銀杏內(nèi)酯B對(duì)阿爾茨海默病大鼠海馬c-fos、Caspase-3和Caspase-8的影響

郝 莉，徐玉英，田新紅，游言文，奚肇慶

銀杏內(nèi)酯B對(duì)阿爾茨海默病大鼠海馬c-fos、Caspase-3和Caspase-8的影響

郝 莉1，2，徐玉英2，田新紅2，游言文2，奚肇慶1

目的 探討銀杏內(nèi)酯B(GB)對(duì)阿爾茨海默病(AD)大鼠c-fos、Caspase-3和Caspase-8的影響。方法 將大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組和銀杏內(nèi)酯B組，采用 Morris水迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶，免疫組織化學(xué)分析海馬c-fos陽性神經(jīng)元光密度值，熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)海馬Caspase-3 和Caspase-8的mRNA和蛋白水平。結(jié)果 5 mg/kg的銀杏內(nèi)酯B可縮短AD大鼠逃避潛伏期，增加穿越平臺(tái)次數(shù)，提高海馬c-fos的表達(dá)，下調(diào)凋亡相關(guān)基因 Caspase-3和Caspase-8 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)論 銀杏內(nèi)酯B可改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，這種改善可能與上調(diào)AD大鼠海馬組織c-fos表達(dá)，下調(diào)Caspase-3和Caspase-8 mRNA和蛋白水平有關(guān)。

阿爾茨海默??；銀杏內(nèi)酯B；學(xué)習(xí)記憶；c-fos；Caspase-3；Caspase-8

學(xué)習(xí)記憶障礙是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的主要臨床表現(xiàn)，Aβ沉積形成老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元與突觸的丟失是AD的主要病理學(xué)改變。Aβ引起的神經(jīng)元與突觸丟失是AD學(xué)習(xí)記憶障礙的主要原因[1-2]。c-fos存在于海馬組織[3-5]，與認(rèn)知記憶和神經(jīng)元凋亡相關(guān)。凋亡是神經(jīng)元與突觸丟失的主要方式，Caspase-3、Caspase-8是凋亡關(guān)鍵因子。已有研究表明：中藥銀杏葉提取物可改善AD相關(guān)學(xué)習(xí)記憶力下降，而銀杏內(nèi)酯B是銀杏葉提取物的主要活性成分，具有保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)學(xué)習(xí)和改善記憶的作用[6]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)銀杏內(nèi)酯B(Ginkgolide B，GB)可改善AD相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶缺陷[7]，然而其具體作用機(jī)制尚未闡明。所以本研究建立AD大鼠模型并采用銀杏內(nèi)酯B治療，從行為學(xué)、組織學(xué)與分子生物學(xué)等方面探討銀杏內(nèi)酯B保護(hù)海馬神經(jīng)元、改善AD相關(guān)學(xué)習(xí)記憶力及c-fos、Caspase-3、Caspase-8的作用，為中藥單體防治AD提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑儀器 雄性清潔級(jí) Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重180 g～220 g，由河南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002]。銀杏內(nèi)酯B購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；Aβ1-42購自Sigma公司；鼠單克隆一抗c-fos購自Abcam公司；兔多克隆一抗Caspase-8購自Santa Cruz公司；兔多克隆一抗Caspase-3購自Cell Signaling公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋公司；萊卡顯微成像系統(tǒng)購自萊爾公司；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)購自天能公司；Morris水迷宮為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制。

1.2 方法

1.2.1 AD動(dòng)物模型建立 SD大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頭固定于腦立體定位儀上，參考大鼠腦立體定位圖譜：正中做一切口暴露出前囟，以前囟為原點(diǎn)，向后4 mm，旁開2.5 mm 左右各鉆一孔，硬腦膜下3 mm至兩側(cè)海馬。由微量注射器將2 μL(10 μg)Aβ1-42在10 min內(nèi)注射完畢，留針10 min，使得Aβ1-42充分浸潤(rùn)局部組織，術(shù)后均注射抗生素防止感染。假手術(shù)組大鼠注射等量的生理鹽水。

1.2.2 分組及治療 將SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常組、假手術(shù)組、AD模型組和銀杏內(nèi)酯B組，每組15只。造模3 d后，銀杏內(nèi)酯B組腹腔注射GB 5 mg/(kg·d)，正常組、假手術(shù)組和AD模型組給予等量的生理鹽水，均為15 d。

1.2.3 Morris水迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力 測(cè)試期間室內(nèi)保持安靜，水池內(nèi)注入清水并加入墨汁至水不透明，水面高出平臺(tái)2 cm。第1天進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，讓大鼠適應(yīng)環(huán)境，同時(shí)將其引導(dǎo)到平臺(tái)。其后4 d，每天將大鼠分別從兩個(gè)不同入水點(diǎn)面向池壁放入水中，記錄其找到平臺(tái)所需要的時(shí)間即逃避潛伏期。若大鼠入水后未能找到平臺(tái)，則將其置于平臺(tái)上停留10 s，引導(dǎo)其學(xué)習(xí)記憶。逃避潛伏期記錄為60 s。第6天撤除平臺(tái)，將大鼠面向池壁從任一入水點(diǎn)放入水池，測(cè)試60 s內(nèi)穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)。Morris 水迷宮檢測(cè)期間仍對(duì)大鼠進(jìn)行GB治療。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)c-fos表達(dá) 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后1 h，部分大鼠用10%水合氯醛麻醉，打開胸腔暴露心臟，剪開右心耳，灌注生理鹽水及預(yù)冷的4%多聚甲醛。快速斷頭取腦，放于4%多聚甲醛中固定24 h，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋切片。脫蠟、修復(fù)、PBS清洗；血清封閉，37 ℃孵育20 min；滴加一抗(鼠單抗c-fos，稀釋1∶200)，37 ℃孵育過夜；加HRP標(biāo)記二抗，孵育、DAB顯色；中性樹膠封片。選取海馬CA1區(qū)不重疊的5個(gè)高倍視野，計(jì)算其陽性積分光密度值，取均值統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)海馬組織Caspase-3和Caspase-8 mRNA表達(dá) 按照Trizol試劑盒說明書從冰凍海馬組織中快速提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。Caspase-3：上游引物為5′-CTGGACTGCGGTATTGAGAC-3′，下游引物為5′-CCGGGTGCGGTAGAGTAAGC-3′；Caspase-8：上游引物為5′-GTTCTCTCAGTTGCCTTTC-3′，下游引物為5′-AGCTGTAACCTGTCGCCGAGTCCC-3′；磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)：上游引物為5′-CTACCCACGGCAAGTTCAAT-3′，下游引物為5′-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3′，均由上海生工生物有限公司合成。按照試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)總體積為25 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。由系統(tǒng)軟件自動(dòng)生成Ct值，△Ct=CtCaspase-3/Caspase-8-CtGAPDH，△△Ct=(Ct Caspase-3/Caspase-8-CtGAPDH)試驗(yàn)組-(CtCaspase-3/Caspase-8-CtGAPDH)對(duì)照組。每個(gè)樣品均做3個(gè)平行孔，取平均值作為該樣品的Ct值。

1.2.6 Western-blot檢測(cè)海馬組織Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá) 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后1 h，部分大鼠冰上快速分離海馬放入離心管，加組織裂解液、勻漿。離心取上清用BCA法檢測(cè)樣品蛋白濃度，并計(jì)算所需蛋白量。配制聚丙烯酰胺凝膠，微量加樣器加樣電泳。300 mA恒流轉(zhuǎn)膜3 h，取出PVDF膜，封閉液室溫封閉1.5 h。用一抗Caspase-3和Caspase-8(1∶1 000)或小鼠抗GAPDH (1∶2 000)，孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶3 000)或山羊抗小鼠IgG(1∶3 000)，室溫孵育2 h。ECL反應(yīng)后用全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)成像檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠 Morris 水迷宮結(jié)果(見表1) 與正常組相比，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，去掉平臺(tái)后，模型組穿越原平臺(tái)的次數(shù)減少(P<0.05)；腹腔注射銀杏內(nèi)酯B 15 d后，逃避潛伏期時(shí)間縮短，穿越原平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P<0.05)，這提示銀杏內(nèi)酯B具有改善 AD 大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的能力。

表1 各組大鼠 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s)

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)c-fos表達(dá) 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：c-fos的陽性表達(dá)部位主要在細(xì)胞核，c-fos陽性細(xì)胞核呈現(xiàn)褐色(見圖1)。與正常組相比，模型組大鼠海馬CA1區(qū)c-fos蛋白表達(dá)呈弱陽性，有降低的趨勢(shì)(P>0.05)。腹腔注射銀杏內(nèi)酯B 15 d后，c-fos蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示銀杏內(nèi)酯B具有提高 AD 大鼠海馬CA1區(qū)c-fos表達(dá)的能力。詳見表2。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)和前額葉皮層c-fos蛋白表達(dá)(400×)

表2 各組海馬CA1區(qū)c-fos陽性區(qū)平均積分光密度值比較(±s)

2.3 各組大鼠海馬Caspase-3和Caspase-8 mRNA水平表達(dá)(見表3) Real time-PCR結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組海馬組織Caspase-3、Caspase-8 mRNA水平表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與模型組相比，銀杏內(nèi)酯B治療后Caspase-3、Caspase-8 mRNA表達(dá)下降(P<0.05)，說明銀杏內(nèi)酯B可降低AD大鼠海馬組織Caspase-3、Caspase-8 mRNA表達(dá)水平。

表3 各組大鼠海馬Caspase-3和Caspase-8 mRNA表達(dá)(±s)

2.4 各組大鼠海馬Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá) 與正常組相比，模型組海馬Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)增加(P<0.05或P<0.01)。腹腔注射銀杏內(nèi)酯B 15 d后，大鼠海馬Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)，提示銀杏內(nèi)酯B具有降低AD 大鼠海馬組織Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)的能力。詳見圖2、表4。

圖2 各組大鼠海馬Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠海馬Caspase-3和Caspase-8蛋白表達(dá)(±s)

3 討 論

Morris水迷宮主要用于研究和空間學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的中樞腦區(qū)功能評(píng)價(jià)。它通過讓受試動(dòng)物在水環(huán)境中尋找隱匿平臺(tái)并分析其找到平臺(tái)所需時(shí)間(逃避潛伏期)及動(dòng)物穿越隱匿平臺(tái)的次數(shù)來判斷空間學(xué)習(xí)記憶的能力。逃避潛伏期越短、穿越隱匿平臺(tái)的次數(shù)越多，表明受試動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力越好。本研究在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：AD 大鼠給予銀杏內(nèi)酯B治療后，逃避潛伏期時(shí)間明顯縮短，穿越隱匿平臺(tái)次數(shù)明顯增加，說明銀杏內(nèi)酯B可改善Aβ1-42誘導(dǎo)的AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

即刻早期基因c-fos及其蛋白產(chǎn)物既參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及信息傳遞，也與學(xué)習(xí)記憶過程相關(guān)[3]。c-fos參與神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及認(rèn)知，是保持空間記憶所必需的[4]。Kubik等[8]認(rèn)為c-fos蛋白是神經(jīng)元突觸可塑性的最常見標(biāo)志之一。除此以外，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)c-fos表達(dá)還參與誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[5]。神經(jīng)元凋亡是造成 AD 神經(jīng)元與突觸丟失的主要途徑，同時(shí)也是引起進(jìn)行性學(xué)習(xí)記憶能力減退的主要原因。海馬是參與學(xué)習(xí)記憶功能的重要結(jié)構(gòu)，也是AD病人腦中最易受累的區(qū)域之一。本研究在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測(cè)了各組大鼠海馬CA1區(qū)c-fos蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組AD大鼠海馬CA1區(qū)的c-fos蛋白水平有降低趨勢(shì)。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因是：AD大鼠機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及增殖能力減弱，海馬神經(jīng)元突觸的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)減少，長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)下降，所以AD大鼠記憶力下降的同時(shí)伴隨著c-fos蛋白水平的降低。而使用銀杏內(nèi)酯B治療后，AD大鼠海馬CA1區(qū)c-fos蛋白水平增加。這提示銀杏內(nèi)酯B改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶力可能與其能夠提高海馬CA1區(qū)c-fos蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

細(xì)胞凋亡受高度程序化調(diào)控，分為死亡受體途徑(外源性途徑)和線粒體途徑(內(nèi)源性途徑)，Caspase-8是兩個(gè)途徑的共同部分。外源性途徑中，酶原形式的Caspase-8活化后可通過激活Caspase-3或其他Caspase誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。內(nèi)源性途徑中，Caspase-8下游包含了bcl-2家族的調(diào)節(jié)分子，因此Caspase-8是凋亡途徑中的關(guān)鍵因子。無論哪種途徑，細(xì)胞凋亡最終都是通過凋亡執(zhí)行蛋白 Caspase-3實(shí)現(xiàn)的[9]。為了進(jìn)一步探討c-fos在銀杏內(nèi)酯B改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶力中的作用，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了大鼠海馬Caspase-3、Caspase-8 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示：模型組Caspase-3和Caspase-8 mRNA和蛋白表達(dá)水平高于正常組，提示AD海馬細(xì)胞凋亡基因被激活，AD可引起細(xì)胞凋亡，影響動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。銀杏內(nèi)酯B治療可下調(diào) Caspase-3 和Caspase-8的表達(dá)，從而抑制 Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡，這可能是銀杏內(nèi)酯B抗細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的環(huán)節(jié)之一。同時(shí)也說明c-fos蛋白水平增高可能與Caspase-3和Caspase-8相關(guān)。

綜上所述，銀杏內(nèi)酯B通過上調(diào)海馬c-fos，降低凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3和Caspase-8的表達(dá)等過程，對(duì)抗Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡，提高 AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。為中藥單體銀杏內(nèi)酯B治療 AD 以及闡明其中的作用機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Li W，Yu J，Liu Y，et al.Elevation of brain magnesium prevents synaptic loss and reverses cognitive deficits in Alzheimer’s disease mouse model[J].Molecular Brain，2014，7(19)：8423-8441.

[2] Pozueta J，Lefort R，Shelanski ML.Synaptic changes in Alzheimer’s disease and its models[J].Neuroscience，2013，251：51-65.

[3] Lüscher Dias T，F(xiàn)ernandes Golino H，Moura de Oliveira VE，et al.c-Fos expression predicts long-term social memory retrieval in mice[J].Behav Brain Res，2016，313：260-271.

[4] Tsai YW，Yang YR，Wang PS，et al．Intermittent hypoxia after transient focal ischemia induces hippocampal neurogenesis and c-Fos expression and reverses spatial memory deficits in rats[J].Plos One，2011，6(8)：e24001.

[5] Contestabile A，Ciani E，Sparapani M，et al.Activation of the ornithine decarboxylase-polyamine system and induction of c-fos and p53 expression in relation to excitotoxic neuronal apoptosis in normal and microencephalic rats[J].Exp Brain Res，1998，120(4)：519-526.

[6] Bate C，Tayebi M，Williams A.Ginkgolides protect against amyloid-β1-42-mediated synapse damage in vitro[J].Mol Neurodegeneration，2008，3(43)：1.

[7] Yang P，Cai X，Zhou K，et al.A novel oil-body nanoemulsion formulation of ginkgolide B： pharmacokinetics study and in vivo pharmacodynamics evaluations[J].J Pharm Sci，2014，103(4)：1075-1084.

[8] Kubik S，Miyashita T，Guzowski JF.Using immediate-early genes to map hippocampal subregional functions[J].Learn Mem，2007，14(11)：758-770.

[9] Kamada S，Kikkawa U，Tsujimoto Y，et al.Nuclear translocation of caspase-3 is dependent on its proteolytic activation and recognition of a substrate-like protein (s) [J].J Biol Chem，2005，280(2)：857-860.

(本文編輯郭懷印)

The Influence of Ginkgobalide B on the Expression of C-fos，Caspase-3 and Caspase-8 in the Hippocampus of Alzheimer’s Disease Rats

Hao Li，Xu Yuying，Tian Xinhong，You Yanwen，Xi Zhaoqing

The First Affiliated Hospital，Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210023，Jiangsu，China；Basic Medical College，Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，Henan，China

Xi Zhaoqing (The First Affiliated Hospital，Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210023，Jiangsu，China)

Objective To evaluate the efficiency of ginkgobalide B on the expression of c-fos，caspase-3 and caspase-8 in the hippocampus of Alzheimer’s disease rats.Methods Rats were randomly divided into four groups：normal group，sham group，model group and Ginkgobalide B group.The Morris water maze (MWM) test was used to assess behaviors of the rats，Imunohistochemical staining was used to test c-fos in the hippocampal CA1.Real-time PCR and western blot were used to examine caspase-3 and caspase-8 mRNA and protein levels.Results MWM test result showed that escape latency was significantly shower and the times of crossing the platform increased.Imunohistochemical staining showed that c-fos increased in the hippocampal CA1 after ginkgobalide B (5 mg/kg) treatment.Real-time PCR and western blot manifested that compared with the model group，caspase-3 and caspase-8 decreased in the hippocampus after ginkgobalide B (5 mg/kg) treatment.Conclusion Ginkgobalide B can improve learning and memory in Alzheimer disease’s rats，and its mechanism might be associated with neuronal apoptosis.

Alzheimer’s disease；ginkgobalide B；learning and memory；c-fos；caspase-3；caspase-8

河南中醫(yī)藥大學(xué)博士基金資助項(xiàng)目(No.BSJJ2015-04)

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(南京 210023)；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(鄭州 450008)

奚肇慶，E-mail：xzq49@163.com

R743 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.07.009

1672-1349(2017)07-0798-04

2016-09-21)

引用信息：郝莉，徐玉英，田新紅，等.銀杏內(nèi)酯B對(duì)阿爾茨海默病大鼠海馬c-fos、Caspase-3和Caspase-8的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(7)：798-801.