殼聚糖和pH對CHO細胞收獲液澄清效率的影響

翁源燦， 楊 彬， 程習文， 鄢成偉， 孫文正

（廣東東陽光藥業(yè)有限公司，廣東 東莞 523867）

殼聚糖和pH對CHO細胞收獲液澄清效率的影響

翁源燦， 楊 彬*， 程習文， 鄢成偉， 孫文正

（廣東東陽光藥業(yè)有限公司，廣東 東莞 523867）

作者研究了殼聚糖和pH對中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary，CHO）培養(yǎng)液料液澄清過程的影響。初步探索了在CHO細胞收獲液（pH 7.0）中添加0～0.10 g/dL殼聚糖對0.22 μm膜過濾通量的影響。結(jié)果顯示，添加0.06 g/dL殼聚糖時膜過濾通量最大，達到8 266.22 L/（m2·h）。探索了pH值（5.0～7.0）對收獲液澄清效率的影響，研究發(fā)現(xiàn)，不添加殼聚糖的情況下降低培養(yǎng)液pH值對膜過濾通量沒有十分顯著的提高。為更多地去除宿主細胞蛋白 （Host Cell Protein，HCP）和殘留DNA，作者研究了pH值與殼聚糖對膜過濾通量及殘留雜質(zhì)的交互影響。結(jié)果表明，pH為5.0殼聚糖質(zhì)量濃度為0.06 g/dL時濾出液中殘留DNA幾乎完全去除，HCP含量降低50%以上，而抗體的回收率不受影響。

殼聚糖；pH；CHO；絮凝；料液澄清

中國倉鼠卵巢（CHO）細胞是外源真核基因的最佳表達系統(tǒng)之一，也是生物制藥中最常用的哺乳動物細胞[1-3]，外源蛋白質(zhì)容易在CHO細胞中合成并分泌到培養(yǎng)基中[4]。在發(fā)酵法生產(chǎn)中，發(fā)酵液中存在大量細胞、細胞代謝物、剩余培養(yǎng)基以及表達產(chǎn)物組分以外的其他復雜組分。所以在提取精制之前必須進行預處理和過濾以除去這些干擾物質(zhì)[5-6]。目前比較常用的預處理方法是離心過濾，然而發(fā)酵液中有大量的細胞碎片，HCP、DNA密度與水相近，離心并不能去除，所以需要往發(fā)酵液中加入絮凝劑[7]，通過吸附架橋作用將小顆粒群或已經(jīng)凝結(jié)的小絮團結(jié)合成大絮團，增加顆粒密實度，以利于離心去除，從而改善發(fā)酵液過濾性能[8]。

殼聚糖作為一種天然的陽離子吸附劑，本身無毒、無味，不會造成二次污染，是絮凝和回收蛋白質(zhì)的理想絮凝劑[9]。脫乙酰基時間越長，殼聚糖脫乙酰度越高，相對分子質(zhì)量越低。一般而言，殼聚糖相對分子質(zhì)量越大，黏度也越大，絮凝效率也越高[8]。目前關于哺乳動物細胞發(fā)酵液通過添加絮凝劑進行料液澄清的研究比較少，生產(chǎn)用途的更少[10]。作者以殼聚糖為絮凝劑，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值，研究其對絮凝發(fā)酵液的影響，尋找一種高效的料液澄清的方法來簡化下游處理步驟，以提高效率，降低成本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表達單抗的CHO細胞培養(yǎng)收獲液：活細胞密度1.90×107/mL，細胞活力90%左右，作者所在實驗室培養(yǎng)；脫乙酰度≥90.0的殼聚糖溶液：浙江金殼藥業(yè)；AR級鹽酸：成都科龍化工；WZT-2000型光電濁度計：上海勁佳儀器；L720R-3型高速冷凍離心機：湘離離心機；0.22 μm孔徑針頭濾器：Millipore；色譜柱：applied biosystems；CHO細胞宿主蛋白抗原標準品、抗CHO細胞宿主蛋白一抗、山羊抗CHO宿 主 蛋 白 HRP 酶 標 二 抗 ：CYGNUS THCHNOLOGIES；微量核酸提取試劑盒：天根。

1.2 實驗方法

1.2.1 殼聚糖單因素試驗 將細胞收獲液分別添加不同質(zhì)量濃度殼聚糖，控制相同pH，130 r/min攪拌30 min，4 000 g離心20 min、0.22 μm孔徑膜過濾、Protein A處理。

1.2.2 pH值單因素試驗 將細胞收獲液調(diào)節(jié)不同pH值，130 r/min攪拌30 min，4 000 g離心20 min、0.22 μm孔徑膜過濾、Protein A處理。

1.2.3 pH（5.0、6.0、7.0）與殼聚糖質(zhì)量濃度（0.02、0.04、0.06 g/dL）兩因素三水平全因子試驗 130 r/min攪拌30 min，4 000 g離心20 min、0.22 μm孔徑膜過濾、Protein A處理。

1.2.4 分析方法 發(fā)酵液濁度的測定：WZT-2000型光電濁度計檢測；抗體濃度的測定：HPLC法檢測；HCP的測定：ELISA法檢測；殘留DNA的測定：實時熒光定量PCR法檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖單因素實驗結(jié)果

殼聚糖單因素實驗結(jié)果見圖1。在收獲液pH 7.0，殼聚糖終質(zhì)量濃度0～0.1 g/dL范圍內(nèi)，收獲液經(jīng)離心后的濁度與殼聚糖質(zhì)量濃度明顯呈反比，最高降低60%。離心后的收獲液用0.22 μm孔徑濾器過濾，通量顯著提高，質(zhì)量濃度為0.06 g/dL時通量最高，達497.81 L/（m2·h），說明殼聚糖添加量的提高可以使收獲液中更多的微粒被聚集為大顆粒，離心效果更明顯。而當質(zhì)量濃度為0.1 g/dL時，收獲液粘度增大，過濾通量反而下降，抗體回收率無明顯影響，均在90%左右。

2.2 pH值單因素實驗結(jié)果

pH單因素實驗結(jié)果見圖2。pH值在5.0～7.0間變化，對離心后收獲液濁度及過濾通量影響不明顯，其中在pH 5.0的濁度稍微降低，過濾通量提高了，抗體回收率無明顯差異，說明單純的改變pH值對收獲液的澄清效率并不起明顯的作用。

圖1 殼聚糖質(zhì)量濃度影響效果實驗Fig.1 Effect of chitosan concentration experiment

圖2 pH值影響效果實驗Fig.2 Effect of pH experiment

2.3 pH與殼聚糖全因子試驗結(jié)果

pH （5.0、6.0、7.0）與殼聚糖質(zhì)量濃度（0.02、0.04、0.06 g/dL）全因子試驗結(jié)果用Minitab統(tǒng)計軟件分析，結(jié)果見圖3。主效應圖3（a），收獲液離心后濁度隨著pH降低和殼聚糖質(zhì)量濃度的增加均有降低的趨勢，圖3（b）中0.22 μm孔徑膜過濾通量隨著pH降低和殼聚糖質(zhì)量濃度的增加亦有顯著的提高，圖3（c）中顯示pH的降低會降低膜過濾后產(chǎn)品收率，而不同殼聚糖質(zhì)量濃度對抗體收率沒有明顯的影響，圖3（d）中pH的降低和殼聚糖質(zhì)量濃度的增加明顯降低收獲液中HCP的質(zhì)量濃度，圖3（e）中降低pH的收獲液，其殘留DNA質(zhì)量濃度更高，而隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的增加，DNA質(zhì)量濃度明顯降低。

圖3 主效應圖Fig.3 Main effect diagram

在交互作用圖4（a）中，當pH為5.0、殼聚糖質(zhì)量濃度為0.06 g/dL時，收獲液離心后濁度最低；圖4（b）中，當pH為5.0、殼聚糖質(zhì)量濃度為0.06 g/dL時，0.22 μm孔徑膜過濾通量最高；圖4（c）中可以看出，在殼聚糖質(zhì)量濃度為0.02 g/dL和0.04 g/dL時，隨著pH降低，產(chǎn)品回收率有下降的趨勢；圖4（d）顯示，殼聚糖質(zhì)量濃度為0.06 g/dL時，收獲液HCP質(zhì)量濃度降低更明顯，當pH降低到5.0時，HCP質(zhì)量濃度更低，在圖4（e）中，當pH降低時，收獲液殘留DNA質(zhì)量濃度更高，而隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的增加，DNA質(zhì)量濃度逐漸降低。

圖4 交互作用圖Fig.4 Interaction diagram

試驗結(jié)果表明，在不同的pH條件下，殼聚糖對收獲液澄清效率有著相同的趨勢；在不同殼聚糖質(zhì)量濃度下，pH對收獲液澄清效率也有著相同的趨勢。在交互作用圖中可以看出，不同條件組合的產(chǎn)生影響的趨勢明顯不同，說明在收獲液澄清方面，pH與殼聚糖之間有互相促進作用。當pH降低時，殼聚糖被質(zhì)子化，絮凝性能提高，更多的聚集了HCP，但同時低pH條件下，細胞死亡率更高，釋放出更多的DNA，導致收獲液中殘留DNA質(zhì)量濃度相對較高。

3 結(jié)語

殼聚糖具有良好的生物相容性和可降解性，其結(jié)構與細菌細胞壁上的肽聚糖類似，可被體內(nèi)的溶菌酶及水解酶等降解成葡萄糖胺或殼寡糖[12]，對核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)都有吸附能力，其帶正電[13]，是一種很好的天然吸附劑。參照張明政[12]研究的方法，模擬CHO收獲液收獲時的pH值，初步摸索殼聚糖質(zhì)量濃度和pH值對收獲液澄清效率的單一影響，發(fā)現(xiàn)單獨改變殼聚糖質(zhì)量濃度或pH值，其效果并非最優(yōu)。組合后發(fā)現(xiàn)，不同組合之間效果差異明顯，也優(yōu)于單因素效果，綜合分析后確定該細胞收獲液的最佳絮凝條件：pH 5.0、殼聚糖質(zhì)量濃度0.06 g/dL。濁度可降低70 NTU以上，膜過濾通量顯著提高，抗體回收率無明顯影響，HCP質(zhì)量濃度降低一倍，DNA幾乎完全去除，結(jié)果趨勢與文獻提到的基本吻合。

通過殼聚糖對CHO細胞發(fā)酵液的絮凝處理，可以去除大量有色物質(zhì)，添加殼聚糖后攪拌過程中，發(fā)酵液逐漸產(chǎn)生乳白色絮狀物，離心后澄清液比對照顏色更淺，隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的增加，顏色差異更明顯。然而當殼聚糖質(zhì)量濃度達到發(fā)酵液的0.1 g/dL時，其粘度增大，過濾性能并非最優(yōu)。pH較低時，收獲液中HCP容易沉淀析出，易于分離。DNA在正常pH條件下帶較強的負電荷，實驗結(jié)果表明，pH與殼聚糖能對收獲液澄清效率產(chǎn)生交互影響，在稀酸溶液中殼聚糖因質(zhì)子化而帶更多的正電荷，從而提高絮凝性能[15]，因此澄清效果更好。殼聚糖具有抗菌性能[16]、生物粘附性[17]等，其抗菌性可能對該發(fā)酵液防止微生物污染有一定的作用。生物粘附性可能會增加藥物在體內(nèi)的滯留時間，從而提高藥物的利用效率[14]。

[1]HU Xianwen，CHEN Huipeng，ZHANG Shuyong.Overview of global biopharmaceutical industry[J].Chin Med Biotechnol，April，2009，4（2）：85-89.（in Chinese）

[2]LIM Y，WONG N S C，LEE Y Y，et al.Engineering mammalian cells in bioprocessing-current achievements and future perspectives[J].Biotechnology and Applied Biochemistry，2010，55（4）：175-189.

[3]CHU L，ROBINSON D K.Industrial choices for protein production by large-scale cell culture[J].Curr Opin Biotechnol，2001，12：180-187.

[4]LI Shichong，HUANG Peitang，CHEN Zhaolie.New technique of expression in Chinese hamster ovary cells[J].Letters in Biotechnology，2009，20（3）：422-425.（in Chinese）

[5]BELFORT G，DAVIS R H，ZYDNEY A L.The behavior of suspensions and macromolecular solutions in crossflowmicrofiltration[J].Journal of Membrane Science，1994，96（1-2）：1-58.

[6]NOBBLE R D，STERN S A.Membrane Separation Technology：Principles and Applications[M].Amsterdam：Elsevier Science，1995：353-413.

[7]JABER J，MOYA W，HAMZIK J，et al.Stimulusresponsive polymers for the purification of biomolecules[P].US Patent：2011/ 0313066 A1，2011-12-22.

[8]SHI Yajing，ZHAO Yongqiang，WANG Cong，et al.Research of flocculant and its application in pretreatment of pharmaceutical ferment liquid[J].Pharmaceutical Engineering Design，2009，20（10）：1.（in Chinese）

[9]LIU Bingtao，ZHANG Yan，WANG Hairong.On the flocculation and recovery of protein water with chitosan[J].Journal of North China Institute of Water Conservancy and Hydroelectric Power，2005，26（4）：69-71.（in Chinese）

[10]HUA Rongrong，ZHOU Gongming，CAO Dawei.Research advances in flocculation properties of Chitosan[J].Chemical Industry and Engineering Progress，2008，27（3）：335-339.（in Chinese）

[11]GOTTSCHALK U.Process Scale Purification of Antibodies[M].Hoboken NJ：John Wiley&Sons，2009：23.

[12]程沁園.殼聚糖止血活性及其生物安全性評價研究[D].無錫：江南大學，2013.

[13]AKEPRATHUMCHAI S，HAN B，WICKRAMASINGHE S R，et al.Murine leukemia virus clearance by flocculation and microfiltration[J].Biotechnol Bioeng，2004，88（7）：880-889.

[14]ZHANG Mingzheng，LIU Bo，LIN Naiquan，et al.Factors affecting flocculation of fermentation broth of Bacillus thuringiensis by chitosan[J].Chinese Journal of Biological Control，2009，25（2）：133-137.（in Chinese）

[15]DONG Rui，ZHOU Jian，DONG Maomao，et al.Research progress and prospect of chitosan flocculating microalgae[J].Environmental Science&Technology，2014（1）：88-93.（in Chinese）

[16]ZHENG Lianying，ZHU Jiangfeng，SUN Kunshan.Antimicrobial activity of chitosan[J].Materials Science and Engineering，2000，18（2）：22-24.（in Chinese）

[17]JIN Meixia，HU Qiaohong.The properties of chitosan and its application in bioadhesive drug delivery system[J].Central South Pharmacy，2008，6（3）：324-327.（in Chinese）

Effect of Chitosan and pH on Clarification Process Efficiency of Harvested CHO Cell Culture Fluid

WENG Yuancan， YANG Bin*， CHENG Xiwen， YAN Chengwei， SUN Wenzheng
（Sunshine Lake Pharma Co.，Ltd，guangdong dongguan 523867，China）

Chitosan is a natural，non-toxic and biodegradable flocculant.This study focused on determining and optimizing the clarification process efficiency in the presence of various concentrations（0～0.10 g/dL）of chitosan at different pH 5.0～7.0 for the harvested Chinese hamster ovary （CHO）cell culture fluid （HCCF）（pH 7.0）.Following HCCF was treated with 0.06 g/dL chitosan，the filtration flux was achieved up to 8 266.22 L/（m2·h）using 0.22 μm filter.In addition，the result showed that similar filtration flux for HCCF at different pH without chitosan addition whereas increasing filtration flux was achieved when HCCF pre-treated with chitosan at decreasing pH.To further improve this clarification process，the combined effect of various concentrations of chitosan at different pH on the filtration flux and the removal of process impurities including host cell proteins （HCP）and residual DNA in HCCF was evaluated.The result of a full factorial experiment including two factors and three levels（chitosan at 0.02，0.04，0.06%and pH at 5，6，7）showed that 90%antibody product yield with nearly complete removal of residual DNA and 50%more reduction of HCP were obtained when HCCF pre-treated with the optimal 0.06 g/dL chitosan at pH 5.0.

chitosan，pH，CHO，flocculation，centrifugal filtration

TS 202.3

A

1673—1689（2017）03—0322—05

2015-03-18

廣東省引進創(chuàng)新科研團隊計劃項目（201101Y0104990178）。

＊通信作者：楊 彬（1981—），男，湖北鄂州人，理學碩士，主要從事生物制藥方面的研究。E-mail：yangbin@hecpharm.com

翁源燦，楊彬，程習文，等.殼聚糖和pH對CHO細胞收獲液澄清效率的影響[J].食品與生物技術學報，2017，36（03）：322-326.