三氯甲烷殘留；制備工藝2：乙醇?xì)埩魹?.08%，三氯甲烷殘留為0.005%；制備工藝3：乙醇?xì)埩魹?.09%，三氯甲烷殘留為0.005%。均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2.4 包封率測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：用十八烷基鍵合硅膠為填充劑(Waters Symmetary C18 5 μm 250×4.6 mm)；流動相：乙腈-甲醇-水(47∶30∶23)；檢測波長230 nm；自動進(jìn)樣器溫度(5±3)℃，針頭洗液為流動相；進(jìn)樣體積20 μL；流速1.0 mL/min；卡巴他賽對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.0%。

2.4.2 包封率測定 對于卡巴他賽脂質(zhì)體包封率測定常用方法為葡聚糖凝膠法和低速離心法，經(jīng)過驗證后發(fā)現(xiàn)，上述兩者方法測定結(jié)果相似，但低速離心法操作簡單，鑒于此，選擇低速離心法進(jìn)行樣品包封率測定。取卡巴他賽脂質(zhì)體各1瓶，用10 mL純化水溶解，得供試品溶液，該溶液于錐形離心管中，3 500 r/min離心10 min，取上清液0.4 mL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇充分破乳，定容后用HPLC法進(jìn)行檢測，確定脂質(zhì)體中卡巴他賽含量(見圖5)。脂質(zhì)體溶液中卡巴他賽總量的測定：取卡巴他賽脂質(zhì)體溶液0.4 mL，置于10 mL量瓶中用甲醇破壞后定容，然后進(jìn)行HPLC檢測。

包封率采用下列計算公式進(jìn)行計算。根據(jù)本品含量及未包封的卡巴他賽濃度計算包封率(中國藥典2010年版二部附錄XIX E)，三種制備工藝所得樣品包封率均高于95.0%。計算公式為：

包封率 = (系統(tǒng)中包封與未包封的總藥量-液體介質(zhì)中未包封的藥量)/系統(tǒng)中包封與未包封的總藥量×100%

注：A為空白溶劑(甲醇)；B為對照品溶液；C為樣品溶液。

圖5 卡巴他賽脂質(zhì)體含量測定圖

2.5 穩(wěn)定性考察 取制備工藝3制備的卡巴他賽脂質(zhì)體在25 ℃±2 ℃條件下放置1個月、2個月、3個月、6個月，考察脂質(zhì)體粒度及粒度分布、含量、包封率的變化情況，結(jié)果顯示，6個月內(nèi)，脂質(zhì)體外觀性狀良好，上述各項考察指標(biāo)沒有明顯變化，各項檢測結(jié)果見表1。

表1 卡巴他賽脂質(zhì)體長期穩(wěn)定性考察實驗結(jié)果

3 討 論

3.1 制備工藝3所得卡巴他賽脂質(zhì)體藥脂比最高 制備工藝1藥脂比為0.05，制備工藝2藥脂比為0.07，制備工藝3藥脂比為0.08，原因是因為制備工藝3通過水包油技術(shù)充分讓卡巴他賽進(jìn)入磷脂雙分子層內(nèi)及磷脂雙分子層之間，通過攪拌過夜可以除去絕大部分脂質(zhì)體內(nèi)外的乙醇-氯仿溶劑，卡巴他賽在磷脂雙分子內(nèi)部以無定型(高度凝聚狀態(tài))存在，在貯藏過程中不易泄露，可以提高產(chǎn)品的放置穩(wěn)定性。本研究采用后

插入技術(shù)，通過孵化的方式接入PEG2000-DSPE，充分釋放了磷脂雙分子層之間的空間，讓其裝載更多的卡巴他賽于磷脂雙分子層內(nèi)。嘗試了在處方中加入膽固醇[6]，因為膽固醇能夠起到雙相調(diào)節(jié)磷脂雙分子的目的，當(dāng)加入10%(W/W)膽固醇時，卡巴他賽脂質(zhì)體的藥脂比明顯降低，可能是因為膽固醇占據(jù)了磷脂雙分子層的空間，從而競爭性地抑制了卡巴他賽進(jìn)入磷脂雙分子層內(nèi)。本研究也嘗試了在處方中直接加入PEG2000-DSPE，當(dāng)加入5%(W/W)PEG2000-DSPE時，卡巴他賽脂質(zhì)體的藥脂比明顯降低，可能是因為PEG2000-DSPE占據(jù)了磷脂雙分子層的空間，從而競爭性地抑制了卡巴他賽進(jìn)入磷脂雙分子層內(nèi)。

3.2 卡巴他賽脂質(zhì)體凍干粉水分的控制 卡巴他賽脂質(zhì)體制備成凍干制劑的目的是為了更好地保障制劑的穩(wěn)定性，研究者經(jīng)過大量的凍干曲線摸索，卡巴他賽脂質(zhì)體冷凍干燥步驟的凍干曲線為預(yù)凍溫度-40 ℃，預(yù)凍時間為3 h；-15 ℃保溫 5 h； 5 ℃保溫6 h；20 ℃保溫8 h；25 ℃保溫4 h。

凍干過程中最主要的關(guān)鍵質(zhì)量屬性是必須保證最終樣品的含水量。樣品中含有2%～5%水分，因為水分太低，會導(dǎo)致磷脂雙子層結(jié)構(gòu)的破壞，在復(fù)溶過程中樣品粒徑變大，游離藥物增加明顯，水分太高，樣品在貯藏過程中穩(wěn)定性差，樣品雜質(zhì)個數(shù)及雜質(zhì)量增加明顯，故為了保證產(chǎn)品的安全有效性，我們控制樣品中含有2%～5%水分。

3.3 通過X射線粉末衍射、掃描電鏡檢查進(jìn)一步確認(rèn)卡巴他賽完全包裹于磷脂雙分子層內(nèi) 對制備工藝3所得產(chǎn)品進(jìn)行X射線粉末衍射、掃描電鏡檢查，X射線粉末衍射的參數(shù)起始角3、終止角50、靶型：Cu、氣流管壓：40 kV40 mA、狹縫：2/4/0.5/0.2；掃描電鏡參數(shù)為20.0 kV 9.7 mm×1.00 k SE。從圖6～圖8中可以看出，三種制備工藝所得產(chǎn)品的XRD圖中都沒有明顯卡巴他賽的特征衍射峰，說明在脂質(zhì)體納米粒中，卡巴他賽均包裹于磷脂雙分子層之間或磷脂雙分子層內(nèi)部；從掃描電鏡圖可以看出，卡巴他賽均以非晶形的無定形薄片狀存在，而這一狀態(tài)有利于其在復(fù)溶過程中，由于其自身張力作用，自發(fā)形成納米脂質(zhì)微球，也更利于生物利用。3.4 脂質(zhì)體制劑具有緩釋、靶向、長循環(huán)效果的意義 卡巴他賽脂質(zhì)體與普通制劑、普通脂質(zhì)體相比，在體外呈現(xiàn)一定的緩釋作用，具有長循環(huán)功效。為臨床使用提供了可靠的質(zhì)量評定方法，對臨床降低卡巴他賽毒副作用，可以顯著提高治療指數(shù)，提高腫瘤病人的耐受性方面等方面均具有重要意義，是非常具有開發(fā)前景的藥物[8]。

圖6 卡巴他賽X射線粉末衍射圖[7]

圖7 卡巴他賽脂質(zhì)體X射線粉末衍射圖(制備工藝3)

圖8 卡巴他賽脂質(zhì)體掃描電鏡圖(制備工藝3)

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(本文編輯郭懷印)

江蘇省鹽城市第三人民醫(yī)院(江蘇鹽城224000)

戴月華，E-mail：tqpaeb5738784@126.com

R737.25

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.07.011

1672-1349(2017)07-0805-04

2016-10-23)

引用信息：張海軍，王英杰，劉留成，等.卡巴他賽脂質(zhì)體制備、質(zhì)量控制及穩(wěn)定性研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(7)：805-808.