圍絕經(jīng)期大鼠外周血調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的改變及縫隙連接蛋白40的表達

付睿婷 ，彭珉 ，馬克濤 ，李麗 ，司軍強

（1石河子大學醫(yī)學院生理學教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆 石河子832002；2石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，新疆 石河子 832000）

圍絕經(jīng)期是指圍繞絕經(jīng)的一段時期，包括從接近絕經(jīng)出現(xiàn)與絕經(jīng)有關的內(nèi)分泌、生物學和臨床特征起至最后一次月經(jīng)后一年內(nèi)的時期，由于性激素水平變化（雌激素E減少）可能出現(xiàn)以植物神經(jīng)功能紊亂、代謝障礙為主的一系列軀體及精神心理癥狀[1]，并且會出現(xiàn)免疫系統(tǒng)功能逐漸衰退的現(xiàn)象[2]。近年研究提示，女性雌激素水平與免疫調(diào)節(jié)密切相關，不同劑量的雌激素水平可引起不同的免疫應答[3]，既往相關研究多是圍繞研究圍生期女性較多，對于圍絕經(jīng)期女性的相關研究較少。隨著我國進入老齡化社會，逐步步入圍絕經(jīng)期的女性越來越多，對身體素質(zhì)、生活質(zhì)量提高的要求也越來越廣泛而迫切，故而內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)日益受到重視。因為雌激素是具有廣泛調(diào)節(jié)作用激素之一，與免疫系統(tǒng)、感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等的發(fā)生率等都密切相關，所以頗受注目。絕經(jīng)婦女雌激素水平下降，對T淋巴細胞亞群的相對和絕對數(shù)量有一定的影響[4-5]，這一過程是通過性激素受體途徑把相關信息傳遞給免疫系統(tǒng)來改變外周血T淋巴細胞亞群[6]。Holl在對絕經(jīng)后婦女細胞免疫的研究中發(fā)現(xiàn)，使用激素替代治療(HRT)后CD8+細胞明顯減少，CD4+/CD8+的值增高[7]；McMurray等的研究發(fā)現(xiàn)E可抑制活化的外周血T細胞和CD4+T細胞系IL-2在轉(zhuǎn)錄水平的表達[8]；研究結(jié)果顯示，圍絕經(jīng)期綜合征患者的血清IL－1β、IL－6、TNF-α 濃度明顯高于對照組[9]，這些研究說明隨著圍絕經(jīng)期綜合征的發(fā)生伴有免疫細胞激活[3,10]。雌激素對免疫功能的調(diào)節(jié)作用已經(jīng)成為婦科內(nèi)分泌學的研究熱點。

縫隙連接作為相鄰細胞間物質(zhì)交換的直接通路，其組成的基本單位是連接蛋白。近年研究表明，縫隙連接蛋白在外周血T、B及自然殺傷(natural killer，NK)細胞中也表達[10]。外周血T淋巴細胞亞群是反應機體細胞免疫功能的重要指標，其中CD4+T細胞和CD8+T細胞是T淋巴細胞的主要亞群。Cx40介導縫隙連接參與免疫系統(tǒng)細胞間細胞通訊[11,12]及免疫炎癥應答。當免疫細胞受到炎癥因子的刺激，Cx40表達上調(diào)[13-14]。因此，縫隙連接可能參與圍絕經(jīng)期婦女的免疫炎癥應答及免疫系統(tǒng)細胞間通訊。但有關T淋巴細胞間Cx40的表達與圍絕經(jīng)期婦女免疫的研究尚不清楚。因此，本實驗將以SD雌鼠圍絕經(jīng)模型為研究對象，應用流式細胞術和ELISA技術，旨在研究在圍絕經(jīng)狀態(tài)下外周血T淋巴細胞間縫隙連接蛋白Cx40的表達和炎癥因子的分泌變化并探討其相應機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

實驗動物 取16周齡雌性SD大鼠18只，SPF級，體重200～300 g(新疆自治區(qū)疾病控制中心提供，許可證編號SCXK 新 2011-0001)。適應性飼養(yǎng)1周后進入正式實驗，動物房室內(nèi)溫度和濕度分別控制在20℃和50%左右。各組大鼠分籠喂，給予標準飼料，自由進食水，環(huán)境安靜。所有實驗在符合動物實驗倫理要求下進行。

實驗試劑 異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的小鼠抗大鼠CD3抗體(CD3-FITC)、FITC標記的IgG1同型對照、別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)標記的小鼠抗大鼠CD4抗體(CD4-APC)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標記小鼠抗大鼠CD8a(CD8a-PE)、PE標記的小鼠抗大鼠CD4抗體(CD4-PE)、PE標記的IgG1同型對照、PE標記的IgG2a同型。對照均購自BioLegend公司，兔抗大鼠Cx40抗體購自SantaCruz公司，F(xiàn)ITC標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物科技有限公司，大鼠IL-1、IL-2、IL-6 ELISA試劑盒均購自杭州聯(lián)科生物有限責任公司，紅細胞裂解液購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。4℃高速離心機為安徽中科中佳科學儀器有限公司產(chǎn)品；流式細胞儀為深圳邁瑞公司產(chǎn)品；

1.2 圍絕經(jīng)大鼠模型的制備

女性雌激素90%由卵巢分泌，摘除卵巢，切斷其來源，可人為地造成雌激素突然降低的環(huán)境，來模擬圍絕經(jīng)期綜合征。隨機取SD雌性大鼠9只，麻醉后取最末肋骨下、腋中線和距脊柱外側(cè)約2 cm交叉處，剪除長毛，切開皮膚和背肌約1.5 cm，將卵巢用絲線結(jié)扎，摘除卵巢。術后5 d起，對動物進行陰道涂片檢查，1次/d，連續(xù) 5 d，以不出現(xiàn)動情期反應為造模成功。

1.3 方法

1.3.1 T淋巴細胞亞群和Cx40檢測

大鼠麻醉狀態(tài)下，采集腹主動脈外周血，置10 g/L EDTA真空采血管內(nèi)。取100 μL新鮮外周血，洗滌2000 r/min離心5 min，棄上清；100 μL PBS重懸細胞，分別加入相應流式抗體(CD3-FITC，F(xiàn)ITC同型對照；CD4-APC，APC 同型對照；CD8-PE，PE 同型對照；兔抗大鼠Cx40抗體和FITC標記的山羊抗兔IgG，F(xiàn)ITC同型對照)1 μL，并設立陰性對照。室溫避光孵育30 min，加入2 mL紅細胞裂解液裂解紅細胞，室溫避光孵育10 min；加入PBS 2 mL稀釋，1000 r/min離心5 min，棄上清；PBS重懸細胞至終體積為250 μL，上機使用CELLQuest軟件進行檢測。

1.3.2 炎癥因子檢測

采集大鼠內(nèi)眥動脈外周血2 mL于EDTA抗凝管中，2000 r/min離心5 min，取血漿層于-80℃保存。采用ELISA檢測IL-1、IL-2和IL-6的水平。操作步驟按照說明書操作。

1.3.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±S表示。兩組間比較方差齊性者采用兩樣本均數(shù)t檢驗，方差非齊性者采用近似t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組大鼠和OVX組大鼠外周血中T淋巴細胞亞群的表達

流式細胞術檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，OVX組大鼠外周血中CD3+和CD4+T淋巴細胞分別下降13.24%和 22.5%（P<0.05），CD8+T淋巴細胞比例上升29.8%（P<0.05），CD4+/CD8+降低（P<0.01）(表 1)。

表1 對照組大鼠和OVX組大鼠外周血中T淋巴細胞亞群的表達 ±S，n=9Tab.1 Expression of T lymphocyte subsets in peripheral blood of control group SD rats and Ovx group SD rats

表1 對照組大鼠和OVX組大鼠外周血中T淋巴細胞亞群的表達 ±S，n=9Tab.1 Expression of T lymphocyte subsets in peripheral blood of control group SD rats and Ovx group SD rats

注：*P<0.05，OVX 組 vs對照組。**P<0.01，OVX 組 vs對照組。

??? ????????? ????? ?? ??

2.2 對照組大鼠和OVX組大鼠外周血中T淋巴細胞亞群Cx40的表達

流式細胞術檢測結(jié)果顯示，Cx40在OVX組CD4+T淋巴細胞的表達高于對照組（6.54%±1.75%vs 4.01%±2.51%，P<0.05），Cx40在 OVX組CD8+T淋巴細胞的表達高于對照組（18.3%±5.53%vs 8.05%±4.17%，P<0.01）（圖 1）。

圖1 兩組大鼠外周血T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+上CX40的表達頻率 n=9Fig.1 Expression of Cx40 in the CD4+and CD8+T lymphocytes in peripheral blood of the two groups

2.3 對照組和OVX組大鼠外周血中IL-1β、IL-2、IL-6表達水平

檢測結(jié)果顯示，OVX組與對照組相比，IL-2水平下降（P<0.05），IL-6水平升高（P<0.01）IL-1β 的差異無統(tǒng)計學意義（表2）。

表2 對照組和OVX組SD大鼠外周血中IL-1β、IL-2、IL-6表達水平比較 X±S，n=9Tab.2 Comparison of IL-1β，IL-2 and IL-6 levels in peripheral blood of control and OVX group

3 討論

圍絕經(jīng)期由于卵巢分泌雌激素減少導致全身各系統(tǒng)和器官的組織結(jié)構(gòu)及功能影響，免疫應答受損害，機體應對各種壓力因素的能力全面降低和伴隨的促炎狀態(tài)的逐步增加，此時期可被稱為“炎癥性衰老”[15]，此時期伴隨著機體慢性雌激素缺乏及慢性炎癥。圍絕經(jīng)期免疫系統(tǒng)的衰老比較典型的反映了機體的老化過程[16]，免疫衰老過程同時影響到先天免疫系統(tǒng)和后期適應性免疫系統(tǒng)[17-18]。年齡較大的人群常常被觀察到T細胞減少，胸腺原始T細胞的衰竭消耗[19]，B細胞下降，反映體液免疫有缺陷[20]，以及慢性炎癥[21]。因此，年齡較大的受試者對感染不易免疫，受感染后的機體反應比年輕人大[22]，比年輕人更容易受到病毒和細菌感染，機會性感染，潛伏病毒，自身免疫疾病等的影響[23-24]。

外周血T淋巴細胞亞群是反應機體細胞免疫功能的重要指標，且T細胞增殖能力的明顯降低是老齡化的重要標志之一。Ferguson[25]提出老年人的T細胞增殖潛能較年輕人低是與其對病原體抵抗力低相關。CD4+T細胞和CD8+T細胞作為主要的兩個細胞亞群，相互協(xié)調(diào)，相互制約，共同參與維持免疫系統(tǒng)的平衡。正常的CD4+/CD8+T細胞比值約為1.5～2.0。若T細胞總數(shù)或CD4+/CD8+T細胞比值發(fā)生改變，即可視為免疫調(diào)節(jié)功能異常[26]。國外很多學者采用去卵巢大鼠模型來模擬圍絕經(jīng)期的發(fā)生來進行相關試驗的研究，前人研究結(jié)果顯示，去卵巢大鼠 T淋巴細胞免疫功能衰退，導致CD3+、CD4+減少CD8+增加[27]。Huppert等[28]報道隨增齡外周血所有的淋巴細胞亞群的均值均趨于降低，并具有明顯的性別差異，女性比男性的值要低。本研究中發(fā)現(xiàn)OVX組大鼠外周血中CD4+T淋巴細胞比例較對照組顯著降低，CD8+T淋巴細胞比例顯著升高，CD4+/CD8+比值明顯降低，進一步說明雌激素降低后出現(xiàn)機體免疫系統(tǒng)的紊亂。

細胞因子是具有高效性、多向性、內(nèi)生性的小分子多肽，主要參與調(diào)節(jié)機體的免疫應答、造血功能和炎癥反應等。白細胞介素是細胞因子的一種。研究發(fā)現(xiàn)退變的椎間盤組織能夠產(chǎn)生大量的炎癥因子，其中 IL-1β是一種能導致炎癥反應及細胞凋亡的多效性細胞因子，在椎間盤細胞凋亡中起重要作用，17β-雌二醇可有效抑制 IL-1β誘導的大鼠纖維環(huán)細胞凋亡，并且這種作用具有濃度依賴性[29]。本研究中OVX組IL-1β水平與對照組相比升高，但無統(tǒng)計學意義，這可能和檢測手段不同而有所差異。Mc Murray RW等[8]動物實驗發(fā)現(xiàn)，長期低劑量的（絕經(jīng)后濃度）E2能抑制外周血活化的T細胞生成IL-2和IL-2R。有動物實驗顯示生理濃度的E2可下調(diào)血清中IL-6；而人卵巢切除術后或自然絕經(jīng)后，外周血及骨髓中單核細胞產(chǎn)生的IL-6增多，E2治療能降低IL-6的產(chǎn)生[22]。本研究結(jié)果顯示，OVX組大鼠與Control組相比血清IL-2水平下降，IL-6水平升高，說明圍絕經(jīng)期雌鼠性激素失調(diào)可影響免疫系統(tǒng)，導致促炎因子釋放增加，雌激素下降促使單核細胞增生導致血液IL-2減少而IL-6增多，這與凌晨等的研究結(jié)果相一致[30]。

近年來發(fā)現(xiàn)炎癥環(huán)境下淋巴細胞亞群的變化與縫隙連接蛋白的表達有關?？p隙連接是細胞表面小于1kDa的小分子和離子在細胞間直接轉(zhuǎn)運的專門的通道。每個細胞間通道單元是由一對在協(xié)同細胞間相互作用的半通道構(gòu)成的?？p隙連接蛋白除了分化的骨骼肌、紅細胞和成熟的精子細胞，幾乎在所有組織中都有表達。在淋巴細胞上主要表達Cx43，而主要在來自次級淋巴器官的淋巴細胞上表達Cx40[18]。有研究結(jié)果確定縫隙連接蛋白是調(diào)節(jié)免疫過程的重要細胞表面成分[31]。前期我們研究發(fā)現(xiàn)應用特異性的縫隙連接阻斷劑Gap27能夠顯著抑制T淋巴細胞釋放炎癥因子，提示縫隙連接在T淋巴細胞介到的炎癥反應中發(fā)揮了重要的作用[32]。用植物血細胞凝集素（PHA43）和脂多糖（LPS）炎性條件下分別刺激T和B淋巴細胞可增加其CX40及CX43蛋白的表達[33]。

不僅是炎癥因子對縫隙連接蛋白的表達有影響作用，大量研究表明雌激素也參與縫隙連接蛋白的表達。在前人的研究中，發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后大鼠心臟傳導阻滯，結(jié)果顯示絕經(jīng)后大鼠心肌間隙連接受損，而連接蛋白 43（Cx43）表達減少，在卵巢切除后的（OVX）大鼠上也觀察到這種現(xiàn)象，其可以通過E2補充來改善這一情況[34]。有研究表明，使用給予7天齡的新生雄性大鼠皮下注射雌二醇苯甲酸酯（EB），在4個月齡時通過定量實時PCR檢測附睪中Cx亞型的表達變化，發(fā)現(xiàn)低劑量 EB的治療導致 Cx32，Cx37和Cx45轉(zhuǎn)錄水平升高，而高劑量EB的治療則降低了Cx26，Cx30.3，Cx31，Cx31.1，Cx32，Cx40，Cx43 和 Cx45的表達[35]。說明縫隙連接蛋白40的表達受機體雌激素水平高低的影響。在本研究中，發(fā)現(xiàn)OVX組CD4+，CD8+淋巴細胞亞群所表達的Cx40較 Control組均升高，進一步說明了機體處于低雌激素情況下，縫隙連接蛋白40的表達發(fā)生改變。

通過本研究我們發(fā)現(xiàn)，圍絕經(jīng)期大鼠由于雌激素降低，機體處于慢性炎癥環(huán)境，免疫紊亂，T淋巴細胞亞群比例下降，縫隙連接蛋白40在外周血CD4+、CD8+上的表達升高，說明縫隙連接蛋白的表達與雌激素水平高低密切相關，并且有可能參與圍絕經(jīng)期免疫應答過程。

參考文獻:

[1] Dennerstein L，Dudley E C，Hopper J L，et al.A prospective population-based study of menopausal symptoms[J].Obstetrics&Gynecology，2000，96(3):351-358.

[2] Grossman C J，Roselle G A，Mendenhall C L.Sex steroid regulation of autoimmunity[J].Journal of Steroid Biochemistry&Molecular Biology，1991，40(4):649-659.

[3] Deveale B，Brummel T，Seroude L.Immunity and aging:the enemy within?[J].Aging Cell，2004，3(4):195-208.

[4] Keller E T，Zhang J，Yao Z，et al.The impact of chronic estrogen deprivation on immunologic parameters in the ovariectomized rhesus monkey(Macaca mulatta)model of menopause.[J].Journal of Reproductive Immunology，2001，50(1):41-55.

[5] Paavonen T，Andersson L C，Adlercreutz H.Sex hormone regulation of in vitro immune response.Estradiol enhances human B cell maturation via inhibition of suppressor T cells in pokeweed mitogen-stimulated cultures[J].Journal of Experimental Medicine，1981，154(6):1935.

[6] Huang J，Li X，Yi P，et al.Targeting estrogen responsive elements(EREs):design of potent transactivators for ERE-co ntaining genes[J].Molecular&Cellular Endocrinology,2004,218(12):65-78.

[7] Ho P C.Lymphocyte subsets and serumimmunog-lobulins in pati ents with premature ovarian failure before and after oestrogen replace ment[J].Hum Reprod，1993，8(5):714-717.

[8] McMurray R W，Ndebele K，Hardy K J，et al.17-beta-estradiolsuppressesIL-2 and IL-2 receptor[J].Cytokine，2001，14(6):324-333.

[9] 劉輝.圍絕經(jīng)期綜合征患者血清細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達和臨床意義[J].中國婦幼保健，2013，28(15):2462-2463.Liu Hui.Expression and clinicalsignificance ofserum cytokines IL-1β,IL-6 and TNF-α in patients with perimenopausal syndrome[J].Maternal and Child Health Care of China,2013,28(15):2462-2463.

[10]Stimson W H.Estrogen and human T lymphocytes presence of specific receptors in the T suppress or cytotoxic subset[J].Scand J Immunol，1988，28:345-350.

[11] Scheckenbach K E L，Crespin S，Kwak B R，et al.Connexin Channel-Dependent Signaling Pathways in Inflammation[J].Journal of Vascular Research，2011，48(2):91-103.

[12] Mendoza-Naranjo A,Bouma G,Pereda F,et al.Functional gap junctions accumulate at the immunological synapse and contribute to T cell activation.[J].Journal of Immunology，2011，187(6):3121.

[13] Oviedo Orta E，Perreau M，Evans W H，et al.Control of the proliferation of activated CD4+T cells by connexins[J].Journal of Leukocyte Biology，2010，88(1):79.

[14] Lin J H，Yang J，Liu S，et al.Connexin mediates gap junction-independent resistance to cellular injury.[J].Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience，2003，23(2):430.

[15] Franceschi C，Bonafè M，Valensin S，et al.Inflamm-aging.An evolutionary perspective on immunosenescence.[J].Annals of the New York Academy of Sciences，2000，908(1):244.

[16]Katz J M，Plowden J，Renshaw-Hoelscher M，et al.Immunity to influenza:the challenges of protecting an aging population[J].Immunologic Research，2004，29(13):113-124.

[17] Allman D，Miller J P.The aging of early B-cell precursors[J].Immunological Reviews，2005，205(1):18.

[18] Weng N P.Aging of the immune system:how much can the adaptive immune system adapt[J].Immunity，2006，24(5):495.

[19]Riley R L，Blomberg B B，F(xiàn)rasca D.B cells，E2A，and aging.[J].Immunological Reviews，2005，205(1):30-47.

[20] Franceschi C，Bonafè M，Valensin S，et al.Inflamm-aging.An evolutionary perspective on immunosenescence.[J].Annals of the New York Academy of Sciences，2000，908(1):244.

[21] Linton P J，Dorshkind K.Age-related changes in lymphocyte development and function.Nat Immunol 5:133-139[J].Nature Immunology，2004，5(2):133.

[22] Effros R B.Genetic alterations in the ageing immune system:impact on infection and cancer[J].Mechanisms of Ageing&Development，2003，124(1):71-72.

[23] Murasko D M，Jiang J.Response of aged mice to primary virus infections.[J].ImmunologicalReviews，2005，205(1):285-296.

[24]Aidoo A，Bishop M E，Shelton S D，et al.Effects of daidzein，genistein，and 17beta-estradiol on 7，12-dimethylbenz[a]anthracene-induced mutagenicity and uterine dysplasia in ovariectomized rats[J].Nutrition Cancer，2005，53(1):82.

[25]Ferguson F G，Wikby A，Maxson P，et al.Immune parameters in a longitudinal study of a very old population of swedish people:A comparison between survivors and nonsurvivors[J].Journals of Gerontology，1995，50(6):B378.

[26]王凌.圍絕經(jīng)期疾病診療進展與免疫[C]//全國中西醫(yī)結(jié)合卵巢功能調(diào)控專題學術會議論文及摘要集.2014.

[27]Kumru S，Godekmerdan A，Yilmaz B.Immune effects of surgical menopause and estrogen replacement therapy in perimenopausal women[J].Journal of Reproductive Immunology，2004，63(1):31-8.

[28]Huppert F A，Solomou W，O'Connor S，et al.Aging and lymphocyte subpopulations:whole-blood analysis of immune markers in a large population sample of healthy elderly individuals[J].Experimental Gerontology，1998，33(6):593-600.

[29] 王?，?不同濃度17β-雌二醇對IL-1β誘導的大鼠纖維環(huán)細胞凋亡的影響[D].河北：河北醫(yī)科大學，2015.

[30]凌晨.圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后期婦女的T細胞免疫功能評價新體系[D].蘇州大學，2014.

[31]王愛.外周血T淋巴細胞間縫隙連接在高血壓炎癥中的作用及機制研究[D].石河子大學，2016.

[32] 張海超，王愛，張亮，等.自發(fā)性高血壓大鼠腎損傷伴隨調(diào)節(jié)性T淋巴細胞下降及連接蛋白43的表達增強[J].免疫學雜志，2015，(11):941-944.Zhang H C,Wang A,Zhang L,etal.Downregalation of regalatory T cells and upregulation of connerin 43 enression in peripheralblaold ofspontaneony hyperteneaus hypertansion rat with renal damage[J].Immnnological Journal,2015（11）:941-944.

[33] Oviedo Orta E，Errington R J，Evans W H.Gap junction intercellular communication during lymphocyte transendothelial migration[J].Cell Biology International，2002，26(3):253-263.

[34] E Oviedo，Evans H H.Intercellular communication in the immune system:differential expression of connexin40 and 43，and perturbation of gap junction channel functions in peripheral blood and tonsil human lymphocyte subpopulations[J].Immunology，2000，99(4):578-590.

[35] Lee K H.Modification of gene expression of connexins in the rat corpus epididymis by estradiol benzoate or flutamide exposure at the early neonatal age[J].Development&Reproduction，2015，19(2):69-77.