芒果苷協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌作用研究

董懷懷 王元花 廖澤彬 姜遠(yuǎn)英 曹穎瑛

(中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

·論著·

芒果苷協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌作用研究

董懷懷 王元花 廖澤彬 姜遠(yuǎn)英 曹穎瑛

(中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

目的 研究芒果苷與氟康唑合用對唑類耐藥白念珠菌協(xié)同抗真菌的作用和機(jī)制。方法 采用棋盤式微量稀釋法測試芒果苷協(xié)同氟康唑?qū)?2株耐藥白念珠菌的最小抑菌濃度MIC80；時(shí)間-殺菌曲線探究兩藥聯(lián)用對4株耐藥白念珠菌生長的抑制作用；藥物生長抑制實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)探究不同濃度芒果苷和不同濃度氟康唑協(xié)同抗耐藥白念珠菌藥效；通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測兩藥聯(lián)用時(shí)耐藥基因CDR1、CDR2、MDR1表達(dá)水平。結(jié)果 芒果苷聯(lián)合氟康唑可產(chǎn)生協(xié)同抗唑類白念珠菌作用，協(xié)同指數(shù) (FICI)<0.5；兩藥合用對白念珠菌生長可產(chǎn)生抑制作用；兩藥合用降低耐藥基因CDR1表達(dá)水平。結(jié)論 芒果苷與氟康唑合用可產(chǎn)生協(xié)同抗唑類耐藥白念珠菌作用。

耐藥白念珠菌；芒果苷；氟康唑

近年來，由于抗生素和免疫抑制劑的廣泛使用，免疫缺陷患者 (艾滋病患者、器官移植患者和放、化療癌癥患者)不斷增多，深部真菌感染發(fā)生率逐年增加，尤其白念珠菌 (Candidaalbicans)感染最為常見[1]。白念珠菌作為一種條件致病真菌，會引起人類淺表性和系統(tǒng)性感染，導(dǎo)致陰道炎、菌血癥等疾病。氟康唑等唑類藥物是臨床上治療和預(yù)防白念珠菌感染的常用藥物，但隨著藥物長期使用，耐藥現(xiàn)象非常普遍[2]。目前對白念珠菌耐藥性機(jī)制研究包括細(xì)胞膜通透性降低、外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)、藥物靶點(diǎn)基因變異或過度表達(dá)、生物被膜的形成等[3-6]。為解決真菌耐藥難題，小檗堿、黃芩素和光甘草定等抗真菌藥物增效劑研究受到廣泛關(guān)注[7-9]。

芒果苷 (mangiferin)是一種雙苯吡酮類黃酮類化合物，結(jié)構(gòu)見圖1。研究表明，芒果苷具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗細(xì)菌等多方面藥理活性，但對于芒果苷抗耐藥白念珠菌藥理作用尚未有報(bào)導(dǎo)[10-12]。本實(shí)驗(yàn)通過測試22株臨床耐藥白念珠菌MIC80、藥物生長抑制實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)、殺菌曲線和RT-PCR研究芒果苷協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌的作用機(jī)制，為臨床治療耐藥白念珠菌感染提供新思路、提供安全有效的給藥方案。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 臨床耐藥白念珠菌 (Candidaalbicans,C.albicans)22株，由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬上海市長海醫(yī)院真菌室提供，并且經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定。

藥物 氟康唑 (fluconazole,FLC，批號F8929)和芒果苷 (mangiferin,MG,批號M3547)從sigma公司購買，二甲亞砜 (Dimethyl sulfoxide，DMSO)購自國藥化學(xué)試劑有限公司。氟康唑和芒果苷分別用二甲亞砜溶解，配制使用。

培養(yǎng)基 YPD液體培養(yǎng)基 (2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母浸膏)。SDA固體培養(yǎng)基 (4%葡萄糖，2%瓊脂，1%蛋白胨)。RPMI1640培養(yǎng)基 (3.45%嗎啡啉丙磺酸，1%RPMI1640，0.2%NaHCO3，NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，與4℃保存[13])。

儀器 HZQ-F160恒溫振蕩培養(yǎng)箱 (江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)，Eppendorf 5417高速冷凍離心機(jī) (Eppendorf)，SW-CT-IF型超凈化工作臺 (蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (Becton,Dickinson and Company)。

1.2 方法

菌株培養(yǎng) 從SDA固體培養(yǎng)基上挑取單克隆菌株與YPD液體培養(yǎng)基，30℃，200 r/min活化培養(yǎng)16 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

棋盤式微量稀釋法 藥物最小抑菌濃度MIC80測定：取16 h活化后菌液，用新鮮的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋重懸，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整菌液濃度至1×103～5×103CFU/mL。按照CLSI推薦RPMI1640培養(yǎng)基倍比稀釋法[14-15]，在24、48 h分別測定藥物MIC80值(與空白對照組相比，以O(shè)D600下降80%以上的最低藥物濃度為MIC80值)。

協(xié)同藥效判定 采用聯(lián)合抑菌分?jǐn)?shù)考察協(xié)同藥效，聯(lián)合抑菌分?jǐn)?shù)分別為每種藥物合用時(shí)抑菌時(shí)所需最低抑菌濃度(MIC)分別除以單用時(shí)MIC商的和，F(xiàn)ICI≤0.5時(shí)兩藥的相互作用確定為協(xié)同作用[16]。

生長抑制實(shí)驗(yàn) 將過夜培養(yǎng)16h后菌液PBS漂洗兩次，再用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整菌濃度至5×103，稀釋菌液分裝與高壓滅菌玻璃管中。各組加入單用及聯(lián)用藥物，30℃，200 r/min恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后拍照，用血球計(jì)數(shù)板記錄各組單克隆菌數(shù)目[9]。

殺菌曲線實(shí)驗(yàn) 將過夜菌液用PBS漂洗兩次后再用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整菌濃度至1×103～5×103CFU/mL，分別加入單用及合用藥物。在0、12、24、36、48 h從不同稀釋倍數(shù)的菌液中各取適量，均勻涂鋪于含SDA固體培養(yǎng)基表面。平皿于30℃真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)菌落數(shù)目，以log10 CFU/mL對時(shí)間作曲線。

提取總RNA及Real-Time PCR 白念珠菌耐藥菌103于YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期 (OD600=0.5),分別加入氟康唑 (4 μg/mL)、芒果苷 (32 μg/mL)、氟康唑芒果苷合用 (8 μg/mL氟康唑+32 μg/mL芒果苷)，30℃，200 r/min培養(yǎng)12 h后，參照北京天恩澤公司試劑盒提取RNA。314 nm處檢測RNA濃度，并檢測OD260/OD280和OD260/OD230數(shù)值，考察RNA提取的質(zhì)量，然后各組取相同量RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR (Real Time PCR)循環(huán)參數(shù)如下：95℃ (變性)5 s,55℃ 30 s (退火),72℃ 1 min (延伸)，重復(fù)45個循環(huán)。以18S rRNA為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法分析基因表達(dá)水平差異。本實(shí)驗(yàn)選取所用引物見表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)RT-PCR引物序列

注：F.正向引物,R.反向引物

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)所有結(jié)果均進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)，采用GraphPad Prism 5分析及作圖，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 芒果苷協(xié)同氟康唑MIC80

應(yīng)用棋盤式微量稀釋法，檢測芒果苷和氟康唑合用對22株臨床耐藥菌的最低抑菌濃度。結(jié)果顯示：兩個藥物單用MIC80>64 μg/mL，4～8 μg/mL芒果苷聯(lián)用可以降低氟康唑的最低抑菌濃度至1～4 μg/mL (見表2)。部分協(xié)同指數(shù) (fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI，分別為每種藥物合用時(shí)抑菌時(shí)所需最低抑菌濃度MIC與單用時(shí)MIC的比值，F(xiàn)ICI≤0.5時(shí)兩藥的相互作用確定為協(xié)同作用，且FICI數(shù)值越小，協(xié)同作用越強(qiáng))小于0.2 (見表2)，說明芒果苷與氟康唑具有明顯的協(xié)同抗菌藥效。

表2 芒果苷協(xié)同氟康唑抗臨床耐藥白念珠菌MIC80

Tab.2 MIC80of the combination of mangiferin and fluconazole against fluconazole-resistantC.albicansby microdilution assay

菌株MIC80單獨(dú)(μg/mL)MIC80結(jié)合24h(μg/mL)FLCMGFLCMGFICI綜合指數(shù)MIC80結(jié)合48h(μg/mL)FLCMGFICI綜合指數(shù)模式18#>64>64440.13480.19協(xié)同25#>64>64240.09440.13協(xié)同J18>64>64440.13440.13協(xié)同J28>64>64180.14280.16協(xié)同J38>64>64180.14280.16協(xié)同7>64>64280.16280.16協(xié)同17>64>64180.14280.16協(xié)同18>64>64240.09440.13協(xié)同032>64>64480.19480.19協(xié)同100>64>64180.14280.16協(xié)同103>64>64180.14180.14協(xié)同162>64>64140.08240.09協(xié)同215>64>64240.09440.13協(xié)同271>64>64180.14280.16協(xié)同305>64>64240.09280.16協(xié)同385>64>64140.19140.19協(xié)同502>64>64140.08180.14協(xié)同557>64>64240.09280.16協(xié)同842>64>64280.16280.16協(xié)同876>64>64180.14280.16協(xié)同901>64>64280.16480.19協(xié)同940>64>64180.14280.16協(xié)同

注：MG.芒果苷,FLC.氟康唑

2.2 生長抑制實(shí)驗(yàn)

生長抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究氟康唑和芒果苷不同濃度下合用對耐藥白念珠菌的抑制作用，將實(shí)驗(yàn)室前期經(jīng)過形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定的103耐藥菌株為研究對象，藥物作用48 h后通過拍照記錄各組菌液渾濁情況和對各組細(xì)胞濃度計(jì)數(shù)反應(yīng)藥物對菌的抑制作用。由圖2a分析可看出，空白組2～4 μg/mL氟康唑和4～64 μg/mL芒果苷單用組溶液渾濁，表明兩個藥物單用不能抑制103耐藥菌的生長。而1 μg/mL氟康唑與8 μg/mL芒果苷合用組，溶液顯澄清，說明該濃度藥物明顯抑制了103菌的生長，這與棋盤式鋪板實(shí)驗(yàn)MIC80數(shù)據(jù)相符合 (見表2)。對各組細(xì)胞分別計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析可以得出，氟康唑和芒果苷單獨(dú)加入后，耐藥菌103最終都生長至108左右，與空白組相比沒有明顯差異。當(dāng)氟康唑與不同濃度芒果苷聯(lián)用后，菌的生長受到了明顯抑制。并且隨藥物濃度增加，菌生長抑制作用更加明顯，呈現(xiàn)一定量效關(guān)系 (見圖2b)。

2.3 時(shí)間-殺菌曲線

時(shí)間-殺菌曲線可以反應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)藥物的抑菌或殺菌作用，本實(shí)驗(yàn)采用時(shí)間-殺菌曲線研究芒果苷和氟康唑聯(lián)用對四株臨床耐藥白念珠菌103、385、876、940抑制作用。菌液起始濃度參照棋盤式稀釋法1～5×103CFU/mL，倍比稀釋涂板分析0、12、24、36、48 h兩藥聯(lián)用的作用。結(jié)果表明：32 μg/mL芒果苷 (MG)對四株耐藥白念珠菌未顯示抑制作用，這與棋盤式結(jié)果相符 (芒果苷單用MIC80>64 μg/mL)；8 μg/mL氟康唑 (FLC)前期對菌生長有一定抑制作用，在48 h后差異不明顯；32 μg/mL芒果苷 (MG)與8 μg/mL氟康唑 (FLC)聯(lián)用后，24 h就可顯示差異，作用36、48 h與單用組和空白組相比差異更加明顯 (見圖3)。

2.4 芒果苷和氟康唑聯(lián)用對耐藥基因表達(dá)影響

白念珠菌103經(jīng)氟康唑、芒果苷及兩藥聯(lián)合作用10 h后，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR測定白念珠菌耐藥基因CDR1、CDR2、MDR1的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)用組耐藥基因表達(dá)水平明顯低于氟康唑單用組，氟康唑單用組CDR2、MDR1明顯上調(diào)2.5倍左右。在聯(lián)用組基因表達(dá)水平中，CDR1下調(diào)最為明顯，CDR2、MDR2較氟康唑單用組下調(diào)1～1.5倍 (見圖4)。

3 討 論

目前，應(yīng)用于臨床的抗真菌藥物數(shù)量有限，主要包括唑類抗真菌藥物，如氟康唑；多烯類抗生素，

Fig.1 Structure of mangiferin Fig.2 Growth condition of fluconazole-resistantCandidaalbicans103 treated with different concentrations of fluconazole (FLC) and mangiferin (MG).Fluconazole-resistantCandidaalbicans103 were suspended to 5×103CFU/mL in glass tubes.Different concentrations of fluconazole (16,8,4,2,1 μg/mL) and mangiferin (64,32,16,8,4 μg/mL) alone or the combiantion were added into tubes.After incubation at 30℃,200 r/min for 48 h,pictures were taken.Colony were determined by Hemocytometer Measurement (a.Pictures of growth condition ofCandidaalbicans103 after 48 h incubation,b.Number ofCandidaalbicansin each tube detemined by Hemocytometer Measurement).Each experimental condition was independently repeated three times (MG.mangiferin,FLC.fluconazole)

如兩性霉素B；棘白菌素類抗真菌藥物，如卡泊芬凈；丙烯胺類，如特比萘芬。其中，氟康唑由于溶解

Fig.3 Time-kill curves of 8 μg/mL fluconazole and 32 μg/mL mangiferin against fluconazole-resistantCandidaalbicans103,385,876 and 940.Each experimental condition was independently repeated for three times (MG.mangiferin,FLC.fluconazole) Fig.4 Effects of 32 μg/mL mangiferin in combination with 8 μg/mL fluconazole on the expression of CDR1,CDR2,MDR1 inCandidaalbicans.Each experimental condition was independently repeated for three times (MG.mangiferin,FLC.fluconazole)

性好、不良反應(yīng)較少、生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)，受到廣泛應(yīng)用。但由于多次重復(fù)給藥和長期治療，導(dǎo)致耐藥性越來越普遍。而且，對氟康唑耐藥的臨床菌株通常對其他唑類藥物 (如伏立康唑、酮康唑、伊曲康唑等)能夠產(chǎn)生交叉耐藥現(xiàn)象。其中，白念珠菌 (Candidaalbicans)是臨床最常見的條件致病性真菌，能夠引起皮膚感染、黏膜感染以及侵入性深部真菌感染等多種疾病。近年來，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道白念珠菌對氟康唑的耐藥性不斷增強(qiáng)，成為臨床上治療失敗的主要原因。

研究表明白念珠菌耐藥的主要機(jī)制包括藥物靶點(diǎn)基因 (Erg11)突變或高度表達(dá)、細(xì)胞對藥物外排能力增強(qiáng)、形成生物被膜。其中，對藥物外排能力增強(qiáng)，減少抗真菌藥物胞內(nèi)積累，是白念珠菌對唑類藥物最主要的耐藥機(jī)制。藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (ATP-biding cassette)和易化擴(kuò)散載體超家族蛋白 (major facilitator superfamily)，但只有Cdr1p、Cdr2p、Mdr1p與白念珠菌耐藥性相關(guān)。

芒果苷作為一種從植物中提取的天然化合物，資源豐富，毒副作用低，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多方面藥理作用。此外，近年來研究發(fā)現(xiàn)芒果苷具有抑制病原微生物作用，例如芒果苷可以協(xié)同紅霉素抗痤瘡丙酸桿菌及金黃色葡萄球菌，芒果苷泡騰片體外可以抑制銅綠假單胞菌、大腸埃希菌生長，但對于抗耐藥白念珠菌作用未有研究報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，芒果苷作為一種抗真菌增效劑，可以恢復(fù)耐藥菌對藥物的敏感性，降低氟康唑MIC80至1～4 μg/mL。藥物敏感實(shí)驗(yàn)分析對比藥物作用48 h后菌液渾濁度、涂板計(jì)數(shù)每個藥物濃度作用48 h后菌的克隆數(shù)目進(jìn)一步確認(rèn)了兩藥合用對耐藥白念珠菌的抑制作用。隨機(jī)選取103、385、876、940四株耐藥菌進(jìn)行殺菌曲線實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明32 μg/mL芒果苷和8 μg/mL氟康唑聯(lián)用可明顯抑制菌的生長，并表明兩藥聯(lián)用對耐藥白念珠菌抑制作用的普遍性。

白念珠菌的主要耐藥蛋白包括Cdr1p、Cdr2p、Mdr1p，Cdr1p蛋白是最先從白念珠菌中表達(dá)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[17]，直接參與白念珠菌對氮唑類藥物耐藥性的產(chǎn)生[18]，大量研究發(fā)現(xiàn)Cdr1p蛋白的高表達(dá)是臨床耐藥白念珠菌耐藥的主要機(jī)制[19-20]。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析耐藥基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示氟康唑處理組CDR1、CDR2、MDR1基因表達(dá)水平升高，這可能與白念珠菌103在藥物刺激下外排泵能力增強(qiáng)有關(guān)；相對8 μg/mL氟康唑處理組，聯(lián)合用藥組耐藥基因CDR1、CDR2、MDR1基因表達(dá)水平明顯下調(diào)，CDR1下調(diào)幅度最大。結(jié)果提示 芒果苷協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌分子機(jī)制可能是由于Cdr1p、Cdr2p、Mdr1p耐藥蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能受到抑制，從而恢復(fù)了菌株對氟康唑的敏感性。其中，聯(lián)合用藥處理組CDR1基因表達(dá)水平下調(diào)最明顯，表明MG與FLC協(xié)同抗耐藥白念珠菌的主要分子機(jī)制與Cdr1p蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能受到抑制有關(guān)。

綜上所述，本次研究首次報(bào)道了芒果苷具有協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌作用。通過對多株耐藥菌測試MIC80，生長抑制實(shí)驗(yàn)和殺菌曲線證實(shí)了兩藥聯(lián)用抗耐藥白念珠菌作用的普遍性。應(yīng)用RT-PCR提示兩藥合用機(jī)制與耐藥基因CDR1、CDR2、MDR1表達(dá)水平下調(diào)及外排泵能力減弱有關(guān)。芒果苷毒副作用低，提取方便，芒果苷和氟康唑聯(lián)用抗耐藥白念珠菌可以為臨床耐藥菌治療提供安全、有效的新思路和新方案。

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Synergistic effect of mangiferin in combination with fluconazole against fluconazole-resistantCandidaalbicans

DONG Huai-huai,WANG Yuan-hua,LIAO Ze-bin,JIANG Yuan-ying,CAO Ying-ying

(NewDrugRearchandDevelopmentCenter,SchoolofPharmacy,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Objective To explore the synergistic effect of mangiferin in combination with fluconazole against fluconazole-resistantCandidaalbicans.Methods The minimal inhibitory concentrations (MIC80) of 22 fluconazole-resistantCandidaalbicansstrains by mangiferin in combination with fluconazole were determined by checkerboard microdilution assay.Time-kill curves and cell growth test were used to investigate the synergistic effect onCandidaalbciansgrowth process.The expression of CDR1,CDR2,MDR1 were measured by Real time RT-PCR.Results Mangiferin in combination with fluconazole could inhibit the growth ofCandidaalbicansobviously (FICI<0.5).Mangiferin and fluconazole-treated cells expressed lower level of CDR1 mRNA than the cells grown in the presence of fluconazole or mangiferin alone.Conclusions Mangiferin possessed a synergistic effect with fluconazole against fluconazole-resistantCandidaalbcians.

fluconazole-resistantCandidaalbicans；mangiferin；fluconazole

78-82]

國家973項(xiàng)目 (2013CB531602)；國家自然科學(xué)基金 (81271798,81671991)

董懷懷，男 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:13917511681@163.com

姜遠(yuǎn)英,E-mail:13761571578@163.com;曹穎瑛,E-mail:caoyingying608@163.com

R 379.4

A

1673-3827(2017)12-0078-05

2016-10-15 [本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮