10種中藥提取物抗念珠菌體外藥敏實(shí)驗(yàn)

盧祥婷 黃欣

(上海市同濟(jì)醫(yī)院，同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院皮膚科，上海 200065)

·論著·

10種中藥提取物抗念珠菌體外藥敏實(shí)驗(yàn)

盧祥婷 黃欣

(上海市同濟(jì)醫(yī)院，同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院皮膚科，上海 200065)

目的 觀察10種中藥提取物對(duì)念珠菌體外抗菌效果。方法 參照CLSI的M27-A3方案，采用微量液基稀釋法，檢測(cè)10種中藥提取物抗念珠菌的作用。結(jié)果 10種中藥提取物中白念珠菌對(duì)三七總皂甙、人參莖葉總皂甙較敏感，24 h MIC均為62.5 μg/mL，48 h MIC均為125 μg/mL；24 h時(shí)克柔念珠菌對(duì)三七總皂甙和檸檬酸較敏感，MIC均為1.96 μg/mL，48 h時(shí)克柔念珠菌對(duì)三七總皂甙較敏感，MIC為31.25 μg/mL；近平滑念珠菌對(duì)人參莖葉皂苷和麝香草酚較敏感，24 h MIC均為3.91 μg/mL，近平滑念珠菌在48 h對(duì)人參莖葉皂甙較敏感,MIC為15.63 μg/mL。結(jié)論 三七總皂甙、人參莖葉皂甙、檸檬酸和麝香草酚對(duì)念珠菌具有一定的抗菌活性，不同中藥提取物針對(duì)念珠菌不同菌種的抗菌作用存在一定差異。

中藥提取物；念珠菌；藥敏試驗(yàn)

念珠菌是一種臨床上常見的致病真菌，可引起皮膚、黏膜及內(nèi)臟系統(tǒng)的感染，其中侵襲性念珠菌病的死亡率高達(dá)47%[1]，臨床上白念珠菌的感染約占80%以上[2]?？拐婢幬锓N類較為局限，臨床治愈率較低，容易出現(xiàn)耐藥，部分藥物不良反應(yīng)明顯，因此開發(fā)高效、低毒的抗真菌藥物顯得尤為重要和迫切。本研究參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所 (Clinical And Laboratory Standards Institute，CLSI)制訂的M27-A3方案中酵母菌微量液基稀釋法檢測(cè)了10種中藥提取物對(duì)念珠菌的體外藥敏試驗(yàn)，旨在初步篩選出對(duì)念珠菌有抗菌作用的中藥提取物。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株來源 白念珠菌 (ATCC10231)，中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心惠贈(zèng)?？巳崮钪榫?(ATCC6258)與近平滑念珠菌 (ATCC22019)均由上海第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院衛(wèi)生部真菌保藏中心惠贈(zèng)。

抗真菌藥物 氟康唑粉 (含量99.9%)、伊曲康唑粉 (含量99.9%)均由西安楊森制藥有限公司提供；魚腥草素鈉、麝香草酚、丹皮酚、肉桂酸、銀杏葉對(duì)照提取物、檸檬酸、青篙琥酯、人參莖葉皂甙、三七總皂甙、苦參堿均購自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

主要試劑和儀器 二甲基亞砜 (Merck公司)，RPMI 1640粉末 (美國(guó)Gibco公司)，沙氏培養(yǎng)基原料 (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司上海分公司)，電子分析天平 (瑞士MettlerT01edo公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱 (上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，生物安全柜 (力康生物科技有限公司)，光學(xué)顯微鏡 (Olympus日本)，麥?zhǔn)媳葷峁?(法國(guó)Biomerieux公司)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 (上海求精生化試劑儀器有限公司)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (浙江黃巖塑料制品廠)。

1.2 方法

按照CLSI推薦的微量液基稀釋法 (M27-A3)[3]實(shí)施。

藥物儲(chǔ)存液的制備 水溶性的氟康唑溶于滅菌雙蒸水，脂溶性的伊曲康唑和10種中藥提取物分別溶于二甲基亞砜，制備成藥物儲(chǔ)存液。氟康唑?yàn)?56 μg/mL，伊曲康唑?yàn)?4 μg/mL，10種中藥提取物均為1 000 μg/mL。

藥物敏感測(cè)試板的制備 用RPMI 1640液體培養(yǎng)基將配制好的藥物儲(chǔ)存液按所需測(cè)試濃度的2倍稀釋后，加入一次性使用的無菌96孔板第1～10孔，每孔100 μL。第11、12孔分別加入不含藥物的RPMI 1640液體培養(yǎng)基100 μL、200 μL，其中第11孔為陽性生長(zhǎng)對(duì)照，第12 孔為陰性空白對(duì)照。

菌懸液的制備和接種 為保證受試菌株的純度和活力，將其連續(xù)轉(zhuǎn)種至沙堡弱斜面培養(yǎng)基2次，35℃培養(yǎng)48 h，用3 mL無菌生理鹽水制成菌懸液，于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上調(diào)整其濃度至 (1～5)×106CFU/mL。用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?。用RPMI 1640液體培養(yǎng)基將菌懸液稀釋1 000倍。取100 μL接種于藥物敏感測(cè)試板第1～11孔中。

孵育和終點(diǎn)判定 接種后的藥物敏感測(cè)試板置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h和48 h，采用視覺法判定終點(diǎn)。藥物敏感終點(diǎn)判讀參照M27-A3中對(duì)微量液體培養(yǎng)基稀釋法的標(biāo)準(zhǔn)，唑類藥物以50%抑制作為觀察終點(diǎn)，判斷最低抑菌濃度 (minimuminhibitory concentration，MIC)。中藥提取物的結(jié)果判斷參照唑類藥物進(jìn)行。每種藥同時(shí)做3排，結(jié)果取3個(gè)數(shù)的平均值。

2 結(jié) 果

體外藥敏結(jié)果 (見表1)顯示：10種中藥提取物中，白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株 (ATCC10231)24 h時(shí)對(duì)三七總皂甙和人參莖葉總皂甙較敏感，MIC值均為62.5 μg/mL；48 h時(shí)對(duì)三七總皂甙、人參莖葉總皂甙的MIC值均為125 μg/mL。10種中藥提取物中，克柔念珠菌 (ATCC6258)24 h時(shí)對(duì)三七總皂甙和檸檬酸的作用較敏感，MIC值均為1.96 μg/mL；48 h結(jié)果顯示三七總皂甙MIC值為31.25 μg/mL，檸檬酸出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，MIC值為125 μg/mL。10種中藥提取物中，近平滑念珠菌 (ATCC22019)24 h時(shí)對(duì)人參莖葉皂苷和麝香草酚均較敏感，MIC均為3.91 μg/mL,48 h時(shí)對(duì)人參莖葉皂甙較敏感,MIC值為15.63 μg/mL,在48 h觀察到麝香草酚出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。

表1 10種中藥提取物對(duì)白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株 (ATCC10231)、克柔念珠菌 (ATCC6258)標(biāo)準(zhǔn)株和近平滑念珠菌 (ATCC22019)標(biāo)準(zhǔn)株的24 h和48 h MIC值 (μg/mL)

Tab.1 The 24 h and 48 h MICs (μg/mL) of 10 kinds of Chinese herb extracts againstC.albicansstandard strain (ATCC10231)，C.kruseistandard strain (ATCC6258) andC.parapsilosisstandard strain (ATCC22019)invitro

藥物C.albicansC.kruseiC.parapsilosis24h48h24h48h24h48h魚腥草素鈉>500>5001255007.81>500苦參堿500500500>500>500>500丹皮酚>50050062.5500500>500三七總皂甙62.51251.9631.25125125青篙琥酯50050031.25>50062.562.5肉桂酸250>50031.25250500500檸檬酸2505001.96125125>500人參莖葉皂甙62.512562.52503.9115.63銀杏葉對(duì)照提取物12512562.525031.25250麝香草酚250>5001255003.91500氟康唑0.250.250.1250.250.1250.5伊曲康唑0.06250.1250.06250.1250.030.03

3 討 論

近年來，隨著廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等的廣泛應(yīng)用，念珠菌病的感染逐年上升，且耐藥性問題也越來越嚴(yán)重。因此從中草藥提取物中開發(fā)高效、低毒的抗真菌藥物具有廣闊的前景。我們開展了中藥提取物對(duì)念珠菌的體外藥敏試驗(yàn)，從而為念珠菌病的有效治療提供新的思路。

近幾年，國(guó)內(nèi)外對(duì)中藥抗真菌作用有較多報(bào)道，王煥麗等[4]發(fā)現(xiàn)了大蒜對(duì)白念珠菌生長(zhǎng)的抑制效果與氟康唑相似，Yang等[5]的研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷能抑制Ca2+-Mg2+-ATP酶和琥珀酸脫氫酶 (SDH)的活性，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，繼而加速細(xì)胞凋亡的速度，Keyal等[6]的研究表明三七總皂甙和人參莖葉皂苷在體外藥敏實(shí)驗(yàn)中與氟康唑聯(lián)用具有協(xié)同抗氟康唑耐藥的白念珠菌作用。在我們的實(shí)驗(yàn)中也可以觀察到，三七總皂苷與人參莖葉皂苷對(duì)克柔念珠菌和近平滑念珠菌也具有一定的抗菌效果。我們的實(shí)驗(yàn)選用與念珠菌感染關(guān)系較密切的白念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌菌株的標(biāo)準(zhǔn)株作為實(shí)驗(yàn)菌株，對(duì)10種中藥提取物進(jìn)行了初篩試驗(yàn)，研究結(jié)果表明三七總皂甙和人參莖葉總皂甙對(duì)白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)珠較敏感,24 h MIC均為62.5 μg/mL，而48 h MIC均為125 μg/mL。在克柔念珠菌 (ATCC6258)的體外藥敏試驗(yàn)中，其對(duì)三七總皂甙和檸檬酸較敏感，24 h MIC均為1.96 μg/mL，在48 h時(shí)，克柔念珠菌對(duì)三七總皂甙較敏感，MIC為31.25 μg/mL。而在對(duì)近平滑念珠菌 (ATCC22019)體外藥敏試驗(yàn)中，近平滑念珠菌24 h時(shí)對(duì)人參莖葉皂苷和麝香草酚均較敏感，MIC均為3.91 μg/mL，48 h時(shí)其對(duì)人參莖葉皂甙較敏感，MIC為15.63 μg/mL。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同中藥提取物針對(duì)念珠菌不同菌種的效果存在一定差異，為進(jìn)一步篩選有抗真菌作用的中藥提取物提供了理論依據(jù)。此外，在本實(shí)驗(yàn)中檸檬酸和麝香草酚出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，提示雖然“拖尾”現(xiàn)象主要出現(xiàn)在唑類藥物中，但在中藥提取物抗真菌試驗(yàn)中也有所體現(xiàn)。目前，關(guān)于中藥提取物抗真菌的體外藥敏實(shí)驗(yàn)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)方案。本實(shí)驗(yàn)將 CLSI M27-A3方案用于中藥提取物抗念珠菌的體外藥敏試驗(yàn)中，具有實(shí)驗(yàn)結(jié)果易分析，方便，可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)。該研究的開展可為開發(fā)高效低毒的抗真菌藥提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Pappas PG,Kauffman CA,Andes D,et al.Clinical practice guidelines for the management of candidiasis:2009 update by the Infectious Diseases Society of America[J].Clin Infect Dis,2009,48(5):503-535.

[2] Sharma Y,Chumber SK,Kaur M.Studying the prevalence,species distribution,and detection ofinvitroproduction of phospholipase fromCandidaisolated from cases of invasive candidiasis[J].J Glob Infect Dis,2017,9(1):8.

[3] Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI).Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts,3rd edition,approved standard M27-A3[S].3rd ed.Wayne:Clinical and Laboratory Standards Institute,2008.

[4] 王煥麗,張錫寶,陳興平.大蒜素體外抗白念珠菌生物膜作用的初步研究[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志,2010,5(3):129-132.

[5] Yang S,Fu Y,Wu X,et al.Baicalin preventsCandidaalbicansinfections via increasing its apoptosis rate[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,451(1):36-41.

[6] Keyal U,Huang X,Bhatta AK.Drug interaction of traditional Chinese medicines with fluconazole against fluconazole resistant strains ofCandidaalbicans[J].Int J ClinExp Med,2016,9(11):22357-22362.

[本文編輯] 王 飛

Antifungal susceptibilities of ten kinds of traditional Chinese herb extracts againstCandidainvitro

LU Xiang-ting,HUANG Xin

(DepartmentofDermatology,ShanghaiTongjiHospital,AffiliatedTongjiHospitalofTongjiUniversity,Shanghai200065,China)

Objective To observe the antifungal effect of 10 kinds of traditional Chinese herb extractsinvitro.Methods We performedinvitrodrug susceptibility testing for ten kinds of traditional Chinese herb extracts,fluconazole and itraconazole againstCandidaisolates following CLSI M27-A3 guidelines.Results Panax notoginseng saponins (PNS) and ginseng stem-leave saponins (GSLS) were more sensitive toC.albicans.Their 24 h MIC values were 62.5 μg/mL and the 48 h MIC values were 125 μg/mL.PNS and Citric acid were more sensitive toC.kruseiat 24 h and their MIC values were both 1.96 μg/mL.PNS was more sensitive toC.kruseiat 48 h,the MIC were 31.25 μg/mL.GSLS and Thymolwere more sensitive toC.parapsilosisand their 24 h MICs were both 3.91 μg/mL.GSLS was sensitive toC.parapsilosisat 48 h,the MIC was 15.63 μg/mL.Conclusion PNS,GSLS,Citric acid and Thymol possessed activity againstCandidaisolatesinvitro.There were some differences in antifungal activity of different extracts of Chinese herbs against different kinds ofCandidaspecies.The results provide a theoretical basis for further screening of Chinese herb extracts.

Chinese herb extracts；Candida；drug susceptibility testing

83-85]

上海市科委自然科學(xué)基金 (17ZR1426300，13ZR1437900)

盧祥婷，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:lxtns15@163.com

黃欣,E-mail:alida_huang@163.com

R 379.4 R 978.5

A

1673-3827(2017)12-0083-03

2017-03-15