兩株白色不產(chǎn)孢煙曲霉形態(tài)學(xué)及毒力研究

姜媛 張彩云 王逢源 孔慶濤 張征 曾秋瓊 龍南彪 桑紅

(1.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院皮膚科,南京 210002；2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南京 210046)

·論著·

兩株白色不產(chǎn)孢煙曲霉形態(tài)學(xué)及毒力研究

姜媛1張彩云1王逢源1孔慶濤1張征1曾秋瓊1龍南彪2桑紅1

(1.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院皮膚科,南京 210002；2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南京 210046)

目的 將先后發(fā)現(xiàn)的兩株白色不產(chǎn)孢的煙曲霉A1j與A2j進(jìn)行對(duì)比，觀察其在形態(tài)學(xué)和毒力方面是否有差異。方法 通過(guò)真菌基因組DNA的保守序列ITS和β-tub的測(cè)序?qū)2j進(jìn)行菌種鑒定；采用小培養(yǎng)方法在顯微鏡下比較A1j、A2j及標(biāo)準(zhǔn)株Af293的菌絲形態(tài)；觀察A1j和A2j在不同培養(yǎng)時(shí)間和不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)；在小鼠模型上測(cè)試其毒力變化。結(jié)果 通過(guò)ITS和β-tub的測(cè)序A2j被鑒定為煙曲霉；小培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)A1j和A2j與標(biāo)準(zhǔn)菌株Af293不同，兩者均為不產(chǎn)孢的煙曲霉，且兩者生長(zhǎng)速度明顯不同；培養(yǎng)不同的時(shí)間和不同的培養(yǎng)基均不能誘導(dǎo)A1j和A2j產(chǎn)色和產(chǎn)孢，但是50℃下，A1j被限制生長(zhǎng)，而A2j卻能生長(zhǎng)；在免疫抑制的小鼠模型中，與標(biāo)準(zhǔn)菌株Af293相比，A1j的毒力下降，但A2j小鼠的死亡數(shù)量、死亡速度與Af293相當(dāng)，表明A2j的毒力并沒有降低。結(jié)論 新發(fā)現(xiàn)的白色不產(chǎn)孢煙曲霉A2j與A1j在生長(zhǎng)速度、耐熱性和毒力方面均不同。

煙曲霉；鑒定；孢子形成；侵襲性曲霉病模型

煙曲霉是一種廣泛存在于大自然的機(jī)會(huì)性致病菌，通常能夠產(chǎn)生通過(guò)空氣傳播的孢子，孢子很容易沉積在肺部達(dá)到肺泡水平[1]。煙曲霉能夠產(chǎn)生大量孢子，該孢子具有黏附性、耐氧化應(yīng)激性以及耐熱性，所以煙曲霉有較高的致病潛能。同時(shí)，它也能產(chǎn)生影響循環(huán)系統(tǒng)中性粒細(xì)胞的膠酶霉素[2-3]和具有一定毒力的黑色素。免疫抑制的患者為易感人群。一旦感染，其病死率極高[4]。健康人群可以通過(guò)完善的免疫系統(tǒng)及時(shí)清除孢子與菌絲，從而能夠有效防止煙曲霉對(duì)人體重要器官和組織的損害[3]。

煙曲霉的鑒定傳統(tǒng)的方法是依靠真菌培養(yǎng)陽(yáng)性菌株的表型和溫度試驗(yàn)等，容易判斷不準(zhǔn)確[5-6]。為了準(zhǔn)確鑒定曲霉，使用核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS)序列擴(kuò)增的分子生物學(xué)方法已經(jīng)成為鑒定不同致病真菌的金標(biāo)準(zhǔn)[7]，然而，ITS序列擴(kuò)增不能將A2j鑒定到種的水平，只能鑒定到組 (Section)的水平。因此，完善的菌種鑒定還需要進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，如β-tubulin測(cè)序[8]。

我們實(shí)驗(yàn)組首次報(bào)道了第1株非典型的煙曲霉 (不產(chǎn)生黑色素和孢子)命名為A1j，且已對(duì)其形態(tài)學(xué)、毒力以及形態(tài)學(xué)差異相關(guān)的分子機(jī)制做了相關(guān)的研究[9]。本文將分離和鑒定到的另外一株罕見的不產(chǎn)孢煙曲霉臨床株 (命名為A2j)，將其與A1j及標(biāo)準(zhǔn)株Af293在形態(tài)學(xué)、毒力進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)：盡管這兩株菌都不產(chǎn)生孢子，但是它們?cè)谏L(zhǎng)速度、耐熱性及毒力都存在明顯差異。我們第2次報(bào)道了這種特殊煙曲霉。這些方面的差異將有助于提高我們對(duì)這種白色不產(chǎn)孢煙曲霉的認(rèn)識(shí)，也同時(shí)為我們接下來(lái)研究它們形態(tài)學(xué)相關(guān)分子機(jī)制方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

煙曲霉野生型293 (購(gòu)于FGSC，真菌基因儲(chǔ)存中心，生命科學(xué)院，美國(guó)密蘇里大學(xué)，堪薩斯市，密蘇里，美國(guó))，A1j[9](從肺曲霉病患者組織標(biāo)本中分離純化的臨床分離株，現(xiàn)保存于中國(guó)科學(xué)院皮膚病研究所)，A2j(從肺曲霉病患者組織標(biāo)本分離純化的臨床分離株，現(xiàn)保存于中國(guó)科學(xué)院皮膚病研究所)。菌株主要采用YAG培養(yǎng)基[10]，其他培養(yǎng)基主要包括PDA、CDA、YPD、CA、MEA、CAY[6]。

1.2 光學(xué)顯微鏡觀察

采用改進(jìn)后的小培養(yǎng)法[9]：首先準(zhǔn)備好足夠的YAG培養(yǎng)基，用無(wú)菌手術(shù)刀將培養(yǎng)基切成7～10 mm的小培養(yǎng)基，然后在新的YAG培養(yǎng)基上放上5～6個(gè)小培養(yǎng)基，相互之間留有一定空間。用棉簽在各個(gè)小培養(yǎng)基中央接種上菌，每個(gè)平板只接種1種菌，避免相互污染。各個(gè)菌在YAG小培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)18 h或者更長(zhǎng)時(shí)間后用光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3 毒力測(cè)試

接種菌懸液的準(zhǔn)備 ①Af293菌懸液的配制：將Af293接種于YAG平板37℃培養(yǎng)2 d，用0.01% Tween 80收集孢子，經(jīng)8層紗布過(guò)濾后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并稀釋成108/mL的孢子懸液。②A1j和A2j菌懸液的配制：用接種針挑取A1j和A2j菌落于鋪好玻璃濾紙的YAG固體培養(yǎng)基中同樣在37℃培養(yǎng)2 d，然后從菌落邊緣挑取菌絲傳代到另一個(gè)鋪好無(wú)菌玻璃紙的YAG固體平板，同樣37℃恒溫培養(yǎng)2 d，以獲得不帶培養(yǎng)基的A1j、A2j純菌絲。然后用移液管吸取100 μL Af293的菌絲液以及刮取大約3 cm2A1j和A2j的菌絲片分別放入100 mL的YAG液體培養(yǎng)基中，接著將三者同時(shí)置于37℃的溫控?fù)u床中以220 r/min的速度培養(yǎng)18 h。然后用無(wú)菌紗布收集菌絲，并用濾紙吸干后以1 g菌絲∶10 mL生理鹽水的比例放入勻漿器中研磨。然后轉(zhuǎn)到玻璃管中備用。稀釋10倍研磨液，使用分光光度計(jì)測(cè)定其在600 nm時(shí)的光密度值 (OD600)，將其調(diào)整到OD600=0.6，并用麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管驗(yàn)證調(diào)整好的勻漿濃度 (10倍稀釋液約為麥?zhǔn)?號(hào)管濃度的4倍，即4個(gè)麥?zhǔn)蠁挝籟11])。

小鼠感染模型的建立 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：6～8周齡清潔級(jí)ICR雄性小鼠52只 (購(gòu)于南京師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重30～35 g，隨機(jī)分為Af293、A1j、A2j和生理鹽水 (NS)四組，每組13只；10只用于觀察存活率，繪制生存-時(shí)間曲線。②免疫抑制方法：環(huán)磷酰胺150 mg/kg體重，接種前3 d (-d3)、前1 d (-d1)腹腔注射1次/d，氫化可的松40 mg/kg體重-d1皮下注射1次/d (以感染當(dāng)天為第0天)。感染后d3環(huán)磷酰胺75 mg/kg體重腹腔注射進(jìn)行免疫抑制維持，為了避免細(xì)菌污染小鼠，在小鼠的飲用水中加入四環(huán)素 (1 mg/mL)[12]。③菌絲勻漿氣管插管接種方法：在感染當(dāng)天根據(jù)LI等[13]的方法先用1%戊巴比妥鈉10 mL/kg進(jìn)行麻醉，然后對(duì)各組小鼠分別采用氣管插管接種方法接種50 μL的菌絲勻漿或者生理鹽水。④繪制小鼠生存-時(shí)間曲線：每隔6 h觀察小鼠的死亡只數(shù)，直到觀察到感染的第16 d。用SPSS 13.0軟件、描繪小鼠生存-時(shí)間曲線圖，以log-rank檢驗(yàn)P<0.05為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑤小鼠肺組織病理檢查：觀察發(fā)現(xiàn)小鼠死亡后，立即取出解剖，右肺浸泡在10%甲醛溶液中留作PAS染色，左肺剪成碎塊放置在有氯霉素的YAG培養(yǎng)基的平板上，37℃恒溫培養(yǎng)2 d觀察是否有菌落生長(zhǎng)。

1.4 DNA提取和分析

使用真菌基因組提取試劑盒 (來(lái)自中國(guó)博日科技有限公司)基因組DNA。通用真菌引物對(duì)即：ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)用于擴(kuò)增ITS基因[14]，benA-F (5’-AATTGGTGCCGCTTTCTGG-3’)和benA-R (5’-AGTTGTCGGGACGGAATAG-3’)擴(kuò)增β-tub部分基因序列[15]。

2 結(jié) 果

2.1A2j的鑒定

我們對(duì)A2j的ITS區(qū)域和β-tubulin基因進(jìn)行了測(cè)序。ITS序列的同源性：在NCBI中，A2j為99%，在AspGD中，A2j為99.5%。β-tub序列的同源性：在NCBI中，A2j為100%，在AspGD中，A2j為99.8%。因此A2j被準(zhǔn)確鑒定為A.fumigatus。

2.2A2j的形態(tài)學(xué)特征

將兩株菌都放在YAG培養(yǎng)基上37℃下培養(yǎng)1 d、3 d、4 d和6 d，并同時(shí)放在光學(xué)顯微鏡下觀察，我們觀察到兩株菌表現(xiàn)為毛茸茸的白色菌落，但是A2j生長(zhǎng)速度比A1j快，生長(zhǎng)速度與Af293相當(dāng) (見圖1a)。光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)A1j和A2j均表現(xiàn)為分支分隔的菌絲但是沒有孢子的產(chǎn)生，但是Af293可見典型的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu) (見圖1b)。

為研究不同的培養(yǎng)基或者不同的溫度能否使不產(chǎn)孢煙曲霉A1j和A2j恢復(fù)孢子的形成以及比較兩者形態(tài)學(xué)方面的差異，我們將A1j和A2j分別接種于YAG、PDA、CDA、SDA、YPD、CA、CAY和MEA培養(yǎng)基上在37℃或者50℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d或者5 d，我們發(fā)現(xiàn)盡管兩株菌在不同的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率不同，但是仍然是不產(chǎn)孢的。在37℃溫度下，無(wú)論是培養(yǎng)3 d還是5 d，A2j的生長(zhǎng)速率總是比A1j快。培養(yǎng)5 d后A2j平板幾乎被菌落全部鋪滿。其中A1j在YAG和YPD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快而在CDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢。無(wú)論在哪種培養(yǎng)基上，A1j在50℃的溫度條件下3 d和5 d均不能生長(zhǎng)。但是A2j在PDA、CAY和YAG培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快，A2j在CA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢 (見圖1c)。在50℃的溫度條件下，A2j卻能生長(zhǎng)，且把其培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至14 d，仍然能生長(zhǎng)。不僅如此，A2j在50℃的溫度條件下培養(yǎng)5 d，PDA和YAG培養(yǎng)基上的小培養(yǎng)光學(xué)顯微鏡下觀察均可見串珠狀的異常形態(tài)菌絲 (見圖1d)。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A1j和A2j均可以導(dǎo)致免疫抑制的小鼠體內(nèi)形成肺曲霉病，前者毒力降低，但是后者毒力并未降低。

為驗(yàn)證A2j與標(biāo)準(zhǔn)株Af293相比的毒力是否是下降的以及比較A1j和A2j毒力的差異，我們建立了免疫抑制的肺曲霉病的動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)生理鹽水組所有的小鼠均存活到觀察的終點(diǎn)。但Af293在觀察的第14天全部死亡，A1j只在觀察的前2 d死亡2只后一直保持不變，A1j和Af293的生存率分別是80%和0%，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。A2j在前6 d死亡的較快 (40%)，到觀察終點(diǎn)共死亡8只，其生存率為20%，與Af293相比，兩者之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)(見圖2)。

如圖3所示在死亡于肺曲霉病的小鼠的病理切片 (PAS染色)中，可見3株煙曲霉均生長(zhǎng)于氣管腔內(nèi)或者外壁的周圍，且有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并呈多灶性分布。從病理圖片上可見A2j和Af293的病灶比A1j多，而A2j的病灶比Af293少。A1j的病灶在感染后3 d已經(jīng)消失，但A2j的病灶仍然存在。這些結(jié)果表明A1j和A2j均可以在免疫抑制的小鼠身上誘導(dǎo)出曲霉病，不僅如此，與標(biāo)準(zhǔn)株Af293相比，A1j的毒力降低，而A2j的毒力并未下降。

3 討 論

煙曲霉的鑒定傳統(tǒng)方法不準(zhǔn)確率往往很高。采用核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS)序列擴(kuò)增的分子生物學(xué)方法已經(jīng)成為鑒定不同致病真菌的金標(biāo)準(zhǔn)[7]，但是ITS測(cè)序只能鑒定到組的水平，β-tubulin測(cè)序可正確的鑒定到菌種水平。另之前報(bào)道的不產(chǎn)孢白色煙曲霉A1j已經(jīng)通過(guò)采用ITS和β-tubulin測(cè)序的方法得以鑒定[9]。本文采用ITS和β-tubulin基因測(cè)序方法，且將得到的序列分別在NCBI和AspGD兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，與煙曲霉相似度均達(dá)到99%，因此A2j被準(zhǔn)確鑒定為煙曲霉。

圖1 a.不同培養(yǎng)時(shí)間A1j和A2j的菌落形態(tài) (以Af293為對(duì)照)；b.A1j、A2j和Af293的光學(xué)顯微鏡下形態(tài)；c.不同培養(yǎng)基上及不同溫度條件下培養(yǎng)的A1j和A2j菌落形態(tài)；d.50℃的溫度條件下培養(yǎng)5 d,光學(xué)顯微鏡下觀察均可見串珠狀的異常形態(tài)菌絲 圖2A1j,A2j和Af293小鼠感染實(shí)驗(yàn)生存-時(shí)間曲線 圖3 感染2.5 d后各組小鼠的肺組織PAS染色圖 (黑色箭頭指示菌絲；上圖放大倍數(shù)為10×，下圖為40×)

Fig.1 a.Colony morphogenesis of different incubation periods ofA1jandA2jcompared to reference Af293;b.Morphogenesis ofA1j,A2jand Af293 under light microscope;c.Colony morphogenesis ofA1jandA2jinoculated on various medium types or at different temperatures;d.Abnormal germination and morphogenesis ofA2jinoculated on PDA and YAG medium for 5 days at 50℃ temperature under the microscope Fig.2 Survival curves of NS,A1j,A2jor Af293 infected mice Fig.3 Photographs of PAS stained lung sections of mice died in 2.5 days post-infection of indicated strains (Black arrows indicate hyphae.Photomicrographs of the upper line were 10×magnified,and below ones were 40×magnified)

Balajee等[6]研究發(fā)現(xiàn)延長(zhǎng)生長(zhǎng)時(shí)間或者用不同的培養(yǎng)基可能刺激不產(chǎn)孢或者產(chǎn)孢減弱的A.fumigatus缺陷株或變種產(chǎn)孢和產(chǎn)黑色素,又有研究報(bào)道煙曲霉很高的耐熱性，甚至能夠在70 ℃的高溫條件下生長(zhǎng)[16]。A1j和A2j同時(shí)進(jìn)行此項(xiàng)研究卻發(fā)現(xiàn)在相同的培養(yǎng)基上培養(yǎng)相同時(shí)間A1j比A2j生長(zhǎng)慢，不同的培養(yǎng)基和延長(zhǎng)時(shí)間均不能刺激兩者產(chǎn)孢和產(chǎn)黑色素，在50℃的高溫調(diào)節(jié)下A1j不能生長(zhǎng)，A2j能夠生長(zhǎng)。據(jù)此我們推測(cè)A1j的耐熱性沒有A2j高，可能與兩者耐熱相關(guān)基因存在差異有關(guān)。

煙曲霉是一種機(jī)會(huì)性致病菌，膠酶霉素和黑色素是其非常重要的兩種毒力因素[3-4]，新發(fā)現(xiàn)的兩株煙曲霉A1j和A2j均不能產(chǎn)生黑色素和孢子。第1株非典型煙曲霉A1j已通過(guò)體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)其毒力與標(biāo)準(zhǔn)株Af293相比是下降的[9]。而與煙曲霉A1j不同的是：同樣不產(chǎn)黑色素和孢子的煙曲霉A2j，在小鼠感染模型試驗(yàn)中，雖可導(dǎo)致免疫抑制的小鼠體內(nèi)形成肺曲霉病，但是毒力并未降低，這與A1j結(jié)果相反，說(shuō)明同樣白色不產(chǎn)孢的兩株煙曲霉其毒力是不同的。

感染小鼠模型中，A2j與Af293相比，兩者的生存率并沒有顯著的差異，而A1j卻增加了生存率。我們也觀察到感染的小鼠中，A2j能生存足夠長(zhǎng)的時(shí)間 (>4 d)，且在4 d后死亡的A2j小鼠肺進(jìn)行培養(yǎng)且做病理仍能培養(yǎng)出菌落及觀察到A2j菌絲，A1j與其結(jié)果恰恰相反。Mellado等[17]研究得出chsC和chsG幾丁質(zhì)合成酶基因突變株不僅會(huì)使侵入性肺曲霉病的小鼠毒力下降，且生長(zhǎng)速率也會(huì)降低。Paisley等[18]研究發(fā)現(xiàn)煙曲霉的毒力下降與生長(zhǎng)速率成正相關(guān)。由此推測(cè)白色不產(chǎn)孢的煙曲霉毒力有所不同，可能與A2j生長(zhǎng)速率比較快有關(guān)。A1j和A2j毒力方面差異還有待進(jìn)一步研究。

既往研究表明侵襲性肺曲霉病組織病理學(xué)特征性的表現(xiàn)為在壞死肺組織區(qū)域菌絲呈45°角向肺實(shí)質(zhì)延伸[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，A1j和A2j組小鼠與模式菌株的Af293組小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)很相似：灶狀分布的聚集菌絲團(tuán)塊，伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

雖然A2j與已被發(fā)現(xiàn)的A1j形態(tài)學(xué)表現(xiàn)相似，但這種白色不產(chǎn)孢煙曲霉是否廣泛存在依舊未知。兩株不產(chǎn)孢的白色煙曲霉，毒力不同初步推測(cè)與其生長(zhǎng)速度有關(guān)，耐熱性不同與其耐熱相關(guān)基因有關(guān)，但都有待進(jìn)一步證實(shí)。因此，孢子抑制劑或者生長(zhǎng)速度抑制劑能否成為下一代曲霉病治療新方法有待研究。

[1] Hohl TM，F(xiàn)eldmesser M.Aspergillusfumigatus:principles of pathogenesis and host defense[J].Eukaryot Cell,2007,6(11):1953-1963.

[2] Scharf DH,Brakhage AA.Biosynthesis and function of gliotoxin inAspergillusfumigatus[J].Appl Microbiol Biotechno,2012,93(2):467-472.

[3] Knutsen AP，Stavin RG.Allergic bronchopulmonary aspergillosis in asthma and cystic fibrosis[J].Clin Dev Immunol,2011,2011(11):843763.

[4] Das Gupta M,Fliesser M,Springer J，et al.Aspergillusfumigatusinduces microRNA-132 in human monocytes and dendritic cells[J].Int J Med Microbiol，2014，304(5-6)：592-596.

[5] Balajee SA,Nickle D,Varga J，et al.Molecular studies reveal frequent misidentification ofAspergillusfumigatusby morphotyping[J].Eukaryot Cell,2006,5(10):1705-1712.

[6] Balajee SA,Gribskov J,Brandt M，et al.Mistakenidentity:Neosartorya pseudofischeri and its anamorph masquerading asAspergillusfumigatus[J].J Clin Microbiol,2005,43(12):5996-5999.

[7] Alastruey-Izquierdo A,Mellado E,Cuenca-Estrella M.Current section and species complex concepts inAspergillus:recommendations for routine daily practice[J].Ann N Y Acad Sci,2012,1273(1):18-24.

[8] Balajee SA,Houbraken J,Verweij PE，et al.Aspergillusspecies identification in the clinical setting[J].Stud Mycol,2007,59(59):39-46.

[9] Caiyun Zhang,Qingtao Kong,Zhendong Cai，et al.The newly nonsporulated characterization of anAspergillusfumigatusisolate from an immunocompetent patient and its clinic indication[J].Fungal Genetics and Biology,2015,81:250-260.

[10] Zhong G,Wei W,Guan Q,et al.Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase,as a suppressor of the sepH mutation inAspergillusnidulans,is required for theproper timing of septation[J].Mol Microbiol,2012,86(4):894-907.

[11] McFarland J.Nephelometer:an instrument for estimating the number ofbacteria in suspensions used for calculating the opsonic index and for vaccines[J].J Am Med Assoc,1907,49(14):1176-1178.

[12] Jiang H,Shen Y,Liu W,et al.Deletion of the putative stretch-activated ionchannel Mid1 is hypervirulent inAspergillusfumigatus[J].Fungal Genet.Biol,2014,62(1):62-70.

[13] Li P,Xu X,Cao E,et al.Vitamin D deficiency causes defective resistance toAspergillusfumigatusin mice via aggravated and sustained inflammation[J].PLoS ONE,2014,9(6):e99805.

[14] Alastruey-Izquierdo A,Mellado E,Cuenca-Estrella M.Current section and species complex concepts inAspergillus:recommendations for routine daily practice[J].Ann N Y Acad Sci,2012,1273(1):18-24.

[15] White TJ，Bums T，Lee S，et al.Amplification and direct sequencing of funsal ribosomal RNA genes for phylogeneties.PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications[J].San Diego:Academic Press，1990,19(1):315-322.

[16] Albrecht D，Guthke R，Brakhage AA,et al.Integrative analysis of the heat shock response inAspergillusfumigatus[J].BMC Genomics,2010,11(1):32.

[17] Mellado E,Aufauvre-Brown A,Gow NA,et al.TheAspergillusfumigatuschsC and chsG genes encode class III chitin synthases with different functions[J].Mol Microbiol,1996,20(3):667-669.

[18] Paisley D,Robson GD,Denning D.Correlation betweeninvitrogrowth rate andinvivovirulence inAspergillusfumigatus[J].Medical Mycology,2005,43(5):397-401.

[19] Kousha M,Tadi R,Soubani AO.Pulmonary aspergillosis:a clinical review[J].Eur Respir Rev,2011,20(121):156-174.

[本文編輯] 王 飛

Phenotypic characterization and virulence of two white nonsporulatingAspergillusfumigatusisolates

JIANG Yuan1,ZHANG Cai-yun1,WANG Feng-yuan1,KONG Qing-tao1,ZHANG Zheng1,ZENG Qiu-qiong1,LONG Nan-biao2,SANG Hong1

(1.DepartmentofDermatology，JinlingHospital,MedicalSchoolofNanjingUniversity,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion，PLA，Nanjing210002，China;2.JiangsuKeyLaboratoryforMicrobesandFunctionalGenomics,JiangsuEngineeringandTechnologyResearchCenterforMicrobiology,CollegeofLifeSciences,NanjingNormalUniversity,Nanjing210046,China)

Objective In this study,another white nonsporulatingA.fumigatusstrain (named asA2j) was compared with reported nonsporulating strainA1jin terms of morphology and virulence.MethodsA2jwas confirmed by DNA sequencing of internal transcribed spacer (ITS) regions and partialb-tubulin genes.We incubatedA1jandA2jthrough the slide culture method to compare them under a microscope.We observe the morphology ofA1jandA2jat different times or on various medium types.An immunosuppressed mice model was created to compare the virulence ofA1j,A2jand Af293.ResultsA2jwas accurately identified asA.fumigatusby ITS and β-tubulin sequencing.BothA1jandA2jshowed abnormal germination under the microscope compared to those of the reference strain Af293 by the slide culture method.Neither increased time nor different medium types could stimulate the formation of spores and pigment.A1jcannot grow andA2jcan grow at 50℃.A1jis hypovirulentin immunosuppressed mice model;however,A2jis virulent compared to the standard strain Af293.Conclusion The newlyA.fumigatusA2jandA1jhave significant differences in growth rate,thermotolerance and virulence.

Aspergillusfumigatus;Identification;Sporulation;Invasive aspergillosis model

69-73]

國(guó)家自然科學(xué)基金 (81330035,81371782)

姜媛，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:njujyuan@126.com

桑紅,E-mail:sanghong@nju.edu.cn

R 379.6

A

1673-3827(2017)12-0069-05

2017-02-06