決明子凍干粉對(duì)SD大鼠的長(zhǎng)期毒性研究

魏若堯　裴彥宇　孫井江

[摘要] 目的 研究大鼠連續(xù)1年長(zhǎng)期攝入決明子凍干粉的毒性，為人體食用提供參考依據(jù)。 方法 實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)SD大鼠480只，雌雄各半。隨機(jī)分為4組，每組120只。分別為：溶媒對(duì)照組（純凈水）、低劑量組（0.5 g生藥/kg BW）、中劑量組（2.2 g生藥/kg BW）、高劑量組（10.0 g生藥/kg BW）。給藥體積：1 mL/100 g，每周給藥6 d，每天給藥1次，連續(xù)給藥52周，口服（灌胃）給藥。每周進(jìn)行體重和攝食量的測(cè)定。動(dòng)物在給藥第13、26、39、52周以及給藥26、52周停藥恢復(fù)4周后，各組分別剖殺20只，雌雄各半。進(jìn)行血液學(xué)、血清生化學(xué)測(cè)定，剖解主要臟器進(jìn)行臟器重量稱量，計(jì)算臟器重量及臟器系數(shù)，并對(duì)各劑量組臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。 結(jié)果 ①在整個(gè)試驗(yàn)周期中未發(fā)生因給予決明子藥物本身引起的大鼠瀕死和死亡的毒性反應(yīng)。②各給藥劑量組及對(duì)照組大鼠體重均增長(zhǎng)，呈現(xiàn)出一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。③大鼠連續(xù)灌胃給予決明子26周，中劑量、高劑量組雌性大鼠以及高劑量組雄性大鼠的總膽紅素偏低（P < 0.01），且恢復(fù)4周后，高劑量組雄性大鼠的總膽紅素依舊偏低（P < 0.01）。給藥39周后高劑量組雌性與雄性大鼠的總膽紅素偏低（P < 0.05或P < 0.01）；給藥52周后高劑量組雄性大鼠的三酰甘油比對(duì)照組顯著性降低（P < 0.05），恢復(fù)4周后恢復(fù)正常。大鼠連續(xù)灌胃給予決明子26及39周，中劑量、高劑量組雄性大鼠的腎臟系數(shù)顯著性高于對(duì)照組（P < 0.05或P < 0.01）。④SD大鼠連續(xù)灌胃決明子26、39、52周后，在高劑量組出現(xiàn)毒性的靶器官是腎臟，且腎臟毒性不可逆，在低劑量組和中劑量組未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)。 結(jié)論 本試驗(yàn)室條件下，決明子凍干粉的未發(fā)生毒性反應(yīng)的劑量為2.2 g生藥/kg BW，在高劑量（10.0 g生藥/kg BW）下的毒性靶器官主要是腎臟。

[關(guān)鍵詞] 決明子凍干粉；長(zhǎng)期毒性；未發(fā)生毒性反應(yīng)的劑量；毒性靶器官

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）05（c）-0004-06

[Abstract] Objective To evaluate the chronic toxicity of Semen Cassiae freeze-dried powder in rats. Methods 480 SD rats were randomly divided into 4 groups （60 male and 60 female per group）： control group （pure water）， low-dose group （0.5 g/kg BW）， mid-dose group （2.2 g/kg BW） and high-dose group （10.0 g/kg BW）. The volume of drug for gavaging was 1.0 mL/100 g. animals were administrated with drug by 6 days every week for 52 weeks. Subsequently， the weight and foodintake were examined per week. Meanwhile， hematology， blood biochemistry， organ weight， organ coefficient and histopathology were detected on 13-week， 26- week， 39-week and 52-week， and stopping drug at the end of 26-week， 52-week following by 4 weeks recovery period with killing 20 rats in each group. Results ①The result showed there was no death case in each group. ②The weight of rats in dose groups and control group were increased， and it showed dose-related. ③Compared with the control group， the total bilirubin of male rats in mid-dose and high-dose group were lower after 26 weeks （P < 0.01）， after recovery period the TBIL of male rats in high-dose group was still lower （P < 0.01）. After 39 weeks treatment， the TBIL in high-dose group lower compared with the control group （P < 0.05 or P < 0.01）； The triglyceride of male rats in high-dose group was lower after 52 weeks（P < 0.05） and returned to normal after recovered 4 weeks. On 26 weeks and 39 weeks， there were significant increased in relative kidney weights of male rats in mid-dose group and high-dose group compared with control group （P < 0.05 or P < 0.01）. ④The toxic target organ in high-dose group was kidney on 26， 39， 52 weeks， and the toxicity was irreversible， no toxic showed in low-dose group and mid-dose group. Conclusion The no-observed-adverse-effect level for Semen Cassiae freeze-dried powder was 2.2 g/kg BW in rats， and the toxic target organ in high-dose （10.0 g/kg BW） group was kidney.

[Key words] Semen Cassiae freeze-dried powder； Chronic toxicity； No-observed-adverse-effect level； Toxic target organ

決明子（Cassiae Semen）是豆科植物決明（Cassia obtusifo-lia L.）或小決明（Cassia tora L.）的干燥成熟種子，其味甘、苦、咸，性微寒，多用于治療目赤腫痛、羞明多淚、頭疼眩暈、目暗不明、大便秘結(jié)等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，決明子含有多種化學(xué)成分[1]，包括蒽醌類、萘并吡喃酮類、脂肪酸類、糖類、氨基酸和無機(jī)元素，其中蒽醌類成分是主要有效成分。藥理研究表明，決明子中的蒽醌類成分具有瀉下作用[2]、降壓作用[3]、降脂作用[4]、抗菌作用[5]及免疫調(diào)節(jié)作用[6]等。同時(shí)有研究表明[7]，長(zhǎng)期使用含蒽醌類化合物的中藥會(huì)引起結(jié)腸黑變病，也會(huì)產(chǎn)生泌尿系統(tǒng)毒性[8]及生殖系統(tǒng)毒性[9]。

中藥保健食品在我國(guó)的發(fā)展歷史相對(duì)短暫，尤其是對(duì)中藥原料長(zhǎng)期使用的安全性評(píng)價(jià)研究基礎(chǔ)薄弱。決明子常作為水煎服或代茶飲的保健類食品，其安全性得到了越來越廣泛地關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外缺少對(duì)決明子原料藥長(zhǎng)期少量食用的安全性評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，人體長(zhǎng)期使用含有蒽醌類成分中藥原料的保健食品是否存在安全性問題尚無定論。本研究擬闡明決明子原料藥用于保健食品長(zhǎng)期食用的安全性，將進(jìn)一步完善決明子重要原料保健食品的審評(píng)規(guī)定，并促進(jìn)保健食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，加快中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國(guó)際化過程，提高中醫(yī)藥醫(yī)療服務(wù)能力和產(chǎn)業(yè)技術(shù)水平，豐富和完善中醫(yī)醫(yī)療保健模式。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品

決明子凍干粉[無限極（中國(guó)）有限公司，批號(hào)：Y41407045]深棕色粉末，密閉，防潮保存。1 g凍干粉相當(dāng)于9.375 g生藥材。臨用前用純凈水配成相應(yīng)濃度溶液。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠480只，雌雄各半，80～100 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所SPF級(jí)環(huán)境中，溫度范圍在22～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，換氣次數(shù)15次/h，照明>200 lux。動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（京）2014-002。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥方案

實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)SD大鼠480只，雌雄各半。隨機(jī)分為4組，每組120只。分別為：溶媒對(duì)照組（純凈水）、低劑量組（0. 5g生藥/kg BW）、中劑量組（2.2 g生藥/kg BW）、高劑量組（10.0 g生藥/kg BW），分別相當(dāng)于人體推介量等效劑量的0.5、2.3、10.7倍。（人體重按照60 kg計(jì)算）。對(duì)照組給予等體積純凈水。給藥體積為1.0 mL/100 g，每周給藥6 d，每天給藥1次，連續(xù)給藥52周，口服（灌胃）給藥。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.2.1 大體觀察、體重和攝食量的測(cè)定 每日定時(shí)觀察動(dòng)物的外觀和行為（包括精神狀態(tài)、皮膚毛發(fā)、眼睛和粘膜的變化、活動(dòng)情況、呼吸狀況、死亡情況及其他異常表現(xiàn)）、分泌物和排泄物等。每周稱體重和攝食量。

1.2.2.2血常規(guī)、血生化指標(biāo)檢測(cè) 分別在給藥13、26、39、52周以及26、52周后停藥4周時(shí)，剖殺20只/組，雌雄各半，腹主動(dòng)脈取血?？鼓糜谘Ｒ?guī)的測(cè)定，測(cè)定指標(biāo)包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞平均體積等共16項(xiàng)指標(biāo)；非抗凝血血清用于血清生化學(xué)指標(biāo)的測(cè)定，測(cè)定指標(biāo)包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素氮、血糖及鉀離子、氯離子等14項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.2.3 臟器系數(shù)及病理組織學(xué)檢查 解剖動(dòng)物處死后，進(jìn)行完整的系統(tǒng)解剖，稱量心、肝、脾、肺、腎、睪丸、子宮等組織臟器并計(jì)算臟器系數(shù)。組織器官采用10%中性甲醛固定液固定、石蠟包埋、HE染色、封片后顯微鏡下觀察各臟器的組織學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，先進(jìn)行方差分析，方差齊時(shí)采用Dunnett-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察、體重和攝食量的測(cè)定

在決明子灌胃實(shí)驗(yàn)中未發(fā)生因給予決明子藥物本身引起的大鼠瀕死和死亡的毒性反應(yīng)。但隨劑量的增加，動(dòng)物的排便次數(shù)、排尿次數(shù)增多。在整個(gè)試驗(yàn)周期中，各組大鼠體重均增長(zhǎng)，且增長(zhǎng)速度依次為：對(duì)照組組>低劑量組>中劑量組>高劑量組。見圖1。給藥第6周至給藥第52周，高劑量組雄性與雌性大鼠的體重增長(zhǎng)速度與對(duì)照組動(dòng)物相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），而停藥后增長(zhǎng)速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.2 血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

大鼠連續(xù)灌胃給予決明子13周后，中劑量組雌性大鼠紅細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著低于對(duì)照組（P < 0.05），且雌性大鼠各個(gè)劑量組RBC均有降低趨勢(shì)。大鼠連續(xù)灌胃給予決明子26周后，各給藥劑量組雄性大鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比偏低；且停藥4周后，網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比恢復(fù)正常。但在39周時(shí)未觀察到此現(xiàn)象。大鼠連續(xù)灌胃給予決明子52周，各組血液學(xué)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1～6。

2.3 血清生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

大鼠連續(xù)灌胃給予決明子13周后，高劑量組大鼠的總膽紅素偏低（P < 0.01）。大鼠連續(xù)灌胃給予決明子26周及39周后，中、高劑量組雌性大鼠以及高劑量組雄性大鼠的總膽紅素偏低（P < 0.05或P < 0.01），且26周恢復(fù)4周后，高劑量組雄性大鼠的總膽紅素依舊偏低（P < 0.01）。大鼠連續(xù)灌胃26周后，低、中劑量組雄性大鼠和中劑量組雌性大鼠三酰甘油偏低（P < 0.05），且給藥26周后恢復(fù)4周后，均恢復(fù)正常。但在39周時(shí)未觀察到此現(xiàn)象。大鼠連續(xù)灌胃給予決明子52周后，高劑量組雌性大鼠三酰甘油偏低（P < 0.01），且恢復(fù)4周后，恢復(fù)正常。見表7～12。

2.4 對(duì)臟器系數(shù)的影響

大鼠連續(xù)灌胃給予決明子26及39周，中、高劑量組雄性大鼠的腎臟系數(shù)均不同程度地顯著性高于對(duì)照組（P < 0.05或P < 0.01）。但在52周時(shí)未觀察到此現(xiàn)象。見表13。

2.5 病理學(xué)檢測(cè)

決明子給予SD大鼠13周后各受檢臟器未見明顯的病理改變。高劑量給予SD大鼠26周、39周及52周后可引起腎臟近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)色素沉積，并可能引起腎小管萎縮及再生；26周停藥4周后及52周恢復(fù)4周后腎臟近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)色素沉積仍存在；其余各受檢臟器未見與供試品有關(guān)的病理改變。中劑量灌胃給予SD大鼠39周及52周后可引起少數(shù)動(dòng)物腎臟近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)色素沉積；其余各受檢臟器未見與供試品有關(guān)的病理改變；52周恢復(fù)4周后腎臟近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)色素沉積仍存在。中劑量及低劑量給予SD大鼠26周及停藥4周后各受檢臟器未見與供試品有關(guān)的病理改變。見圖2。

3 討論

《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定決明子的人體推薦量是9～15 g/d[10]，是衛(wèi)計(jì)委公布的69種“藥食同源”的保健品之一[11]。決明子中含有多種化學(xué)成分[12-17]，蒽醌類成分是其主要生物活性有效成分，它在表現(xiàn)出多種有效成分的同時(shí)，也表現(xiàn)出多種毒副作用。美國(guó)“國(guó)家毒理學(xué)計(jì)劃”研究表明，在蒽醌劑量超過170 mg/kg（相當(dāng)于藥典中推薦使用下限劑量的50倍）時(shí)可引起動(dòng)物肝、腎、膀胱等臟器腫瘤，以及脾、腎等組織器官病理學(xué)損傷[8]。由于此試驗(yàn)受試物為從原料藥中提取的蒽醌類物質(zhì)，且給藥劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于該原料在中藥或保健食品中的常規(guī)用量，既不能完全反映中藥原料藥中全部成分的作用，也不能適用于以少量、長(zhǎng)期食用為特點(diǎn)的保健食品。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外目前尚還沒有關(guān)于決明子長(zhǎng)期食用的安全評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)。因此，本研究進(jìn)行了SD大鼠經(jīng)口灌胃給予不同劑量的決明子52周，觀察給藥13、26、39、52周，給藥26周以及給藥52周后恢復(fù)4周出現(xiàn)毒性反應(yīng)的靶器官，闡明長(zhǎng)期食用決明子后是否存在安全性隱患。

在本實(shí)驗(yàn)中， 劑量設(shè)置依據(jù)為決明子凍干粉在能通過灌胃針的情況下，最大溶解度為10.0 g生藥/kg BW，將該劑量作為高劑量（相當(dāng)于人體用量96 g）；低劑量旨在不出現(xiàn)毒性，故低劑量組的設(shè)計(jì)參考藥典中規(guī)定的決明子人體推薦量下限值（9 g）的1/2，再根據(jù)大鼠相對(duì)于人的等效劑量6.25進(jìn)行換算，即0.5 g生藥/kg BW。中劑量則按照等比關(guān)系插入，即2.2 g生藥/kg BW。

在整個(gè)試驗(yàn)周期中，各給藥劑量組及對(duì)照組大鼠體重增長(zhǎng)速度呈現(xiàn)出一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系?？赡苤饕怯捎跊Q明子的瀉下作用，減少了腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收并增加了對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的排泄[18]；同時(shí)也與藥物劑量有關(guān)，提示決明子對(duì)大鼠體重有影響，有減肥的功效。

在給藥26周后，給藥組的TBIL指標(biāo)呈現(xiàn)出一定的有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P < 0.05或P < 0.01），有研究表明總膽紅素過低與缺鐵性貧血有關(guān)[19]，還有待進(jìn)一步觀察和研究。給藥52周后給藥組的血常規(guī)、血生化及離子指標(biāo)均趨于正常，提示決明子可能會(huì)引起輕度貧血，且是可逆的。

給藥52周后，在10.0 g生藥/kg BW劑量下發(fā)生大鼠腎臟近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)色素沉積，以及引起腎小管萎縮及再生等病理組織學(xué)改變，停藥恢復(fù)4周后，這種現(xiàn)象雖有所緩解但仍然存在。這表明長(zhǎng)期服用決明子在超過一定劑量時(shí)的毒性靶器官主要是腎臟，而在低劑量下是安全的。

綜上所述，在本試驗(yàn)室條件下，SD大鼠連續(xù)灌胃決明子凍干粉52周，其未觀察到損害作用的劑量為2.2 g生藥/kg BW（相當(dāng)于人體用量的8.8倍），在10.0 g生藥/kg BW劑量下（相當(dāng)于人體用量的18.2倍）的毒性靶器官主要是腎臟。中藥保健食品在我國(guó)的發(fā)展歷史相對(duì)短暫，其相關(guān)研究也開展得很少，尤其是對(duì)中藥原料長(zhǎng)期食用的安全性評(píng)價(jià)研究基礎(chǔ)薄弱，這一研究結(jié)果可為制訂含相關(guān)中藥原料保健食品的技術(shù)審評(píng)要點(diǎn)、申報(bào)指導(dǎo)原則等提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2017-01-11 本文編輯：蘇 暢）