產(chǎn)3-羥脯氨酸重組菌的構(gòu)建及發(fā)酵優(yōu)化

姚雪娜， 張震宇*， 孫付保， 陳 昶， 黃建華， 沈 松

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

產(chǎn)3-羥脯氨酸重組菌的構(gòu)建及發(fā)酵優(yōu)化

姚雪娜1，2，3， 張震宇*1，2，3， 孫付保1，2，3， 陳 昶1，2，3， 黃建華1，2，3， 沈 松1，2，3

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

順式-3-羥基-L-脯氨酸（順式-3-羥脯氨酸）可用于合成多種抗癌藥物，具有重要的商業(yè)價(jià)值，目前大多通過添加IPTG來誘導(dǎo)表達(dá)脯氨酸-3-羥化酶，采用兩步法生物合成順式-3-羥脯氨酸。作者通過目的基因優(yōu)化設(shè)計(jì)，引入強(qiáng)啟動子色氨酸串聯(lián)啟動子（Ptrp2）來避免異源表達(dá)時(shí)的誘導(dǎo)劑使用，構(gòu)建重組質(zhì)粒pES-Ptrp2-P3H，成功構(gòu)建了重組大腸桿菌BL21（DE3）/ pET21a-Ptrp2-P3H，優(yōu)化后的脯氨酸-3-羥化酶基因（P3H）改變了168個(gè)堿基，GC含量由原來的64.83%降低到49.31%。該菌在初步優(yōu)化培養(yǎng)基（葡萄糖1 g/dL，甘油0.125 g/dL，胰蛋白胨1.6 g/dL，（NH4）2SO40.5 g/dL，K2HPO40.1 g/dL，NaCl 0.2 g/dL，F(xiàn)eSO41 mmol/L，MgSO40.5 g/dL，CaCl20.015 g/dL，脯氨酸10 g/L，pH 7.5）上能一步法原位合成順式-3-羥脯氨酸，搖瓶發(fā)酵24 h，產(chǎn)量0.8 g/L，比優(yōu)化前提高一倍以上，為進(jìn)一步開展順-3-羥脯氨酸產(chǎn)業(yè)化提供了依據(jù)。

脯氨酸-3-羥化酶；順式-3-羥脯氨酸；密碼子優(yōu)化；重組菌構(gòu)建；發(fā)酵優(yōu)化

羥基-L-脯氨酸 （Hydroxyproline，Hyp，羥脯氨酸）為亞氨基酸，是L-脯氨酸羥基化后的產(chǎn)物。根據(jù)羥脯氨酸的羥基所在位置不同，可形成4種立體異構(gòu)體，分別是反式-4-羥脯氨酸、順式-4-羥脯氨酸、反式-3-羥脯氨酸和順式-3-羥脯氨酸。其中反式-4-羥脯氨酸最為常見，對哺乳動物骨膠原合成至關(guān)重要[1]，已被廣泛應(yīng)用于動物飼料、營養(yǎng)和美容業(yè)等許多行業(yè)；其次為反式-3-羥脯氨酸，它在I、II和III型骨膠原中含量較多，能通過脯氨酰-3-羥化酶的催化形成。相對地，順式羥脯氨酸比較少見，比如稀有的順式-3-羥脯氨酸[2]，現(xiàn)有資料證明它存在于產(chǎn)放線菌素、宜他霉素和遠(yuǎn)霉素等次級代謝物的微生物中[3]。

而為數(shù)不多的資料表明，順式-3-羥脯氨酸在許多領(lǐng)域均具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在醫(yī)藥領(lǐng)域，順式-3-羥脯氨酸可以直接作為治療腫瘤和膠原蛋白障礙的藥物[4]，并且該種氨基酸作為重要的手性合成子能夠用于合成許多藥物，如選擇性雄性受體調(diào)節(jié)劑BMS-564929[5]、碳?xì)涿瓜╊惪股?、血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑和解痙攣制劑等[6]。此外也可用于合 成 DNA 促 旋 酶 抑 制 劑 ， 如 plusbacin、cyclothialidine和tripropeptins等。在化學(xué)合成領(lǐng)域，順式-3-羥脯氨酸已用作重要的手性分子來合成倒千里光裂堿和流涎胺等。在不對稱合成領(lǐng)域，它還被直接用作有機(jī)催化劑。另外，順式-3-羥脯氨酸衍生物，如卡泊芬凈和Pneumocandin B0，還能作為抗真菌藥物使用[1]。但是由于順式-3-羥脯氨酸在自然界中含量極為稀少，導(dǎo)致其價(jià)格相當(dāng)昂貴（約3 800元/g），嚴(yán)重限制了在各領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其在醫(yī)藥領(lǐng)域，很多以順式-3-羥脯氨酸為前體合成的抗癌藥物才處于臨床試驗(yàn)階段，并不能滿足人類的需求。因此各國科研工作者都在研究順式-3-羥脯氨酸的生產(chǎn)方法。

目前，羥脯氨酸的生產(chǎn)方法主要有3種：水解法、化學(xué)合成法以及微生物轉(zhuǎn)化法。由于順式-3-羥脯氨酸在骨膠原中含量極少，因而無法通過常見的水解法獲得。已有報(bào)道顯示，可通過化學(xué)全合成或者差向異構(gòu)化反應(yīng)生成[6]。Surajit Sinha等人通過夏普勒斯不對稱環(huán)氧化反應(yīng)從丙氨酸出發(fā)，經(jīng)過十多步反應(yīng)合成順式-3-羥脯氨酸[2]；Navnath B.等人從D-谷氨酸出發(fā)，通過一系列化學(xué)反應(yīng)最終合成順式-3-羥脯氨酸，轉(zhuǎn)化率不足30%[4]。目前，這些化學(xué)法存在明顯不足：1）合成工序較為繁瑣和產(chǎn)率低；2）反應(yīng)過程中會用到一些有毒試劑；3）分離純化工藝復(fù)雜。因此，經(jīng)濟(jì)效益欠佳，難以工業(yè)化生產(chǎn)。

隨著微生物資源的開發(fā)和利用，研究者們逐步發(fā)現(xiàn)一些能夠合成順式-3-羥脯氨酸的微生物。1996年 HIDEO MORI等 人 發(fā) 現(xiàn) 鏈 霉 菌（Streptomyces sp.）TH1能夠產(chǎn)一種脯氨酸-3-羥化酶，該酶能夠?qū)⒂坞x的L-脯氨酸羥基化為順式-3-羥脯氨酸，接著他們發(fā)現(xiàn)脯氨酸-3-羥化酶還存在于包括產(chǎn)遠(yuǎn)霉素的鏈霉菌和芽孢桿菌等多種微生物體內(nèi)[8]，這也是在微生物中發(fā)現(xiàn)脯氨酸-3-羥化酶的首次報(bào)道。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該酶的羥基化活性需要2-酮戊二酸和O2的存在，把它歸為2-酮戊二酸依賴性加雙氧酶類。并且以發(fā)酵3 d的鏈霉菌TH1為酶源，在含L-脯氨酸、2-酮戊二酸、硫酸亞鐵、L-抗壞血酸和100 mmol/L TES buffer（pH 7.5）的反應(yīng)體系里能夠催化產(chǎn)生約174 μmol/L的順式-3-羥脯氨酸[9]。2009年，Robert M.等通過重組菌的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了脯氨酸-3-羥化酶在大腸桿菌中的異源表達(dá)，20 L發(fā)酵罐發(fā)酵8 h后，加入IPTG誘導(dǎo)，以收集的菌體為酶源，在10 L的反應(yīng)體系中60 h能夠催化產(chǎn)生約9.1 g/L的順式-3-羥脯氨酸[5]。2011年，德國研究者Christian klein等人直接向發(fā)酵液中添加底物L(fēng)-脯氨酸，800 mL培養(yǎng)基發(fā)酵3 d后能夠產(chǎn)生約305 mg的順式-3-羥脯氨酸[6]。在對脯氨酸-3-羥化酶基因（P3H）克隆后，異源表達(dá)時(shí)還需加入昂貴且有毒性的誘導(dǎo)劑IPTG，這并不適用于藥物蛋白質(zhì)和食用氨基酸的大規(guī)模生產(chǎn)[10]。而且，這些微生物發(fā)酵生產(chǎn)順式-3-羥脯氨酸主要采用分步法，即通過大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)獲得能夠產(chǎn)脯氨酸-3-羥化酶的菌體，以這樣的菌體為酶源，加入到合適的反應(yīng)體系中，催化L-脯氨酸為順式-3-羥脯氨酸。這種分步法可能是為了高產(chǎn)順式-3-羥脯氨酸，但生產(chǎn)工序偏長，投資和運(yùn)行成本偏高，且染菌風(fēng)險(xiǎn)增加。

作者嘗試開展微生物一步法合成順式-3-羥脯氨酸的研究工作，首先對脯氨酸-3-羥化酶基因進(jìn)行設(shè)計(jì)優(yōu)化，然后通過引入強(qiáng)啟動子色氨酸串聯(lián)啟動子（Ptrp2）來避免異源表達(dá)時(shí)誘導(dǎo)劑使用，接著構(gòu)建重組大腸桿菌，最后探討利用該菌株在發(fā)酵液中原位催化游離脯氨酸來一步法合成順式-3-羥脯氨酸的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 菌株 E.coli BL21（DE3）、E.coli JM109：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體PES：購于上海旭冠公司；表達(dá)載體pUC19、pET28a和pET21a：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 酶和試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRI、HindⅢ和BamHI：寶生生物工程有限公司；T4 DNA連接酶、1 kb DNA Marker、Premixed Protein Marker、DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量抽提試劑盒：上海生物工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基LB：胰蛋白胨1 g/dL，酵母膏0.5 g/dL，NaCl 1 g/dL，pH 7.0。初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1 g/dL，甘油0.5 g/dL，胰蛋白胨1 g/dL，（NH4）2SO40.5 g/dL，K2HPO40.1 g/dL，NaCl 0.2 g/dL，F(xiàn)eSO43 mmol/L，MgSO40.02 g/dL，CaCl20.015 g/dL，脯氨酸46 g/L，pH 7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脯氨酸-3-羥化酶基因的優(yōu)化 脯氨酸-3-羥化酶基因密碼子使用頻率分析由數(shù)據(jù)庫（http：// www.kazusa.or.jp/codon）完成。通過同義替換的方法消除一些在大腸桿菌中使用頻率低的密碼子，調(diào)整脯氨酸-3-羥化酶基因的GC含量，使其接近大腸桿菌的GC含量。利用密碼子優(yōu)化軟件Java Codon Adaptation Tool（JCAT）來對基因進(jìn)行評估。為便于基因操作，分別在脯氨酸-3-羥化酶基因的5’端設(shè)計(jì)了EcoRI、HindⅢ，3’端設(shè)計(jì)了BamHI酶切位點(diǎn)。同時(shí)利用RNAstructure軟件對其mRNA的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，保證起始密碼子ATG及其后的數(shù)個(gè)堿基組成的密碼子呈開環(huán)狀態(tài)，降低核糖體結(jié)合到mRNA上的能勢，使得核糖體能夠順利地沿著起始密碼子向后翻譯。優(yōu)化后的基因序列提交給上海旭冠公司合成。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 合成的基因連接到質(zhì)粒pES上 （pES-P3H），含色氨酸串聯(lián)啟動子的質(zhì)粒pUC19-Ptrp2-Hyp（作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建）經(jīng)EcoRI和HindⅢ酶切后，回收Ptrp2片段，與經(jīng)過同樣雙酶切的質(zhì)粒pES-P3H連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pESPtrp2-P3H。構(gòu)建過程見圖1。

圖1 pES-Ptrp2-P3H重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of the expression vector pES-Ptrp2-P3H

重組質(zhì)粒pES-Ptrp2-P3H經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后，回收Ptrp2-P3H片段，將該片段分別連接到pUC19、pET21a和pET28a質(zhì)粒上，構(gòu)建不同的重組質(zhì)粒pUC19-Ptrp2-P3H、pET21a-Ptrp2-P3H和pET28a-Ptrp2-P3H。對重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證正確后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）、E.coli JM109。

1.2.3 重組大腸桿菌的培養(yǎng) 重組大腸桿菌培養(yǎng)在含有相應(yīng)抗生素的平板上，37℃培養(yǎng)約10 h后長出單菌落，挑取單菌落，接種到含有相應(yīng)抗生素的30 mL（250 mL搖瓶）種子培養(yǎng)基LB中，220 r/min、37℃培養(yǎng)8 h，再按4%的接種體積分?jǐn)?shù)接種到30 mL（250 mL搖瓶）的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，于220 r/min、30℃培養(yǎng)12 h，測定發(fā)酵液中順式-3-羥脯氨酸的質(zhì)量濃度。

1.2.4 蛋白質(zhì)表達(dá)分析 取1 mL發(fā)酵液，8 000 g離心2 min，去上清液，用100 μL的去離子水重懸細(xì)胞。取上述細(xì)胞懸浮液10 μL，加入5×上樣緩沖液，混勻后，于沸水中煮約10 min，使細(xì)胞充分破碎，破碎的細(xì)胞在12 000 r/min離心2 min，取10 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5 全細(xì)胞酶活測定 取發(fā)酵液離心2 min（4℃、8 000 g），取10 g/dL細(xì)胞懸浮于5 mL、50 mmol/ L磷酸鹽緩沖液（pH 7.9）中，細(xì)胞懸浮液加入到50 mL的酶反應(yīng)液 （5 mmol/L L-抗壞血酸，1 mmol/L FeSO4·7H2O，90 mmol/L 2-酮戊二酸，90 mmol/L L-脯氨酸）中，30℃培養(yǎng)30 min后，轉(zhuǎn)移到100℃水浴中加熱2 min終止酶反應(yīng)，測定順式-3-羥脯氨酸的質(zhì)量濃度。

一個(gè)酶活單位 （U）定義為每分鐘催化得到1 nmol順式-3-羥脯氨酸的酶量。全細(xì)胞酶活是每毫克干菌體的酶活，單位為U/g，其中細(xì)胞干重DCW（g/L）=0.54×OD600。

1.2.6 發(fā)酵優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn) 按照1.2.3培養(yǎng)方法，對培養(yǎng)基的成分進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化的培養(yǎng)基的成分包括：底物L(fēng)-脯氨酸添加質(zhì)量濃度（1、5、10、20、40 g/L），不同有機(jī)氮源（酵母提取物、胰蛋白胨和玉米漿，質(zhì)量濃度分別為4、8、12、16、20 g/L），碳源（葡萄糖質(zhì)量濃度為10、15、20、25、30 g/L；甘油濃度為1、1.25、2.5、5 g/L），亞鐵離子質(zhì)量濃度（0、1、5、10 mmol/L）以及鎂離子質(zhì)量濃度（0.1、0.5、1、2 g/dL）。不同因素間進(jìn)行單獨(dú)研究，不考慮不同成分之間的交互影響。

1.2.7 順式-3-羥脯氨酸濃度測定 通過2，4-二硝基氟苯（DNFB）柱前衍生法[11]測定順式-3-羥脯氨酸的質(zhì)量濃度。發(fā)酵液離心后取上清液作為樣品。標(biāo)準(zhǔn)品或樣品用衍生緩沖液溶解，取待測樣品2 mL于10 mL棕色容量瓶中，加入1 mL衍生試劑，60℃避光水浴1 h，冷卻至室溫后用平衡緩沖液定容至10 mL。用0.45 μm的水系濾膜過濾。

HPLC系統(tǒng)包括：日立HPLC系統(tǒng)（輸液泵、紫外檢測器，柱溫箱，進(jìn)樣器，數(shù)字記錄及處理裝置），安捷倫ZORBA SB-Aq（150 mm×4.6 mm，5 μm），操作時(shí)柱溫控制在27℃。流動相A：乙酸鈉緩沖液（pH 6.5～6.8），流動相B：50%的乙腈水溶液。洗脫過程采用梯度洗脫：0～6 min，16%的 B相；6～7 min，40%的B相；7～15 min，100%的B相；15～16 min，40%的B相，16～25 min，16%的B相。

2 結(jié)果與分析

2.1 脯氨酸-3-羥化酶基因的優(yōu)化設(shè)計(jì)和合成

在大腸桿菌中進(jìn)行異源蛋白表達(dá)時(shí)，同義密碼子的使用頻率與基因的異源表達(dá)水平相關(guān)[15]。因此，首先通過基因優(yōu)化策略，將稀有密碼子替換為大腸桿菌常用密碼子，控制GC含量及脯氨酸-3-羥化酶基因mRNA二級結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)合成了一個(gè)適合在大腸桿菌中表達(dá)的脯氨酸-3-羥化酶基因，進(jìn)而確保脯氨酸-3-羥化酶的表達(dá)效率。脯氨酸-3-羥化酶基因序列的原始序列見GenBank：AF003371.1，脯氨酸-3-羥化酶基因全長873 bp，編碼290個(gè)氨基酸。在優(yōu)化脯氨酸-3-羥化酶基因前，通過Codon Usage Database數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行密碼子使用頻率分析，并比較其與大腸桿菌密碼子的使用頻率。結(jié)果顯示，來源于鏈霉菌TH1的脯氨酸-3-羥化酶基因部分密碼子使用頻率在大腸桿菌中都有不同程度的降低，如起始密碼子后的CGC，在鏈霉菌TH1中的使用頻率為34.4%，在大腸桿菌中的使用頻率為18.8%；TCG在鏈霉菌TH1中的使用頻率為13.7%，在大腸桿菌中的為 11.4%；CAC在鏈霉菌 TH1中為41.2%，在大腸桿菌中為7.2%。并且從5′端開始就出現(xiàn)了密碼子使用頻率差異較大的情況，不利于脯氨酸-3-羥化酶基因序列的翻譯表達(dá)。數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果還顯示，脯氨酸-3-羥化酶基因的GC含量為64.83%，高于大腸桿菌的GC含量（50.80%）。

基因優(yōu)化結(jié)果見表1。首先，通過同義替換的方法改變了稀有密碼子，脯氨酸-3-羥化酶基因的GC含量從64.83%降低到51.78%，更接近大腸桿菌的GC含量。在蛋白質(zhì)的表達(dá)過程中，基因序列5′末端的二級結(jié)構(gòu)會對蛋白質(zhì)的翻譯產(chǎn)生影響[12]，同時(shí)RNA 5′末端形成二級結(jié)構(gòu)所需要的能量也影響基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。因此利用RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件RNAstructure 5.3對其二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)脯氨酸-3-羥化酶基因的mRNA5′末端會形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，不利于翻譯的進(jìn)行。通過同義替換改變27個(gè)密碼子，使得脯氨酸-3-羥化酶基因的mRNA5′末端呈打開狀態(tài)，見圖2。自由能ΔG由開始的-243.5 kcal/ mol降低到-230.5 kcal/mol，促進(jìn)核糖體結(jié)合到mRNA上，并且順利地進(jìn)行翻譯。經(jīng)過優(yōu)化，共改變了187個(gè)脯氨酸-3-羥化酶的堿基，172個(gè)密碼子發(fā)生了變化，GC含量從64.83%降低到49.31%，更接近于大腸桿菌的GC含量。圖3為鏈霉菌TH1的脯氨酸-3-羥化酶基因序列與優(yōu)化后的脯氨酸-3-羥化酶基因序列的對比結(jié)果。

表1 脯氨酸-3-羥化酶基因優(yōu)化結(jié)果Table 1 Codon optimization process

2.2 重組大腸桿菌的構(gòu)建

2.2.1 組成型色氨酸串聯(lián)啟動子的引入 目前，順式-3-羥脯氨酸微生物合成過程用到的啟動子為IPTG誘導(dǎo)型啟動子，這不利于順式-3-羥脯氨酸作為前體用于合成藥物蛋白產(chǎn)品。因此，作者嘗試采用引入了一個(gè)強(qiáng)的啟動子 （色氨酸串聯(lián)啟動子）來提高mRNA產(chǎn)量，該策略避免使用有毒誘導(dǎo)劑IPTG同時(shí)，也有助于降低生產(chǎn)成本。作者所在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)合成的色氨酸串聯(lián)啟動子Ptrp2全長237 bp，5′端為EcoRI酶切位點(diǎn)，3′端為HindⅢ酶切位點(diǎn)。將色氨酸串聯(lián)啟動子Ptrp2插入到目的基因的上游后，轉(zhuǎn)化至E.coli JM109中，提取重組質(zhì)粒pES-Ptrp2-P3H。Ptrp2重組質(zhì)粒pES-Ptrp2-P3H經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后，得到1 117 bp和2 716 bp兩個(gè)片段，電泳結(jié)果見圖4。

經(jīng)DNA測序后，序列結(jié)果正確。

圖2 脯氨酸-3-羥化酶基因mRNA 5’末端二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.2 Potential mRNA secondary structures around the ATG start codon of the unadjusted gene and the adjusted gene

圖3 脯氨酸-3-羥化酶基因優(yōu)化前（上）與優(yōu)化后（下）的序列比對Fig.3 Alignment of nucleotide sequences between wild-type gene（upper）and the synthetic optimized（lower）

圖4 pES-Ptrp2-P3H雙酶切電泳結(jié)果Fig.4 EcoRI-BamHI Double digestion of pES-Ptrp2-P3H

2.2.2 重組大腸桿菌的構(gòu)建 外源基因在原核生物中高效表達(dá)除了要有合適的啟動子外，合適的質(zhì)粒也是影響蛋白質(zhì)表達(dá)的一個(gè)重要因素。為了得到高產(chǎn)順式-3-羥脯氨酸重組大腸桿菌，將連有色氨酸串聯(lián)啟動子的脯氨酸-3-羥化酶基因片段分別連接到質(zhì)粒pUC19、pET21a、pET28a上，構(gòu)建不同的重組質(zhì)粒pUC19-Ptrp2-P3H、pET21a-Ptrp2-P3H、pET28a-Ptrp2-P3H，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中，構(gòu)建不同的重組大腸桿菌。重組大腸桿菌經(jīng)過一段時(shí)間的發(fā)酵后，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖5。在約33 500的位置出現(xiàn)了目的條帶，表明在重組大腸桿菌中該酶得到了表達(dá)。

圖5 SDS-PAGE結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE

2.2.3 質(zhì)粒載體的優(yōu)化 宿主菌細(xì)胞類型對質(zhì)粒穩(wěn)定性有一定影響，質(zhì)粒的穩(wěn)定性又直接影響目的蛋白質(zhì)的表達(dá)。因此合適的質(zhì)粒是實(shí)現(xiàn)目的蛋白質(zhì)高效表達(dá)的一個(gè)重要因素。構(gòu)建4種不同的重組大腸桿菌，通過比較它們酶活高低，尋找到合適的宿主菌與質(zhì)粒的搭配。取發(fā)酵后的菌體，離心后收集菌體，在酶反應(yīng)緩沖液中30℃反應(yīng)30 min，測定4種不同重組大腸桿菌的酶活，結(jié)果見表2。從表2可以看出，重組大腸桿菌BL21/pET21a-Ptrp2-P3H的酶活最高，達(dá)到了722.807 U/g，與H Mori[8]等人的研究結(jié)果相比，酶活提高了約7倍。

表2 不同重組菌脯氨酸-3-羥化酶全細(xì)胞活性Table 2 Whole cell enzyme activity of different recombinant strains

2.3 重組菌一步法生產(chǎn)順式-3-羥脯氨酸的搖瓶發(fā)酵

2.3.1 重組大腸桿菌生長曲線的測定 種子培養(yǎng)是為了獲得足夠多生長代謝旺盛的活菌體。在本研究中，以酶活最高的重組大腸桿菌BL21（DE3）/ pET21a-Ptrp2-P3H為出發(fā)菌株，挑取一環(huán)單菌落接種于LB中，按1.2.3所述方法進(jìn)行種子培養(yǎng)。橫坐標(biāo)為種子的培養(yǎng)時(shí)間，縱坐標(biāo)為種子液OD600，生長曲線見圖6。

圖6 重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET21a-Ptrp2-P3H生長曲線Fig.6 Growth curve of recombinant E.coli BL21（DE3）/ pET21a-Ptrp2-P3H

從圖6可以看出，菌種接入種子培養(yǎng)基LB中4 h前后，開始進(jìn)入對數(shù)期，6～10 h為種子的對數(shù)期。一般在對數(shù)生長期內(nèi)菌體細(xì)胞的代謝活性、酶活性高而穩(wěn)定，因而對數(shù)生長期中后期的菌種為最佳。此后的發(fā)酵搖瓶試驗(yàn)，均選擇種齡為8 h的菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.3.2 搖瓶發(fā)酵單因素優(yōu)化 細(xì)菌的生長需要碳源、氮源、無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)。葡萄糖為菌體細(xì)胞的快速碳源，它的過量會形成TCA流溢現(xiàn)象，導(dǎo)致乙酸的過量累積[13]，抑制大腸桿菌的生長。同時(shí)碳源和氮源的比例[14]也會影響細(xì)胞生長和蛋白質(zhì)表達(dá)，最終影響順式-3-羥脯氨酸的產(chǎn)量。此外，各種離子的濃度對菌體生長、酶的表達(dá)都有不同的影響，順式-3-羥脯氨酸的產(chǎn)量還會隨著培養(yǎng)條件的變化而變化。因此，必須重視培養(yǎng)基各組分的含量。圖7為各單因素優(yōu)化結(jié)果。

其中圖7（a）為對底物L(fēng)-脯氨酸優(yōu)化結(jié)果，結(jié)果顯示，當(dāng)?shù)孜镌?～10 g/L的范圍內(nèi)時(shí)，順式-3-羥脯氨酸的產(chǎn)量隨著底物質(zhì)量濃度的升高而升高，但當(dāng)繼續(xù)增加底物時(shí)，順式-3-羥脯氨酸增幅明顯減小，因此底物適宜的添加量為10 g/L。

圖7（b）為氮源的種類和質(zhì)量濃度的優(yōu)化結(jié)果。結(jié)果顯示，以胰蛋白胨為有機(jī)氮源時(shí)，順式-3-羥脯氨酸產(chǎn)量高于其他兩組有機(jī)氮源，其中16 g/L胰蛋白胨為最優(yōu)，繼續(xù)增加胰蛋白胨質(zhì)量濃度，順式-3-羥脯氨酸質(zhì)量濃度反而下降。

圖7（c）為葡萄糖質(zhì)量濃度的優(yōu)化結(jié)果。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度低于15 g/L時(shí)，順式-3-羥脯氨酸的產(chǎn)量隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加而增加；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度大于15 g/L時(shí)，順式-3-羥脯氨酸的積累量開始下降。與葡萄糖相比，甘油的運(yùn)輸速度更低，使葡萄糖降解過程中碳通量降低，乙酸生成量大幅度降低。因此通過加入遲效氮碳源能夠達(dá)到既保證重組菌的生長速度，又高效控制目的蛋白質(zhì)的表達(dá)。以10 g/L的葡萄糖質(zhì)量濃度為速效碳源，對甘油質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖7（d）。可以看出，當(dāng)甘油添加量為1.25 g/L時(shí)，順式-3-羥脯氨酸的累積量最大。

圖7 單因素優(yōu)化結(jié)果Fig.7 Optimization of the concentration of L-proline，nitrogen sources，carbon source，glycerinum，ferrous ion and magnesium ion

由于脯氨酸-3-羥化酶要發(fā)揮羥基化活性需要一種重要的離子作為酶的輔助因子，即亞鐵離子，因此對亞鐵離子的濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖7（e）。當(dāng)發(fā)酵液中不添加亞鐵離子時(shí)，順式-3-羥脯氨酸的累積量能達(dá)到約250 mg/L左右，可能是由于胰蛋白胨中含有一定濃度的Fe2＋。隨著Fe2＋濃度的升高，順式-3-羥脯氨酸的累積量不斷升高，當(dāng)Fe2＋濃度為1 mmol/L時(shí)，順式-3-羥脯氨酸的質(zhì)量濃度最高，繼續(xù)增加Fe2＋濃度，順式-3-羥脯氨酸累積量逐漸減小。

重組大腸桿菌的發(fā)酵曲線表明，順式-3-羥脯氨酸的產(chǎn)量與菌體的濃度偶聯(lián)，適當(dāng)濃度的鎂離子能明顯促進(jìn)菌體的生長。因此，在重組大腸桿菌發(fā)酵過程中，補(bǔ)充適當(dāng)濃度的鎂離子對順式-3-羥脯氨酸的累積非常重要。鎂離子的濃度優(yōu)化結(jié)果見圖7（f）。鎂離子質(zhì)量濃度在0.01～0.05 g/dL間，順式-3-羥脯氨酸的質(zhì)量濃度隨鎂離子質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)鎂離子質(zhì)量濃度大于0.5 g/dL時(shí)，產(chǎn)酸隨著鎂離子質(zhì)量濃度的增加而減小。

優(yōu)化的培養(yǎng)基為：葡萄糖1 g/dL，甘油0.125 g/dL，胰蛋白胨 1.6 g/dL，（NH4）2SO40.5 g/dL，K2HPO40.1 g/dL，NaCl 0.2 g/dL，F(xiàn)eSO41 mmol/L，MgSO40.5 g/dL，CaCl20.015 g/dL，脯氨酸10 g/L。

2.3.3 重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)順式-3-羥脯氨酸按上述培養(yǎng)基對重組大腸進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)酸和OD600為縱坐標(biāo)繪制曲線，見圖8。可以看出，發(fā)酵24 h順式-3-羥脯氨酸能夠累積約0.80 g/L，產(chǎn)量提高了約2倍。

圖8 重組大腸桿菌發(fā)酵曲線Fig.8 Fermentation process curve of recombinant E.coli

3 結(jié)語

為了生產(chǎn)適用于藥物蛋白合成的順式-3-羥脯氨酸，作者通過引入色氨酸串聯(lián)啟動子成功構(gòu)建了一株高產(chǎn)順式-3-羥脯氨酸的重組大腸桿菌。該菌在初步優(yōu)化培養(yǎng)基（葡萄糖1 g/dL，甘油0.125 g/dL，胰蛋白胨1.6 g/dL，（NH4）2SO40.5 g/dL，K2HPO40.1 g/dL，NaCl 0.2 g/dL，F(xiàn)eSO41 mmol/L，MgSO40.5 g/dL，CaCl20.015 g/dL，脯氨酸 10 g/L，pH 7.5）上能一步法原位合成順式-3-羥脯氨酸，搖瓶發(fā)酵24 h順式-3-羥脯氨酸0.80 g/L，比優(yōu)化前發(fā)酵產(chǎn)量提高一倍以上，實(shí)現(xiàn)了“一鍋法”直接生產(chǎn)順式-3-羥脯氨酸，具有較好的工業(yè)化生產(chǎn)前景。

[1]BACH T M H，TAKAGI H.Properties，metabolisms，and applications of L-proline analogues[J].Appl Microbiol Biotechnol，2013，97：6623-6634.

[2]WENG Lushui，CHEN Fen，XIAO Guoying.Optimization and functionalverification ofCry2Aa gene[J].Journal of Agricultural Biotechnology，2013，21（11）：1261-1269.（in Chinese）

[3]SHIBASAKI T，MORI H，OZAKI A.Cloning of an isozyme of proline 3-hydroxylase and its purification from recombinant Escherichia coli[J].Biotechnology Letters，2000，22：1967-1973.

[4]KALAMKAR N B，KASTURE V M，DHAVALE D D.Total synthesis of natural cis-3-hydroxy-L-proline from D-glucose[J]. Tetrahedron Letters，2010，51：6745-6747.

[5]JOHNSTON R M，CHU L N，LIU M，et al.Hydroxylation of L-proline to cis-3-hydroxy-L-proline by recombinant Escherichia coli expressing a synthetic L-proline-3-hydroxylase gene[J].Enzyme and Microbial Technology，2009，45：484-490.

[6]KLEINlein C，HUTTEL W.A simple procedure for selective hydroxylation of L-proline and L-pipecolic acid with recombinantly expressed proline hydroxylases[J].Advanced Synthesis＆Catalysis，2011，353：1375-1383.

[7]GORRES K L，RAINES R T.Prolyl 4-hydroxylase[J].Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology，2010，45（2）：106-124.

[8]MORIori H，SHIBASAKI Y，OCHIAI K，et al.Detection of novel proline 3-hydroxylase activities in streptomyces and Bacillus spp.by regio-and stereospecific hydroxylation of L-proline [J].Applied and Environmental Microbiology，1996，62：1903-1907.

[9]MORI H，SHIBASAKI Y，YANO K.Purification and cloning of a proline 3-hydroxylase，a novel enzyme which hydroxylates free L-proline to cis-3-hydroxy-L-proline[J].Journal of Bacterilogy，1997，179：5677-5683.

[10]MIROUX B，WALKER J E.Over-production of proteins in Escherichia coli：mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels[J].Journal of Molecular Biology，1996，260（3）：289-298.

[11]LI Dong，SUN Jiayi.Determination of 18 kinds of amino acids by HPLC with precolumn 2，4-dinitrofluorobenzene derivatization [J].Chemical Analysis and Meterage，2004，13（1）：289-298.（in Chinese）

[12]ZHENG Zhongcheng.RNA secondary structure prediction algorithms[J].Chemical of Life，2000，20（4）：176-178.（in Chinese）

[13]HAN K，LIM H C，HONG J.Acetic acid formation in Escherichia coli fermentation[J].Biotechnology and Bioengineering，1992，39（6）：663-671.

[14]CHEN G，STREVETT K A.Impact of carbon and nitrogen condition on E.coli surface thermodynamics[J].Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2003，28（2-3）：135-146.

Construction of Recombinant Escherichia coli Strains Producing cis-3-Hydroxyproline and Preliminary Optimization of the Fermentation Conditions

YAO Xuena1，2，3， ZHANG Zhenyu*1，2，3， SUN Fubao1，2，3， CHEN Chang1，2，3， HUANG Jianhua1，2，3， SHEN Song1，2，3
（1.SchoolofBiotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.Key Laboratory ofIndustrial Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology，Ministry of Education，Wuxi 214122，China）

The cis-3-hydroxy-L-proline can be used to synthesize many anticancer drugs with important commercial value.At present，cis-3-hydroxyproline is produced with IPTG-inducible recombinants in two steps.The subject of this study is to construct a recombinant with high proline-3-hydroxylase activity and generate cis-3-hydroxyproline without adding IPTG which is expensive and toxic.We constructed the recombinant plasmid pES-Ptrp2-P3H and transformed E.coli BL21 （DE3）successfully.Compared with the original gene sequence of proline 3-hydroxylase，168 nucleotides were changed and the GC percentage was reduced from 64.83%to 49.31%.The preliminarily optimized medium was 1 g/dL glucose，0.125 g/dL glycerinum，1.6 g/dLtryptone，0.5 g/dL（NH4）2SO4，0.1 g/dL K2HPO4，0.2 g/dL NaCl，1 mmol/L FeSO4，0.5 g/dL MgSO4，0.015 g/dL CaCl2，10 g/L L-proline，and pH valve at 7.5.At shaking flask level，cis-3-hydroxyproline was accumulated to about 0.8 g/L in 24 h，which was one times higher than before.It provides the basis for the industrialization of cis-3-hydroxyproline bioproduction.

proline-3-hydroxylase，cis-3-hydroxyproline，codon optimization，construction of recombinant Escherichia coli，fermentation optimize

Q 815

A

1673—1689（2017）03—0243—09

2015-02-15

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30800018；30970058）；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK2012554）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（200802951036）；工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任基金項(xiàng)目（KLIB-ZR200801）。

*通信作者：張震宇（1976—），男，江蘇張家港人，理學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事微生物產(chǎn)品的制備技術(shù)和發(fā)酵工藝方面的研究。E-mail：zhangzy@jiangnan.edu.cn

姚雪娜，張震宇，孫付保，等.產(chǎn)3-羥脯氨酸重組菌的構(gòu)建及發(fā)酵優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（03）：243-251.