基于植物藥的抗新型冠狀病毒肺炎活性化合物研究進(jìn)展

茍喜蘭，魏 芬，王嗣岑(西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是由β屬單鏈包膜RNA病毒引起的嚴(yán)重呼吸道綜合征，因其極強(qiáng)的傳染性已成為全球性的公共健康問題。對COVID-19的治療，目前主要包括小分子藥物、生物類藥物、疫苗和植物藥[1]。小分子藥物主要以傳統(tǒng)抗病毒藥物如利巴韋林、瑞德西韋等為主，源于病毒基因組的相似性，小分子藥物具有良好的臨床療效，但其生物安全性數(shù)據(jù)缺乏，在治療過程中存在QT間期延長(QT指心室除極和復(fù)極激動時(shí)間)、慢性腎損傷等不良反應(yīng)[2-3]。生物類藥物以單克隆抗體和恢復(fù)者血漿抗體為代表，托珠單抗通過靶向抑制白細(xì)胞介素-6(IL-6)受體活性而阻斷炎癥反應(yīng)，減輕患者的心血管損傷、淋巴細(xì)胞綜合征等，高滴度抗體血清能明顯改善患者的疾病進(jìn)程，但單克隆抗體的持續(xù)使用會增加菌血癥感染風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)高滴度抗體血漿較難滿足[4-6]。疫苗是由滅活病毒誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)早發(fā)性產(chǎn)生抗體等免疫物質(zhì)進(jìn)而降低疾病發(fā)生率的一種治療方式，目前已有包括輝瑞、國藥以及科興等不同醫(yī)藥公司的疫苗投入市場，考慮到病毒基因組的不斷變異，其有效性和安全性有待評估。

植物藥具有悠久的用藥歷史，衍生出了包括中醫(yī)、阿育吠陀、漢方醫(yī)學(xué)和韓醫(yī)學(xué)在內(nèi)的多個分支，其對于傳染病的治療可追溯至周朝，植物藥具有完整的理論體系和豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)[7]。在COVID-19疫情防治中，植物藥如蓮花清瘟膠囊、血必凈注射液以及清肺排毒湯、麻杏石甘湯等被應(yīng)用于COVID-19的治療，取得了良好的治療效果。然而，植物藥成分復(fù)雜，作用機(jī)制不明確，安全性隱患制約了其進(jìn)一步的應(yīng)用和推廣[8-9]。同時(shí)，植物藥中化學(xué)物質(zhì)具有結(jié)構(gòu)新穎及獨(dú)特藥理作用等特點(diǎn)，為發(fā)現(xiàn)新的候選藥物提供了巨大而寶貴的資源。因此，從植物藥中篩選先導(dǎo)化合物，兼具有效性和安全性，對抗COVID-19創(chuàng)新藥物的研發(fā)具有重要意義。目前對于COVID-19中植物藥的研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接、分子動力學(xué)和成藥性評價(jià)等多種篩選方法與蛋白印跡、空斑實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞活性測試等藥理方法相結(jié)合為主，集中在物質(zhì)基礎(chǔ)的解析和治療機(jī)制的闡釋等方面[10-13]，旨在尋找能有效治療COVID-19的先導(dǎo)化合物。

1 以生物活性蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的藥物篩選

蛋白質(zhì)相互作用如酶-底物、受體-配體、抗原-抗體等在生物體的新陳代謝、信息交流以及生長發(fā)育中具有重要作用，是機(jī)體維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要條件。在COVID-19的發(fā)生發(fā)展中，新型冠狀病毒與靶細(xì)胞的相互作用，是疾病診斷和治療的基礎(chǔ)，新型冠狀病毒的黏附、滲透以及釋放都直接影響疾病進(jìn)程，是藥物研發(fā)的重要靶標(biāo)。

1.1以病毒抗原為靶標(biāo)的藥物篩選 對新型冠狀病毒進(jìn)行病原學(xué)解析，其主要有刺突蛋白S蛋白，衣殼蛋白E蛋白，膜蛋白M蛋白以及核蛋白N蛋白。S蛋白主要與靶細(xì)胞ACE2受體結(jié)合可進(jìn)一步解析為負(fù)責(zé)識別的S1片段和負(fù)責(zé)跨膜融合的S2片段[14]，是目前研究最多的病毒蛋白。芳香療法利用藥物的氣味進(jìn)行疾病的治療，在印度具有漫長的應(yīng)用歷史。最近有一項(xiàng)研究以病毒S蛋白為靶點(diǎn)，利用分子對接的手段，對揮發(fā)油類物質(zhì)進(jìn)行篩選得到了如百里香酚等多種酚類小分子物質(zhì)，后者具有消毒殺菌作用，由于空氣傳播和接觸傳播是新型冠狀病毒蔓延的重要途徑，篩選得到的化合物有望以空氣清洗劑、消毒劑等多種形式用于COVID-19的預(yù)防[15]。此外，對黃酮類化合物以S蛋白為靶標(biāo)進(jìn)行分子對接的虛擬篩選，得到了以槲皮苷為代表的多個化合物，分子對接模型表明，其可與S蛋白的多個殘基成鍵，推測槲皮苷類黃酮化合物可能通過預(yù)先結(jié)合S蛋白而阻礙S蛋白對靶細(xì)胞的識別而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[16]。

1.2以病毒酶為靶點(diǎn)的藥物篩選 新型冠狀病毒是包膜的單鏈RNA病毒，隸屬于β冠狀病毒屬，盡管其基因組與其他冠狀病毒如重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS CoV)享有較高同源性，但致病能力和傳播速度卻相距甚遠(yuǎn)，基因的變異和病毒的多樣化切割是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因。酶是參與病毒蛋白質(zhì)切割的重要活性物質(zhì)，通過將多蛋白進(jìn)行不同位點(diǎn)的切割產(chǎn)生功能不同的非結(jié)構(gòu)蛋白，后者參與病毒RNA的復(fù)制、翻譯以及病毒顆粒的組裝等多個過程。M蛋白酶即3 CL蛋白酶(糜蛋白樣蛋白酶)，主要作用于亮氨酸-谷氨酰胺(絲氨酸-丙氨酸-甘氨酸)位點(diǎn)，與RNA剪接翻譯、加工及細(xì)胞調(diào)控等多個過程相關(guān)，在生理?xiàng)l件下還能對宿主蛋白進(jìn)行切割，通過干擾宿主的轉(zhuǎn)錄翻譯等促進(jìn)自身增殖，是藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)[14]。以M蛋白酶為靶標(biāo)建模對不同數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，Gurung A B等[17]得到了萜類化合物bonducellpin D和caesalmin B，而Aanouz I等[18]得到了地高辛、β-桉葉油脂、藏紅花素等化合物，證明M蛋白酶是篩選治療COVID-19活性化合物的有效靶點(diǎn)；進(jìn)一步結(jié)合分子動力學(xué)模擬，Tahir Ul Qamar M等[19]在篩選了32 297個化合物后列出了結(jié)合力較強(qiáng)的包括楊梅苷、迷迭香酸甲酯在內(nèi)的9個活性化合物。除M蛋白酶外，RNA聚合酶也可作為藥物篩選的有效靶點(diǎn)，Singh S等[20]利用此靶點(diǎn)對天然多酚類化合物進(jìn)行篩選，得到了沒食子酸酯、茶黃素苷等8個活性化合物。Lung J等[21]篩選得到了茶黃素，并進(jìn)一步計(jì)算得到茶黃素對RNA聚合酶的鍵合自由能為-9.11 kcal·mol-1，提示其有望成為治療COVID-19的先導(dǎo)化合物。

1.3以靶細(xì)胞受體為靶點(diǎn)的藥物篩選 新型冠狀病毒以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)受體為靶點(diǎn)，通過自身S刺突蛋白對其特異性識別，進(jìn)一步失去刺突蛋白S1片段而與靶細(xì)胞細(xì)胞膜融合，在跨膜絲氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)跨膜蛋白的介導(dǎo)下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)病毒體的復(fù)制與增殖。同時(shí)，由于ACE2受體在機(jī)體不同器官和組織的廣泛分布，新冠病毒可引起如心臟、脾臟等多器官的功能性損傷，導(dǎo)致心血管損害、淋巴細(xì)胞減少癥等多種嚴(yán)重并發(fā)癥，惡化疾病進(jìn)程和預(yù)后[22-23]。因此，研發(fā)ACE2與TMPRSS2的抑制劑是COVID-19治療藥物研究的有效策略。以ACE2受體為靶點(diǎn)，利用分子對接，對來自阿爾及利亞西北部的輪葉金雞菊進(jìn)行篩選，得到了異麝香草酚，對黑種草進(jìn)行篩選，得到了對苯二酚，進(jìn)一步對得到的候選化合物進(jìn)行藥代動力學(xué)、生物利用度等分析，發(fā)現(xiàn)兩者均對ACE2具有較高的結(jié)合活性和穩(wěn)定性，有望成為治療COVID-19的先導(dǎo)化合物[24-25]。醉茄酮和醉茄素A是以TRANSS2蛋白為靶點(diǎn)，通過分子對接、分子動力學(xué)篩選南非醉茄而得到的2種化合物，將其與表達(dá)有TMPRSS2的人乳腺癌(MCF7)發(fā)生作用，發(fā)現(xiàn)醉茄酮不僅能占據(jù)TMPRSS2的催化位點(diǎn)，阻止病毒粒子的黏附，還可以下調(diào)TMPRSS2蛋白的表達(dá)量而正向循環(huán)抑制病毒對靶細(xì)胞的入侵[26]。

2 以類藥性為基礎(chǔ)的藥物篩選

類藥性是指化合物成為藥物的可能性，一般用Lipinski′s于1997年提出的五原則衡量：相對分子質(zhì)量≤500道爾頓，lgP(P為化合物在正丁醇和水體系中的油水分配系數(shù))≤5，氫鍵供體≤5，氫鍵受體≤10，化合物的可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)量≤10。相較同一類化合物的數(shù)據(jù)庫篩選，類藥性原則的使用在對化合物結(jié)構(gòu)差異較大的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選時(shí)具有明顯的優(yōu)勢，可有效節(jié)約時(shí)間和成本，比如直接排除某些親水性差的化合物諸如石油醚類、鞣質(zhì)類等[16-17]。在一項(xiàng)通過文獻(xiàn)挖掘?qū)ふ野邢蛐滦凸跔畈《綧蛋白酶的研究中，類藥性的使用可直接將候選化合物從38個排除到10個，顯著縮短了篩選時(shí)間[17]。此外，在對黑胡椒、丁香和姜篩選抗新型冠狀病毒化合物時(shí)，類藥性原則的應(yīng)用以已有的化合物阿巴卡韋和羥氯喹為基準(zhǔn)，有效避免了對某些化合物如阿魏酸的誤判，同時(shí)，將3種植物中總的候選化合物種類降到20種[27]，大幅度降低了后期藥理活性實(shí)驗(yàn)的成本。

3 以代謝安全性為主的藥物篩選

藥物在體內(nèi)的代謝過程直接影響藥物作用的效果，化合物的吸收、分布、代謝、排泄(absorption，distribution，metabolism，excretion，ADME)是決定其成藥性的關(guān)鍵。ADME通常以人結(jié)腸腺癌-2細(xì)胞系(Caco2)的通透性和人腸道吸收值(HIA)對藥物的體內(nèi)生物利用度進(jìn)行衡量。以槲皮素為例，篩選發(fā)現(xiàn)其對新型冠狀病毒S蛋白具有潛在效應(yīng)，通過ADME預(yù)測發(fā)現(xiàn)，口服槲皮素后體內(nèi)血藥濃度明顯低于鼻噴霧給藥后，故推薦給藥方式為噴霧劑會獲得更好的療效[28]。穿心蓮內(nèi)酯是一種對病毒M蛋白具有潛在活性的化合物，通過ADME分析發(fā)現(xiàn)，其對細(xì)胞色素P450等多種代謝酶無作用，不與抗糖尿病藥物、心血管疾病藥物發(fā)生相互作用，有望用于患有慢性疾病的COVID-19患者的治療[29]。ADME測試除可用于后期化合物類藥性測試外，還可參與先導(dǎo)化合物的前期篩選。在一項(xiàng)以病毒蛋白酶M為靶點(diǎn)的虛擬篩選中，通過文獻(xiàn)搜索建立抗病毒化合物數(shù)據(jù)庫，得到115個潛在的抗病毒化合物，經(jīng)ADME預(yù)測后，排除102個不符合代謝安全要求的化合物，使候選化合物數(shù)量降低到13個，極大降低了時(shí)間和精力成本，即ADME是一種有效的藥物篩選方法[30]。

4 以結(jié)合穩(wěn)定性為主的篩選

動力學(xué)模擬(molecular dynamics，MD)通過計(jì)算機(jī)虛擬靶標(biāo)在不同構(gòu)象下與目標(biāo)化合物的結(jié)合狀態(tài)并計(jì)算結(jié)合能，可用于判斷化合物與靶標(biāo)的結(jié)合方式，推測化合物-靶標(biāo)/化合物-活性靶標(biāo)殘基的穩(wěn)定性構(gòu)象。通過計(jì)算候選化合物與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合能，一定程度上可以推斷結(jié)合力的強(qiáng)弱并對化合物的靶標(biāo)效應(yīng)進(jìn)行預(yù)測。在對COVID-19的候選化合物進(jìn)行分析時(shí)，動力學(xué)模擬可被用于判斷或驗(yàn)證目標(biāo)化合物的結(jié)合位點(diǎn)，如在考察地高辛與病毒E蛋白的作用機(jī)制時(shí)，其結(jié)合復(fù)合物骨架C原子的位置在20 ns時(shí)不再變化而保持穩(wěn)定，且在形成復(fù)合物時(shí)E蛋白的氨基酸殘基二級構(gòu)象波動小于0.25 nm，可推測地高辛對病毒E蛋白具有較高的結(jié)合穩(wěn)定性，且其結(jié)合方式為與Thr35形成氫鍵，與其他研究結(jié)果一致[31]。同時(shí)，動力學(xué)模擬還可用于藥物設(shè)計(jì)，利用臨床有效藥物尋找可能的靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)，通過結(jié)合能大小對靶標(biāo)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)化篩選，可以得到潛在的具有藥理活性的靶標(biāo)官能團(tuán)，為基于活性基團(tuán)的藥物設(shè)計(jì)提供依據(jù)；當(dāng)活性靶標(biāo)確定后，通過系列化合物對其進(jìn)行結(jié)合能分析，可以進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)和開發(fā)。此外，密度泛函理論(DFT)以化合物的分子軌道能量受到其結(jié)合狀態(tài)影響為理論基礎(chǔ)，通過計(jì)算靶標(biāo)在結(jié)合不同化合物后的分子軌道能量變化，進(jìn)而對化合物的結(jié)合活性進(jìn)行預(yù)測，在藥物篩選方面有廣闊的應(yīng)用前景[15]。

5 體外藥理學(xué)篩選

由于COVID-19的突發(fā)性和傳播迅猛的特點(diǎn)，前期的研究大都以虛擬篩選和計(jì)算機(jī)輔助為主要手段，雖高效快速地得到了例如茶黃素、槲皮素等潛在先導(dǎo)化合物，但缺乏體內(nèi)外藥理實(shí)驗(yàn)，限制了其臨床的進(jìn)一步使用[21]。在后期的研究中，一些體外藥理實(shí)驗(yàn)例如Western blot、MTT、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和空斑形成實(shí)驗(yàn)等被廣泛應(yīng)用于COVID-19的藥物研發(fā)[26，32]。在闡明麻杏石甘湯預(yù)防性治療COVID-19的機(jī)制中，前期采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選得到了105個活性化合物、83個潛在靶標(biāo)和63個相關(guān)通路，進(jìn)一步結(jié)合IL-6誘導(dǎo)的小鼠肺表皮細(xì)胞損傷程度分析和Western blot蛋白表達(dá)狀況分析，推測得到了苦杏仁苷對主要靶標(biāo)通路如IL-6相關(guān)的JAK-STAT等具有抑制作用，有望成為治療COVID-19的活性化合物[33]。此外，在對連花清瘟膠囊和熱毒寧注射液的臨床效果進(jìn)行評價(jià)時(shí)，均采用了vero E6細(xì)胞結(jié)合蛋白含量分析的方法，為其臨床實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)[32，34]。盡管體外實(shí)驗(yàn)相對虛擬篩選具有更高的藥理學(xué)應(yīng)用價(jià)值，但考慮到實(shí)驗(yàn)周期長、影響因素多及成本高等特點(diǎn)，其多用于化合物的后期藥理活性驗(yàn)證。

6 臨床實(shí)驗(yàn)篩選

COVID-19與非典型性肺炎、中東呼吸綜合征等在病原體、臨床癥狀上的相似性為其早期經(jīng)驗(yàn)性治療奠定了基礎(chǔ)，瑞德西韋、氯喹及地塞米松等先前用于其他病毒的藥物直接進(jìn)入了不同規(guī)模的臨床試驗(yàn)階段[2]。在一項(xiàng)涉及多地區(qū)的包含1 062個COVID-19患者的隨機(jī)雙盲試驗(yàn)中，服用瑞德西韋的患者較對照組表現(xiàn)出更慢的疾病進(jìn)程、更短的住院時(shí)間以及更低的死亡率，推測得到瑞德西韋治療COVID-19的有效性[35]。氯喹是一類具有悠久歷史的抗病毒藥，對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造后的磷酸氯喹具有較低的心血管不良反應(yīng)率，當(dāng)其用于COVID-19患者的治療時(shí)，患者肺部損傷明顯改善，核酸檢測病毒轉(zhuǎn)陰率提高，住院時(shí)間顯著縮短，已被納入COVID-19臨床治療指南(第八版)。地塞米松作為一種糖皮質(zhì)激素類免疫抑制劑，在抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴方面效果明顯，當(dāng)其應(yīng)用于治療COVID-19時(shí)，可明顯降低需要體外膜肺氧合(ECMO)等機(jī)械通氣患者的死亡率，被有條件地納入美國食品藥品管理局(FDA)重癥COVID-19患者的治療方案[36-37]。臨床試驗(yàn)是篩選COVID-19治療藥物最為直接有效的方式，但其需要以候選藥物具有高度的安全有效性數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，常作為藥物大規(guī)模上市之前的人體安全性和有效性考察。

7 其他方法

除上述方法外，還有包括Meta分析、數(shù)據(jù)挖掘等文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)方法可用于快速的靶標(biāo)化合物篩選，如姜黃素的抗病毒效果可通過文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)得到，而清肺排毒湯中的多糖被認(rèn)為是有效成分則源于對多糖的藥理學(xué)研究[38-39]。

COVID-19是由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)引起的以下呼吸道嚴(yán)重感染為主要癥狀的復(fù)雜疾病，其流行病學(xué)調(diào)查顯示，年齡、慢性疾病、機(jī)體營養(yǎng)狀態(tài)均是感染的促進(jìn)因素[40-41]，而心血管疾病、免疫系統(tǒng)損傷是常見的并發(fā)疾病[42-45]，COVID-19疾病進(jìn)程的復(fù)雜性要求系統(tǒng)性、綜合性的治療方案。植物藥具有悠久的用藥歷史，多成分、多靶點(diǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)優(yōu)勢和系統(tǒng)性、整體性的治療優(yōu)勢使其成為復(fù)雜疾病治療的有效策略和優(yōu)選方案[46]。在抗COVID-19藥物的研發(fā)中，以植物藥為基礎(chǔ)進(jìn)行候選藥物的發(fā)掘和優(yōu)化具有重要意義。本文綜述了植物藥用于COVID-19藥物研發(fā)的幾種主要策略，以生物活性蛋白為靶標(biāo)的藥物篩選，基于化合物類藥性、成藥性、體內(nèi)代謝安全性和化合物對靶標(biāo)的結(jié)合穩(wěn)定性為基礎(chǔ)的藥物篩選，以體外藥理實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的藥物篩選和臨床實(shí)驗(yàn)篩選等多種藥物篩選手段，旨在為從植物中發(fā)掘得到高效、安全的治療COVID-19藥物提供一定的思路和方法。