不同基原肉蓯蓉的苯乙醇苷、環(huán)烯醚萜類特征圖譜研究

黃雄梅，黃 艷，農(nóng)新維，韋敏靈，韋紅言[培力(南寧)藥業(yè)有限公司，南寧 530007]

肉蓯蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)和管花肉蓯蓉[Cistanchetubulosa(Schenk) Wight]是《中國藥典》2020年版中規(guī)定的2種基原，是我國新疆等沙漠地區(qū)的傳統(tǒng)名貴補(bǔ)益類中藥，藥用部位為干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖[1-2]。其主要功效為補(bǔ)腎陽、益精血、潤腸通便，用于腎陽不足、精血虧虛等癥狀的治療[3-6]。肉蓯蓉屬為根寄生植物，其寄主為固沙植物梭梭、檉柳屬植物等。該屬約有22種植物，屠鵬飛等的考證結(jié)果表明，中國境內(nèi)共有4種1變種[7-10]，分別為肉蓯蓉、管花肉蓯蓉、鹽生肉蓯蓉及沙蓯蓉。由于肉蓯蓉的種類眾多，從性狀上不易將它們區(qū)別開，故需建立一種基于特征性化學(xué)成分的方法對(duì)其進(jìn)行有效區(qū)分。本研究通過建立管花肉蓯蓉苯乙醇苷、環(huán)烯醚萜類成分的特征圖譜[11-14]，對(duì)4種常見的基原進(jìn)行系統(tǒng)地特征圖譜對(duì)比研究[15-16]，為區(qū)別肉蓯蓉藥材基原提供重要的參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 安捷倫LC1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；DAD檢測(cè)器、色譜柱Agilent ZORBAX Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和萬用電爐，均購自天津泰斯特儀器有限公司；XPE205DR型、XSE204型電子分析天平，均購自梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2試藥 松果菊苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)89.7%，批號(hào)111670-201706)、毛蕊花糖苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.5%，批號(hào)111530-201713)、肉蓯蓉對(duì)照藥材(批號(hào)121276-201102)，均購自中國食品藥品檢定研究院；管花苷A(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.6%，批號(hào)MUST-17080101)、異毛蕊花糖苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%，批號(hào)MUST-18051806)，均購自成都曼思特生物科技有限公司；乙腈(色譜純，德國Merck公司)；超純水(自制)；其他試劑均為分析純；肉蓯蓉樣品來源見表1，經(jīng)廣西藥檢所韋家福教授分別鑒定為肉蓯蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)、管花肉蓯蓉[Cistanchetubulosa(Schrenk) Wight]、鹽生肉蓯蓉[Cistanchesalsa(C.A.Mey.) G.Beck]、沙蓯蓉(CistanchesinensisG.Beck)的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖。

表1 肉蓯蓉樣品來源Tab.1 Sources of Herba Cistanche samples

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑[型號(hào)：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)]。流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長：240 nm。流動(dòng)相：乙腈(A)-1 mL · L-1磷酸溶液(B)。梯度洗脫條件：0～19 min，4% A；19～40 min，4%～6% A；40～45 min，6%～13% A；45～90 min，13%～18% A。

2.2溶液的制備

2.2.1參照物溶液的制備 精密稱定肉蓯蓉對(duì)照藥材和管花肉蓯蓉對(duì)照藥材各1 g，加入水50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取30 min，放冷，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，取續(xù)濾液，作為對(duì)照藥材參照物溶液。取松果菊苷、毛蕊花糖苷、管花苷A、異毛蕊花糖苷及肉蓯蓉苷A對(duì)照品適量，加入體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇制成每1 mL含0.2 mg松果菊苷、0.2 mg毛蕊花糖苷、0.1 mg管花苷A、0.1 mg異毛蕊花糖苷及0.1 mg肉蓯蓉苷A的混合溶液，作為對(duì)照品參照物溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取收集到的11批藥材粉末(過4號(hào)篩)各約1 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入水50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取30 min，放冷，加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，取續(xù)濾液，即得。

2.3峰標(biāo)定、參照峰和共有峰的選擇 按照 2.2項(xiàng)下的方法制備相應(yīng)的溶液。分別取空白溶劑、參照物溶液及供試品溶液，按照 2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)行特征色譜峰的分析定位。見圖1。由圖1可知，空白溶劑無干擾，管花肉蓯蓉有9個(gè)共有峰[17-18]，由于松果菊苷的保留時(shí)間和響應(yīng)值較為合適，故將其作為參照峰；結(jié)合隨行對(duì)照的方式，標(biāo)定了5個(gè)峰，即峰6為松果菊苷、峰7為毛蕊花糖苷、峰8為管花苷A、峰9為異毛蕊花糖苷、峰10為肉蓯蓉苷A[19-22]。其中峰10屬于肉蓯蓉和鹽生肉蓯蓉基原的特征峰。

圖1 管花肉蓯蓉特征圖譜注：A.空白溶劑；B.對(duì)照品參照物溶液；C.供試品溶液；6.松果菊苷；7.毛蕊花糖苷；8.管花苷A；9.異毛蕊花糖苷；10.肉蓯蓉苷A。Fig.1 Characteristic chromatograms of Cistanche tubulosa (Schenk) Wight

2.4精密度考察 精密吸取同一份供試品溶液，按規(guī)定的色譜條件測(cè)定特征圖譜，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明，9個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積無明顯差別，RSD值均小于3.00%，說明儀器精密度良好。

2.5重復(fù)性考察 精密稱取同一批號(hào)的管花肉蓯蓉6份，按上述方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定特征圖譜。結(jié)果表明，9個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積無明顯差別，RSD值均小于3.00%，說明本方法的重復(fù)性良好。

2.6穩(wěn)定性考察 按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0、5、10、15、20、24 h進(jìn)樣，按2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定特征圖譜。結(jié)果表明，9個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積無明顯差別，RSD值均小于3.00%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7樣品特征圖譜測(cè)定 分別取4種常見基原共11批藥材，見表1，按2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定特征圖譜，結(jié)果見圖2。4種基原特征圖譜疊加見圖3。

圖2 4種肉蓯蓉基原特征圖譜注：A．4批管花肉蓯蓉特征圖譜；B．4批肉蓯蓉特征圖譜；C．2批鹽生肉蓯蓉特征圖譜；D．3批沙蓯蓉特征圖譜；G1～G4.管花肉蓯蓉藥材；R1～R4.肉蓯蓉藥材；Y1～Y2.鹽生肉蓯蓉藥材；S1～S3.沙蓯蓉藥材；1～5.未知峰；6.松果菊苷；7.毛蕊花糖苷；8.管花苷A；9.異毛蕊花糖苷；10.肉蓯蓉苷A;11～12.未知峰。Fig.2 Characteristic chromatograms of Herba Cistanche of 4 originsNotes:A.4 batches of C.tubulosa (Schenk) Wight；B.4 batches of C.deserticola Y.C.Ma;C.2 batches of C.salsa (C.A.Mey.) G.Beck；D.3 batches of C.sinensis G.Beck；G1-G4.Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight；R1-R4.Cistanche deserticola Y.C.Ma；Y1-Y2.Cistanche salsa (C.A.Mey.) G.Beck；S1-S3.Cistanche sinensis G.Beck；1-5.unknown peaks; 6.echinacoside;7.verbascoside;8.tubuloside A;9.isoacteoside;10.cistanoside A；11-12.unknown peak.

圖3 4種肉蓯蓉基原特征圖譜疊加注：R.對(duì)照品參照物溶液；R1.肉蓯蓉；G1.管花肉蓯蓉；Y1.鹽生肉蓯蓉；S1.沙蓯蓉；6．松果菊苷；7.毛蕊花糖苷；8：管花苷A；9.異毛蕊花糖苷；10：肉蓯蓉苷A;11～12.未知峰。Fig.3 Superimposed characteristic chromatograms of Herba Cistanche of 4 originsNotes:R.standard reference solution；R1.Cistanche deserticola Y.C.Ma；G1.Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight；Y1.Cistanche salsa (C.A.Mey.) G.Beck；S1.Cistanche sinensis G.Beck；6.echinacoside;7.verbascoside;8.tubuloside A;9.isoacteoside;10.cistanoside A;11-12.unknown peak.

2.8不同基原肉蓯蓉的特征圖譜 由圖2中的4批管花肉蓯蓉及其對(duì)照藥材的特征圖譜可知，管花肉蓯蓉藥材有9個(gè)特征峰，與其對(duì)照藥材的特征峰能一一對(duì)應(yīng)。由于管花肉蓯蓉藥材基原通過藥材性狀就能辨認(rèn)，故將管花肉蓯蓉的特征圖譜作為參照基礎(chǔ)，區(qū)別其他3種基原。肉蓯蓉的特征圖譜與管花肉蓯蓉比較，多出峰10，3批肉蓯蓉及對(duì)照藥材共有10個(gè)特征峰，見圖2B。鹽生肉蓯蓉的特征圖譜與管花肉蓯蓉比較，缺少峰7、8、9，而多出峰10，2批鹽生肉蓯蓉共有7個(gè)特征峰，見圖2C。沙蓯蓉的特征圖譜與管花肉蓯蓉比較，多出2個(gè)未知峰，即峰11和峰12，而缺少峰1～6和峰8，共有4個(gè)特征峰，見圖2D。峰11和峰12可作為判別沙蓯蓉基原特有的色譜峰。

綜上所述，在2.1項(xiàng)下的色譜條件下，管花肉蓯蓉基原應(yīng)有9個(gè)共有特征峰；肉蓯蓉基原應(yīng)有10個(gè)共有特征峰，與管花肉蓯蓉基原相比，多出峰10，即肉蓯蓉苷A；鹽生肉蓯蓉基原應(yīng)有7個(gè)共有特征峰，與管花肉蓯蓉基原相比，缺少峰7～9，而多出峰10，即肉蓯蓉苷A；沙蓯蓉基原應(yīng)有4個(gè)共有特征峰，峰11和峰12可作為沙蓯蓉基原特有的色譜峰。

3 討論

3.1樣品提取溶劑考察 本研究對(duì)提取溶劑進(jìn)行考察，比較了體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇、甲醇、體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇及水。結(jié)果表明，不同溶劑對(duì)色譜峰的數(shù)量及峰面積的影響不大，從溶劑毒性與安全性的角度考慮，選擇水作為提取溶劑。分別考察超聲和回流2種不同的提取方式，結(jié)果表明，應(yīng)用回流提取方式時(shí)，各色譜峰的響應(yīng)值較大，故提取方法選擇回流。對(duì)不同的提取時(shí)間進(jìn)行考察，分別回流30、45、60 min，結(jié)果表明，提取不同時(shí)間的色譜峰峰面積和色譜峰的數(shù)量基本一致，為簡(jiǎn)化操作，故選擇提取時(shí)間為30 min。對(duì)提取次數(shù)進(jìn)行考察，結(jié)果提取1次與提取多次的色譜峰數(shù)量無明顯差異，故選擇提取次數(shù)為1次。最終確定用水回流提取30 min、提取1次的方法。

3.2檢測(cè)波長的選擇 朱乃亮等[11]的研究表明，肉蓯蓉的主要成分為苯乙醇苷和環(huán)烯醚萜苷。本研究使用Agilent的紫外檢測(cè)器進(jìn)行紫外區(qū)全波長掃描，苯乙醇苷的最大吸收值出現(xiàn)在330 nm處[23-26]，環(huán)烯醚萜苷類的最大吸收值在約240 nm處[27-29]，兩類成分在240 nm處均有較大吸收值，呈現(xiàn)的色譜峰數(shù)量較多，且響應(yīng)值較高，各色譜峰的分離度和峰形良好。綜合考慮，選擇240 nm作為本研究的檢測(cè)波長。

3.3肉蓯蓉特征圖譜分析與評(píng)價(jià) 肉蓯蓉的不同基原僅依據(jù)性狀不能很好地辨別，故本研究結(jié)合藥材性狀建立特征圖譜的方法，對(duì)不同基原的肉蓯蓉進(jìn)行了研究。以管花肉蓯蓉和對(duì)照藥材特征圖譜為參照，其他3種基原的特征圖譜與之相比有明顯的差異，本方法能有效區(qū)分不同基原的肉蓯蓉，為對(duì)肉蓯蓉進(jìn)行進(jìn)一步的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)，也為后續(xù)區(qū)分不同基原肉蓯蓉的相關(guān)研究提供了參考。