咖啡酸苯乙酯通過(guò)Nrf-2 途徑抑制地塞米松誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡

林 強(qiáng)，李洪偉，郭開(kāi)今，周 冰，李東亞

·論 著·

咖啡酸苯乙酯通過(guò)Nrf-2 途徑抑制地塞米松誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡

林 強(qiáng)1，李洪偉2，郭開(kāi)今2，周 冰2，李東亞2

目的 探討Nrf-2途徑在咖啡酸苯乙酯(CAPE)抑制地塞米松(DEX)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡中的作用。 方法 用細(xì)胞貼壁法培養(yǎng)小鼠顱頂前骨細(xì)胞(MC3T3-E1)，采用10 μmol/L DEX建立細(xì)胞損傷模型，以不同濃度CAPE(0.05、0.25、1 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞2 h后加入地塞米松共孵育24 h；細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；依據(jù)CCK-8檢測(cè)結(jié)果確定藥物濃度后將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、咖啡酸苯乙酯組(CAPE組)、地塞米松組(DEX組)，咖啡酸苯乙酯+地塞米松組(CAPE+DEX組)；DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species， ROS)水平；Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Caspase-3酶活性，Western blot法檢測(cè)Nrf-2 途徑相關(guān)蛋白Nrf-2和血紅素氧合酶1(heme oxygenase，HO-1)蛋白表達(dá)水平；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果 10 μmol/L DEX作用下細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，損傷作用明顯。與對(duì)照組相比，DEX組內(nèi)細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.01)，而細(xì)胞內(nèi) ROS水平、細(xì)胞凋亡率及Caspase-3酶活性顯著增加(P<0.01)；同時(shí)，Nrf-2途徑相關(guān)蛋白 Nrf-2及HO-1表達(dá)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與DEX組相比，CAPE+DEX組細(xì)胞存活率顯著上升(P<0.01)，Nrf-2途徑相關(guān)蛋白 Nrf-2及HO-1表達(dá)明顯增加(P<0.01)；此外，CAPE+DEX組細(xì)胞內(nèi) ROS 水平、細(xì)胞凋亡率及Caspase-3酶活顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 結(jié)論 咖啡酸苯乙酯可以通過(guò)Nrf-2途徑降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平進(jìn)而減輕地塞米松誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激所致細(xì)胞損傷及凋亡。

咖啡酸苯乙酯；地塞米松；成骨細(xì)胞；Nrf-2信號(hào)通路；細(xì)胞凋亡

糖皮質(zhì)激素在臨床上廣泛應(yīng)用于抗炎、免疫調(diào)節(jié)等方面的治療。然而長(zhǎng)期或大劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素帶來(lái)的糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid inducedoste oporosis，GIOP)成為治療過(guò)程中嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1-2]。近來(lái)的研究表明氧化應(yīng)激在GIOP的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，局部的氧化應(yīng)激可抑制成骨細(xì)胞活性并誘導(dǎo)其凋亡，然而其具體機(jī)制尚不明確[3-4]?；谝陨涎芯?，如何在發(fā)病早期減少成骨細(xì)胞的凋亡、控制局部氧化應(yīng)激、改善骨細(xì)胞內(nèi)部微環(huán)境，從而增強(qiáng)骨組織的修復(fù)能力、阻止病情的進(jìn)一步演變，成為治療激素性骨質(zhì)疏松癥的重要目標(biāo)?？Х人岜揭阴?caffeic acid phenethyl ester, CAPE)作為蜂膠成分中天然的生物活性成分，具有抗炎癥、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等獨(dú)特的生理藥理作用[5]。亦有研究表明咖啡酸苯乙酯能有效調(diào)節(jié)局部組織細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平、減少組織損傷[6]。但在地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞損傷過(guò)程中，咖啡酸苯乙酯是否通過(guò)抑制成骨細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激而發(fā)揮對(duì)其保護(hù)作用，仍有待進(jìn)一步研究。因此，本研究擬通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠MC3T3-E1型顱頂前骨細(xì)胞，觀察咖啡酸苯乙酯對(duì)地塞米松作用下成骨細(xì)胞凋亡的抑制作用，并探討其作用機(jī)制，為咖啡酸苯乙酯應(yīng)用于GIOP的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 MC3T3-El細(xì)胞株(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，上海)；咖啡酸苯乙酯(上海紫一試劑廠(chǎng))；地塞米松(美國(guó)Sigma)；α-MEM培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(杭州四季青)；細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(CCK-8)(日本同仁)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(江蘇碧云天)；兔抗小鼠Nrf-2抗體(美國(guó)CST)；兔抗小鼠血紅素氧合酶1(heme oxygenase，HO-1)抗體(美國(guó)Abcam)；堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(中杉金橋公司)；Tubulin-α rabbit Antibody(美國(guó)Bioworld)；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(江蘇碧云天)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基)；Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo)；流式細(xì)胞儀(Beeton-Dickinson)；Western blot電泳儀(Bio-Rad)；熒光顯微鏡(日本Nikon)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MC3T3-El細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%的CO2、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中孵育。隔日換液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)90%后，再經(jīng)不含EDTA的0.25%胰蛋白酶37 ℃常規(guī)消化，加入3 mL α-MEM培養(yǎng)基，反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度，傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組及處理：①空白對(duì)照組：正常培養(yǎng)，無(wú)特殊處理；②咖啡酸苯乙酯組(CAPE組)：細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)約70%左右，置于含CAPE(0.05、0.25、1、4 μmol/L)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；③地塞米松組(DEX組)：細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)約70%左右,置于含10μmol/L DEX培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；④咖啡酸苯乙酯+地塞米松組(CAPE+DEX組)：細(xì)胞以CAPE預(yù)處理2 h后加入10 μmol/L DEX培養(yǎng)基中共孵育24 h。

1.3 細(xì)胞存活率測(cè)定 采用細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)法(CCK-8)[7]。將細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板中培養(yǎng)。按前述分組處理細(xì)胞24 h后吸棄上清液，每孔加入含10%CCK-8的培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1.5 h；取含10%CCK-8的培養(yǎng)基100 μL加入沒(méi)有細(xì)胞含藥物孔作為陰性對(duì)照。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm的吸光度(OD)值。

存活率(%)= (實(shí)驗(yàn)組OD值-陰性對(duì)照組OD值)/

(對(duì)照組OD值-陰性對(duì)照組OD值)

×100%

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用Annexin V- FITC/ PI 法檢測(cè)[8]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-El細(xì)胞，接種于100 mm 培養(yǎng)板中。在含10%FBS的α-MEM 培養(yǎng)基中，按前述分組處理細(xì)胞24 h后用不含EDTA胰酶消化后收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞二次，2000 rpm離心5 min后收集5×105個(gè)/mL細(xì)胞，加入500 μL的緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL的碘化丙啶(propidium iodide)混勻，室溫、避光4 ℃ 孵育作用15 min后，用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 Caspase-3活性檢測(cè) 應(yīng)用Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Caspase-3酶活性。參照Liu等[9]實(shí)驗(yàn)方法，細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6孔板培養(yǎng)，按前述分組處理細(xì)胞24 h后PBS洗滌細(xì)胞二次(離心,2000 r/min，5 min)收集細(xì)胞。在收集的沉淀細(xì)胞中加入50 μL冷裂解緩沖液(lysis buffer)。冰上裂解30 min，其間渦旋振蕩3～4次，每次10 s，吸取上清用Braford法測(cè)定蛋白濃度。吸取50 μL的細(xì)胞裂解上清，加入2×反應(yīng)緩沖液(reaction buffer)，加入50 μL Caspase-3底物并于37 ℃避光孵育4 h。酶標(biāo)儀在X=405 nm定其吸光值。

1.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平檢測(cè) 應(yīng)用熒光探針二氯二氫熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平[10]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-El細(xì)胞，接種于100 mm培養(yǎng)皿中。在含10% FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基中，按前述分組處理細(xì)胞24 h后。用不含F(xiàn)BS的α-MEM培養(yǎng)基洗滌3次后，加入DCFH-DA工作液(100 μM的DCFH- DA)，37 ℃孵育30 min后，用不含F(xiàn)BS的α-MEM培養(yǎng)基洗滌3次后，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度并在400倍視野下隨機(jī)選擇3個(gè)視野進(jìn)行拍照。Image-Pro-Plus圖像分析軟件分析平均熒光強(qiáng)度。

1.7 Western blot法檢測(cè)Nrf-2 途徑相關(guān)蛋白 將細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6孔板培養(yǎng)，按前述分組處理細(xì)胞24 h后分別提取總蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，將各組配平成相同濃度后，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，進(jìn)行孵育抗體，以NBT/BCIP堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色，結(jié)果掃描[10]。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞損傷模型的建立 不同濃度DEX(0.01、0.1、1、10 μmol/L)作用24 h后，細(xì)胞的存活率分別為(93.468±20.211)%、(90.562±15.301)%、(73.188±17.309)%、(58.361±10.208)%，細(xì)胞存活率較對(duì)照組下降(6.532±20.886)%、(9.438±17.382)%、(26.813±17.371)%、(41.638±19.708)%。與對(duì)照組比較，10 μmol/L DEX處理后的MC3T3-El細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.01)，見(jiàn)圖1。倒置相差顯微鏡下對(duì)照組內(nèi)MC3T3-E1細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈“鋪路石”樣排列，見(jiàn)圖2a；加入10 μmol/L DEX后，貼壁MC3T3-E1細(xì)胞減少，細(xì)胞回縮、變亮變圓，細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)減少，細(xì)胞間隙增大，部分細(xì)胞結(jié)團(tuán)、脫落，溶解為黑色點(diǎn)狀物，細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的形態(tài)學(xué)損傷，見(jiàn)圖2b。因此，選用10 μmol/L DEX建立細(xì)胞損傷模型。

1:對(duì)照組；2-5分別為：0.01、0.1、1、10 μmol/L地塞米松濃度 與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖1 不同濃度地塞米松處理MC3T3-E1細(xì)胞24 h后細(xì)胞存活率

a:對(duì)照組；b：地塞米松組 圖示加入10 μmol/L地塞米松后，細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的形態(tài)學(xué)損傷

圖2 10 μmol/L地塞米松對(duì)MC3T3-El細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)

2.2 CCK-8檢測(cè)結(jié)果 不同濃度CAPE(0.05、0.25、1、4 μmol/L)作用24 h后，細(xì)胞的存活率分別為(91.715±8.399)%、(91.757±6.445)%、(88.273±8.420)%、(76.248±6.420)%，較對(duì)照組下降(8.328±10.527)%、(8.286±9.740)%、(11.770±8.420)%、(23.794±8.022)%。CAPE濃度在0～1 μmol/L對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響(P>0.05)，見(jiàn)圖3。因此，應(yīng)用不同濃度的CAPE(0、0.05、0.25、1 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞2 h后與10 μmol/L DEX共同作用24 h后，細(xì)胞存活率分別為(30.985±4.775)%、(56.816±7.047)%、(67.068±3.702)%、(62.600±4.909)%，細(xì)胞存活率較DEX組分別增加(25.831±11.664)%、(36.083±4.170)%、(31.615±7.560)%。0.25 μmol/L CAPE細(xì)胞存活率較DEX組顯著增加(P<0.01)，且1 μmol/L濃度CAPE對(duì)于損傷后細(xì)胞存活率無(wú)進(jìn)一步改善作用，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用CAPE的濃度為0.25 μmol/L，見(jiàn)圖4。

1：對(duì)照組；2-5分別為：0.05、0.25、1、4 μmol/L咖啡酸苯乙酯濃度 與對(duì)照組比較，*P<0.01

圖3 不同濃度咖啡酸苯乙酯處理MC3T3-E1細(xì)胞24 h后細(xì)胞存活率

1：對(duì)照組；2：DEX組(10 μmol/L DEX);3-5分別為:0.05、0.25、1 μmol/L CAPE處理2 h后與10 μmol/L DEX作用組 與對(duì)照組比較，#P<0.01；與DEX組比較,*P<0.01

圖4 不同濃度CAPE處理對(duì)DEX(10 μmol/L)作用下細(xì)胞存活率的影響

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果 Annexin V和PI染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DEX組(10 μmol/L)細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，而CAPE+DEX組較DEX組細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.01)。見(jiàn)圖5、圖6。

2.4 不同處理組MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ROS水平 10 μmol/L DEX作用24 h后，在熒光顯微鏡下觀察DEX組細(xì)胞內(nèi)ROS平均熒光強(qiáng)度較對(duì)照組顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；加入0.25 μmol/L CAPE預(yù)處理細(xì)胞2 h后與DEX共同孵育24 h，熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)ROS平均熒光強(qiáng)度較DEX組顯著減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖7。

圖5 0.25 μmol/L CAPE對(duì)10 μmol/L DEX誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，*P<0.01；與DEX組比較，#P<0.01

圖6 各組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率

2.5 不同處理組MC3T3-E1細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá) CAPE組與對(duì)照組的Nrf-2、HO-1表達(dá)未見(jiàn)明顯差異，加入10 μmol/L DEX后Nrf-2、HO-1表達(dá)明顯減少(P<0.01)；0.25 μmol/L CAPE預(yù)處理2 h后與DEX共同孵育24 h，Nrf-2及HO-1蛋白表達(dá)量較DEX組增加(P<0.01)，見(jiàn)圖8。

2.6 不同處理組MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)Caspase-3酶活性 DEX作用24 h后Caspase-3酶活性顯著增強(qiáng)，加入0.25 μmol/L CAPE預(yù)處理2 h后與DEX共同孵育24 h，Caspase-3酶活性較DEX組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖9。

a：熒光顯微鏡下各組MC3T3-E1細(xì)胞中ROS熒光強(qiáng)度(熒光顯微鏡 ×400)；b：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與DEX組比較，#P<0.01圖7 各組MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)ROS水平

a:Western blot 檢測(cè)；b：Nrf-2及HO-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較，*P<0.01；與DEX組比較，#P<0.01圖8 各組MC3T3-E1細(xì)胞中Nrf-2及HO-1表達(dá)(Western blot)

與對(duì)照組比較，*P<0.01；與DEX組比較，#P<0.01

圖9 各組MC3T3-E1細(xì)胞中Caspase-3酶活力

3 討 論

近年來(lái)，隨著對(duì)GIOP研究的深入，細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、骨膠原代謝異常等均在其中發(fā)揮著一定的作用，但尚無(wú)完整理論來(lái)闡述這一過(guò)程[11]。目前的觀點(diǎn)認(rèn)為糖皮質(zhì)激素的直接作用在發(fā)病初始發(fā)揮著關(guān)鍵作用。大量研究表明糖皮質(zhì)激素不僅抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化，還可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡引起骨修復(fù)功能障礙、骨強(qiáng)度下降，最終致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[12]。在本實(shí)驗(yàn)研究中CCK-8結(jié)果顯示MC3T3-E1細(xì)胞活性隨著DEX濃度增加而降低且呈濃度依賴(lài)性；此外，流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示在10 μmol/L DEX培養(yǎng)24 h后,與對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡率顯著增加。

Caspase家族作為細(xì)胞凋亡過(guò)程中的參與者與介導(dǎo)者，發(fā)揮著重要的作用，其中又以Caspase-3最為重要，在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能[13]。正常情況下，Caspase-3以無(wú)活性的酶原形式存在于胞質(zhì)中，在凋亡的早期階段被活化為由兩個(gè)大亞基(17 kD)和兩個(gè)小亞基(12 kD)組成的復(fù)合物，其中17 kD的活化片段被認(rèn)為是凋亡程序的執(zhí)行蛋白，裂解相應(yīng)的底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此，活化的Caspase-3片段被認(rèn)為是凋亡發(fā)生的標(biāo)志[14]。本實(shí)驗(yàn)中MC3T3-E1細(xì)胞在加入地塞米松后Caspase-3酶活性增加且細(xì)胞凋亡率升高，表明地塞米松可以通過(guò)激活Caspase-3啟動(dòng)其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程從而促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡。應(yīng)用CAPE后，DEX上調(diào)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率及Caspase-3活性顯著下降，表明CAPE可減輕地塞米松誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞損傷及細(xì)胞凋亡。

ROS是生物體內(nèi)有氧代謝產(chǎn)生的含氧自由基，主要包括超氧陰離子(O2-)、羥基(OH-)和過(guò)氧化氫(H2O2)等[15]。正常情況下，ROS有助于維持機(jī)體的正常生理功能，然而過(guò)量的ROS可作為第2信使，促進(jìn)線(xiàn)粒體Ca2+內(nèi)流、線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的開(kāi)放、Caspase的激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，異常增多的ROS能夠通過(guò)促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化、減少抗氧化物酶、促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡等途徑加速骨量丟失[16-17]。本實(shí)驗(yàn)研究在進(jìn)行細(xì)胞損傷指標(biāo)檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：在加入10 μmol/L DEX作用MC3T3-E1細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)氧化型二氯熒光素(DCF)的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高；在此過(guò)程中，細(xì)胞凋亡率顯著升高；然而，在加入CAPE后，上述指標(biāo)呈現(xiàn)回降現(xiàn)象，可見(jiàn)CAPE通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積，減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，從而減輕地塞米松誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

目前認(rèn)為Nrf-2是調(diào)控細(xì)胞外源性刺激因子和氧化損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在參與細(xì)胞抗氧化應(yīng)激和外源性有毒物質(zhì)誘導(dǎo)的主要防御機(jī)制中發(fā)揮重要的作用[18-19]。靜息狀態(tài)下，Nrf-2在胞漿中處于一種非活性狀態(tài)，當(dāng)處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，Nrf-2轉(zhuǎn)移入核內(nèi)，與基因中的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)下游Ⅱ相代謝酶基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，以增加細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗作用，使細(xì)胞免于凋亡[20]。在被Nrf2激活的眾多的抗氧化酶中，HO-1具有較好的抗氧化能力、抑制細(xì)胞凋亡的作用。亦有研究發(fā)現(xiàn)在治療激素誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡過(guò)程中，沉默Nrf-2基因后抗氧化基因表達(dá)明顯降低，而氧化應(yīng)激損傷明顯增強(qiáng)，提示Nrf-2通路在調(diào)節(jié)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)紊亂中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明DEX顯著降低細(xì)胞內(nèi)Nrf-2和HO-1蛋白表達(dá)水平；而應(yīng)用CAPE后，細(xì)胞內(nèi)Nrf-2和HO-1蛋白表達(dá)量均增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明CAPE可激活細(xì)胞內(nèi)Nrf-2途徑并增加Ⅱ相代謝酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力。

綜上所述，咖啡酸苯乙酯通過(guò)增強(qiáng)MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)Nrf-2途徑內(nèi)抗氧化蛋白的表達(dá)水平，清除細(xì)胞內(nèi)異常增多的ROS，從而遏制了Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路的啟動(dòng)，減輕地塞米松誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷及凋亡。同時(shí)，為咖啡酸苯乙酯進(jìn)一步應(yīng)用于激素性骨質(zhì)疏松癥的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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(本文編輯:葉華珍； 英文編輯：王建東)

Caffeic acid phenethyl ester inhibits the apoptosis induced by dexamethasone via the regulation of Nrf-2 pathway in osteoblasts

LIN Qiang1, LI Hong-wei2,GUO Kai-jin2,ZHOU Bing2, LI Dong-ya2

(1.GraduateSchool,XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221004,Jiangsu,China; 2.DepartmentofOrthopedics,theAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221002,Jiangsu,China)

Objective To explore the effect of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on the apoptosis of MC3T3-E1 preosteoblasts induced by dexamethasone (DEX). Methods MC3T3-E1 cells were exposed to DEX (10 μmol/L) to establish a model of osteoblast injury. The incubated MC3T3-E1 cells were pretreated with various concentrations of CAPE for 2 hours, and then cultured in combination with 10 μmol/L DEX for 24 hours. Cell proliferation was evaluated by cell count kit (CCK-8). The final concentration of drug was determined by the results of CCK-8, then cells randomly divided into four groups: Control group, CAPE group, DEX group, and CAPE+DEX group. Cell apoptosis rate was detected by Annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry in each group. Caspase-3 activity was monitored by Caspase-3 activity assay kit; Intracelluar ROS was detected by DCFH-DA fluorescence staining．The expressions of Nrf-2 and HO-1 were examined by Western blot. Results Dexamethasone could induced MC3T3-E1 cell injury with overt morphological and cell activity changes at 24 hours, especially the 10 μmol/L DEX. Compared with control group, and the cell activi- ty was decreased significantly (P<0.01), while the level of intracellular ROS, cell apoptosis rate and Caspase-3 activity increased significantly (P<0.01). Moreover, the Nrf-2 and HO-1 was decreased significantly (P<0.01). Compare with DEX group, expression of Nrf-2 and HO-1 (P<0.01vsDEX group) in CAPE+DEX group were significantly increased (P<0.01). In addition, the levels of ROS, apoptosis and Caspase-3 activity were significantly lower in the CAPE+DEX group (P<0.01). Conclusion CAPE inhibits the level of ROS in osteoblasts via regulating Nrf-2 pathway, resulting in the reduction of apoptosis induced by dexamethasone.

Caffeic acid phenethyl ester; Dexamethasone; Osteoblast cell; Nrf-2 pathway; Apoptosis

徐州市科學(xué)技術(shù)局項(xiàng)目(KCl4SHl02)

1.221004徐州，徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院； 2. 221002徐州，徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科

李洪偉，E-mail：lihongwei2000@126.com

林 強(qiáng)，李洪偉，郭開(kāi)今，等.咖啡酸苯乙酯通過(guò)Nrf-2 途徑抑制地塞米松誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡[J].東南國(guó)防醫(yī)藥，2017,19(2):126-131.

R681

A

1672-271X(2017)02-0126-06

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.02.004

2016-11-05;

2017-02-15)