微堿條件生物酶法提取大鯢肝臟油脂及其脂肪酸組成分析

胡代花

(1.陜西理工大學(xué) 維生素D生理與應(yīng)用研究所/大鯢研究所，陜西 漢中 723000； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

生物工程

微堿條件生物酶法提取大鯢肝臟油脂及其脂肪酸組成分析

胡代花1,2

(1.陜西理工大學(xué) 維生素D生理與應(yīng)用研究所/大鯢研究所，陜西 漢中 723000； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

以大鯢肝臟為原料，采用微堿條件生物酶法提取大鯢肝臟油脂。通過單因素試驗及正交試驗，研究了pH、料液比、加酶量、酶解時間、酶解溫度對提取率的影響，確定了大鯢肝臟油脂提取的最佳工藝參數(shù)，并用氣相色譜對其脂肪酸組成進(jìn)行分析。結(jié)果表明：大鯢肝臟油脂的最佳提取條件為酶解時間 3 h、堿性蛋白酶加酶量1 500 U/g、料液比1∶2、pH 7、酶解溫度30℃，在該工藝條件下大鯢肝臟油脂的提取率為81.67%；大鯢肝臟油脂中主要含12種脂肪酸，分別為C18∶1 24.51%、C16∶0 21.74%、C16∶1 13.02%、C18∶3(ω-6)12.61%、C18∶2 6.18%、C18∶3(ω-3)4.04%、C22∶6 3.51%、C22∶0 3.45%、C14∶0 2.97%、C20∶4 2.83%、C24∶0 2.65%、C18∶0 2.48%，其中飽和脂肪酸(SFA)占33.29%，不飽和脂肪酸(UFA)占66.70%，單不飽和脂肪酸(MUFA)占37.53%，多不飽和脂肪酸(PUFA)占29.17%，具有保健功能作用的ω-6型PUFA為21.62%，ω-3型PUFA為7.55%。研究表明大鯢肝臟具有較高的營養(yǎng)價值和脂質(zhì)開發(fā)潛力。

大鯢肝臟；油脂；生物酶法；堿性蛋白酶；脂肪酸組成

中國大鯢(Andriasdavidianus)是我國珍稀名貴特產(chǎn)，屬國家二類保護(hù)動物，具有極高的營養(yǎng)及藥用價值，被譽(yù)為“水中人參”[1-3]。為保護(hù)和利用大鯢資源，20世紀(jì)60年代以來大鯢的人工養(yǎng)殖取得重要進(jìn)展。隨著原生態(tài)、仿生態(tài)和全人工三大繁育模式技術(shù)的突破，全國大鯢繁殖與養(yǎng)殖總量約170萬尾[4]。資源量的增加也使大鯢產(chǎn)品的開發(fā)利用成為可能，養(yǎng)殖大鯢具有極大的市場前景和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)價值，目前已被開發(fā)為食品、保健食品、藥品及護(hù)膚品等多樣化產(chǎn)品[5-6]。大鯢油含有多種不飽和脂肪酸，是治療燙傷、燒傷的特效藥，大鯢油還具有預(yù)防心血管疾病的作用[7]。大鯢肝臟油脂豐富，楊紅生等[8]研究分析了大鯢肝臟中8種常見脂肪酸(C14∶0, C16∶0, C16∶1, C18∶0, C18∶1, C18∶2,C18∶3, C20∶4)的含量，劉紹等[9]測定了大鯢肝臟中3種必需脂肪酸(C18∶2, C18∶3, C20∶4)和DHA(C22∶6)的含量，但對大鯢肝臟油脂的提取條件優(yōu)化及脂肪酸組成分析尚未見系統(tǒng)報道。

傳統(tǒng)的油脂提取方法主要有蒸煮法、淡堿水解法等。其中蒸煮法會對油脂功能成分造成一定程度的破壞，而淡堿水解法產(chǎn)生的廢液中鈉鹽含量高，不能進(jìn)一步有效利用[10]。酶解法是利用蛋白酶對蛋白質(zhì)的水解作用，破壞蛋白質(zhì)和脂肪的結(jié)合關(guān)系，從而釋放出油脂。其條件溫和且酶解產(chǎn)物易于繼續(xù)利用，可提高原料附加值，已成為油脂提取工藝發(fā)展的新趨勢而得到較廣泛應(yīng)用[11-15]。

本文旨在采用微堿條件生物酶法提取大鯢肝臟油脂，通過單因素試驗和正交試驗對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并應(yīng)用氣相色譜對其脂肪酸組成進(jìn)行分析，期望能為大鯢肝臟的精深加工和高值化綜合利用提供一定理論基礎(chǔ)和現(xiàn)實依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

新鮮大鯢肝臟：由漢中龍鯢生物科技有限公司提供，將其用組織搗碎機(jī)勻漿處理，于-18℃凍藏，每次使用前取出放入 4℃冷藏箱過夜解凍，參照GB/T 5009.6—2003方法測定其粗脂肪含量為26.36%。37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品(47885 U)：美國Supelco 公司；堿性蛋白酶(活性≥200 000 U/g)：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氫氧化鈉、正己烷、甲醇、異丙醇等均為分析純：天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TYLD022組織搗碎機(jī)：九陽股份有限公司；RV10數(shù)顯型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司；BSA224SCW分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器(北京)公司；5810 R高速離心機(jī)：德國Eppendorf公司；1013A電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；GC-2010型氣相色譜儀：日本島津公司(GC Real Time Analysis色譜工作站，配備FID檢測器)；JOYNSXT06脂肪測定儀：上海喬躍電子有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大鯢肝臟油脂的制備

取一定量的大鯢肝臟經(jīng)解凍后，按一定的料液比加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至一定范圍，加入適量堿性蛋白酶，適宜溫度下酶解一定時間，趁熱離心分離肝臟油脂。油脂提取率=提取油脂質(zhì)量(g)/肝臟中粗脂肪質(zhì)量(g)×100%。

1.2.2 脂肪酸組成分析

樣品甲酯化：取3～4滴大鯢肝臟油脂，加入1 mL 2.5 mol/L的H2SO4-CH3OH溶液充分溶解，70℃充氮?dú)馑?0 min，再加入2 mL正己烷充分搖勻，靜置分層后，取上清液，重復(fù)加入2 mL正己烷充分搖勻，合并上清液，供氣相色譜分析。

色譜條件：InertCap-WAX 毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣量1 μL，分流比100∶1；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測器溫度250℃；載氣(氮?dú)?流速49.5 mL/min；輔助氣(氫氣)流速500 mL/min；升溫程序為120℃保持5 min，5℃/min 升溫至 215℃，保持38 min，整個分析過程62 min。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品平行測定3次，采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，單因素方差分析(ANOVE，Tukey’s檢驗)進(jìn)行顯著性檢驗，并采用Duncan’s法進(jìn)行單因素多重比較分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對大鯢肝臟油脂提取率的影響

在pH 7、加酶量300 U/g、酶解時間2 h、酶解溫度50℃ 的條件下，不同料液比(1∶0、1∶1、1∶2、1∶3)對大鯢肝臟油脂提取率的影響如圖1所示。

注：圖中標(biāo)記不同字母的兩項間具有顯著差異(P<0.05)，下同。

圖1 不同料液比對大鯢肝臟油脂提取率的影響

由圖1可知，料液比對大鯢肝臟油脂提取率有一定影響，油脂提取率隨著料液比的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)料液比為1∶2時，提取率最大，達(dá)41.32%±0.60%。繼續(xù)增加料液比至1∶3，提取率反而降低，為33.64%±0.77%，且與料液比為1∶2 時的提取率存在顯著差異(P<0.05)，而較高的料液比易造成溶劑和能源的浪費(fèi)。因此，確定大鯢肝臟油脂提取的料液比為1∶2。

2.1.2 pH對大鯢肝臟油脂提取率的影響

在料液比1∶2、加酶量300 U/g、酶解時間2 h、酶解溫度50℃的條件下，不同pH(6、7、8、9)對大鯢肝臟油脂提取率的影響如圖2所示。

圖2 不同pH對大鯢肝臟油脂提取率的影響

由圖2可知，pH對大鯢肝臟油脂提取率的影響較大，油脂提取率隨著pH的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)pH為7時提取率最大，達(dá)41.37%±0.76%。當(dāng)pH增至8和9時，提取率顯著降低，分別為26.12%±0.71%和22.36%±0.48%，且二者均與pH為7時的提取率差異顯著(P<0.05)。因此，確定大鯢肝臟油脂提取的pH為7。

2.1.3 加酶量對大鯢肝臟油脂提取率的影響

在料液比1∶2、pH 7、酶解時間2 h、酶解溫度50℃ 的條件下，不同加酶量(300、600、900、1 500 U/g)對大鯢肝臟油脂提取率的影響如圖3所示。

圖3 不同加酶量對大鯢肝臟油脂提取率的影響

由圖3可知，加酶量對大鯢肝臟油脂提取率的影響較大，當(dāng)加酶量為900 U/g時提取率最大，達(dá)70.76%±0.42%。當(dāng)繼續(xù)增加加酶量至1 500 U/g時，提取率反而降低，為59.84%±0.47%，且二者差異顯著(P<0.05)。因此，確定大鯢肝臟油脂提取的加酶量為900 U/g。

2.1.4 酶解溫度對大鯢肝臟油脂提取率的影響

在料液比1∶2、pH 7、加酶量900 U/g、酶解時間2 h的條件下，不同酶解溫度(30、40、50、60℃)對大鯢肝臟油脂提取率的影響如圖4所示。

圖4 不同酶解溫度對大鯢肝臟油脂提取率的影響

由圖4可知，酶解溫度對大鯢肝臟油脂提取率的影響較大，油脂提取率隨著酶解溫度的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)酶解溫度為40℃時提取率最大，達(dá)71.52%±0.51%。當(dāng)酶解溫度逐漸升至50℃和60℃時，提取率顯著降低，分別為63.58%±0.53%和60.01%±0.97%，且二者均與40℃時的提取率差異顯著(P<0.05)。因此，確定大鯢肝臟油脂提取的酶解溫度為40℃。

2.1.5 酶解時間對大鯢肝臟油脂提取率的影響

在料液比1∶2、pH 7、加酶量900 U/g、酶解溫度40℃的條件下，不同酶解時間(0.5、1、3、5 h)對大鯢肝臟油脂提取率的影響如圖5所示。

由圖5可知，酶解時間對大鯢肝臟油脂提取率的影響較大，油脂提取率隨著酶解時間的延長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)酶解時間為3 h時提取率最大，達(dá)65.81%±1.04%。當(dāng)繼續(xù)延長酶解時間至5 h時，提取率反而降低，為55.68%±0.53%，且與酶解時間為3 h時的提取率存在顯著差異(P<0.05)。因此，確定大鯢肝臟油脂提取的酶解時間為3 h。

圖5 不同酶解時間對大鯢肝臟油脂提取率的影響

2.2 正交試驗優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，固定料液比1∶2，選取酶解時間(A)、加酶量(B)、pH(C)和酶解溫度(D)作為考察因素，油脂提取率作為考察指標(biāo)，以四因素三水平進(jìn)行正交試驗對酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

表1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

由表1可以看出，各因素對大鯢肝臟油脂提取率的影響依次為: pH>酶解時間>加酶量>酶解溫度，即pH的影響最大，酶解時間和加酶量次之，酶 解溫度的影響最小。優(yōu)化試驗條件為A2B3C2D1，即酶解時間3 h，加酶量1 500 U/g，pH 7，酶解溫度30℃。對優(yōu)化條件進(jìn)行驗證試驗，提取率高達(dá)81.67%。

2.3 大鯢肝臟油脂的脂肪酸組成分析

將優(yōu)化條件下所提取的大鯢肝臟油脂經(jīng)甲酯化處理，采用氣相色譜法對其脂肪酸組成進(jìn)行分析，樣品氣相色譜圖見圖6；通過標(biāo)準(zhǔn)品對照和數(shù)據(jù)庫檢索對其脂肪酸組成進(jìn)行定性分析，并按峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析[16-18]，大鯢肝臟油脂脂肪酸組成及相對含量見表2。

圖6 大鯢肝臟油脂氣相色譜圖

峰號脂肪酸保留時間/min相對含量/%1十四碳酸C14∶015.02102.972十六碳酸C16∶019.26021.7439-十六碳烯酸C16∶119.79213.024十八碳酸C18∶023.12702.485油酸C18∶123.51124.516亞油酸C18∶2(ω-6)23.64206.187γ-亞麻酸C18∶3(ω-6)24.39012.618α-亞麻酸C18∶3(ω-3)25.73204.049二十碳四烯酸C20∶4(ω-6)30.75602.8310二十二碳酸C22∶033.17903.4511二十四碳酸C24∶043.73702.6512二十二碳六烯酸C22∶6(DHA)(ω-3)45.83003.51

由表2可以看出，大鯢肝臟油脂中主要含12種脂肪酸：C18∶1 24.51%、C16∶0 21.74%、C16∶1 13.02%、C18∶3(ω-6)12.61%、C18∶2 6.18%、C18∶3(ω-3) 4.04%、C22∶6 3.51%、C22∶0 3.45%、C14∶0 2.97%、C20∶4 2.83%、C24∶0 2.65%、C18∶0 2.48%。其中飽和脂肪酸(SFA)占33.29%，不飽和脂肪酸(UFA)占66.70%，單不飽和脂肪酸(MUFA)占37.53%，多不飽和脂肪酸(PUFA)占29.17%，具有保健功能作用的ω-6型PUFA為21.62%，ω-3型PUFA為7.55%。研究表明大鯢肝臟具有較高的營養(yǎng)價值和脂質(zhì)開發(fā)潛力。

3 結(jié) 論

(1)通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化得到微堿條件生物酶法提取大鯢肝臟油脂的最佳條件：料液比1∶2，酶解時間3 h，加酶量1 500 U/g，pH 7，酶解溫度30℃。在最佳提取條件下，大鯢肝臟油脂的提取率為81.67%。

(2)大鯢肝臟油脂中主要含12種脂肪酸，分別為C18∶1 24.51%、C16∶0 21.74%、C16∶1 13.02%、C18∶3(ω-6)12.61%、C18∶2 6.18%、C18∶3(ω-3) 4.04%、C22∶6 3.51%、C22∶0 3.45%、C14∶0 2.97%、C20∶4 2.83%、C24∶0 2.65%、C18∶0 2.48%，其中飽和脂肪酸(SFA)占33.29%，不飽和脂肪酸(UFA)占66.70%，單不飽和脂肪酸(MUFA)占37.53%，多不飽和脂肪酸(PUFA)占29.17%，具有保健功能作用的ω-6型PUFA為21.62%，ω-3型PUFA為7.55%。研究表明大鯢肝臟具有較高的營養(yǎng)價值和脂質(zhì)開發(fā)潛力。

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Extraction ofAndriasdavidianusliver oil by micro alkali enzymatic hydrolysis and analysis of its fatty acid composition

HU Daihua1,2

(1.Vitamin D Research Institute/Institute of Chinese Giant Salamander, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, Shaanxi, China; 2.College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, Shaanxi, China)

TheAndriasdavidianusliver oil was extracted by the method of micro alkali enzymatic hydrolysis fromAndriasdavidianusliver. The effects of pH, ratio of material to liquid, dosage of enzyme, enzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis temperature were discussed and the optimal parameters were obtained by single-factor experiment and orthogonal experiment. In addition, the fatty acid composition of the oil was analyzed by gas chromatography. The results indicated that the optimal extraction conditions ofAndriasdavidianusliver oil were obtained as follows: enzymatic hydrolysis time 3 h, dosage of alkaline protease 1 500 U/g, ratio of material to liquid 1∶2, pH 7 and enzymatic hydrolysis temperature 30℃. Under these conditions, the extraction rate was 81.67%. There were totally twelve kinds of fatty acids inAndriasdavidianusliver oil with their contents as follows: C18∶1 24.51%, C16∶0 21.74%, C16∶1 13.02%, C18∶3(ω-6) 12.61%, C18∶2 6.18%, C18∶3(ω-3) 4.04%, C22∶6 3.51%, C22∶0 3.45%, C14∶0 2.97%, C20∶4 2.83%, C24∶0 2.65%, C18∶0 2.48%. And there were 33.29% of saturated fatty acids (SFA), 66.70% of unsaturated fatty acids(UFA), 37.53% of monounsaturated fatty acids(MUFA), and 29.17% of polyunsaturated fatty acids(PUFA), and the contents ofω-6 PUFA andω-3 PUFA were 21.62% and 7.55% respectively. The research indicated that theAndriasdavidianusliver had a high nutritional valve and considerable potential for lipid exploitation.

Andriasdavidianusliver; oil; enzymatic hydrolysis; alkaline protease; fatty acid composition

2016-09-19；

2017-01-13

陜西理工大學(xué)博士后科研專項項目(SLGBH16-04)；陜西省自然科學(xué)基金項目(2014JQ2083)

胡代花(1983)，女，講師，博士，主要從事生物資源開發(fā)與應(yīng)用方面的研究工作(E-mail)hudaihua007@163.com。

TS225.2;TQ644.3

A

1003-7969(2017)04-0113-05