基因組編輯技術(shù)及其安全管理

沈平，章秋艷，楊立桃，張麗，李文龍，梁晉剛，李夏瑩，王顥潛，沈曉玲，宋貴文

（1農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100122；2農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191；3上海交通大學(xué)，上海 200240；4中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074；5天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，天津 300381）

基因組編輯技術(shù)及其安全管理

沈平1，章秋艷2，楊立桃3，張麗4，李文龍1，梁晉剛1，李夏瑩1，王顥潛1，沈曉玲5，宋貴文1

（1農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100122；2農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191；3上海交通大學(xué)，上海 200240；4中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074；5天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，天津 300381）

基因組編輯技術(shù)利用核酸酶對(duì)生物體內(nèi)的DNA雙鏈進(jìn)行斷裂，并以非同源末端連接或同源重組的方式對(duì)基因組DNA特定位點(diǎn)進(jìn)行突變、缺失或者基因的插入與替換。鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶、成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列是目前基因組編輯技術(shù)應(yīng)用中的3種關(guān)鍵核酸酶。基因組編輯技術(shù)已在植物基因功能、育種等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，特別是基于成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列的基因編輯技術(shù) CRISPR-Cas9。具有優(yōu)良性狀的基因組編輯大豆、玉米等產(chǎn)品已逐步從實(shí)驗(yàn)室走向田間，基因組編輯作物展現(xiàn)了較傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因作物更為優(yōu)越的應(yīng)用前景。本文簡(jiǎn)要概述了主要使用的3種基因組編輯技術(shù)及其原理。對(duì)這些技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了分析，并依據(jù)物種分類(lèi)梳理了利用上述3種技術(shù)在動(dòng)物、植物中突變體建立、基因功能研究、分子育種等方面的研究進(jìn)展。同時(shí)，針對(duì)基因編輯產(chǎn)物的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景，討論了基因編輯技術(shù)及其產(chǎn)品較傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)，分析了基因編輯技術(shù)及其產(chǎn)品可能因脫靶效應(yīng)而引發(fā)的生物安全風(fēng)險(xiǎn),介紹了美國(guó)、歐盟等國(guó)家對(duì)基因編輯技術(shù)及其產(chǎn)品安全管理和商業(yè)化應(yīng)用的政策。文章結(jié)合中國(guó)現(xiàn)行法規(guī)對(duì)轉(zhuǎn)基因生物的定義及安全評(píng)價(jià)（實(shí)質(zhì)等同、個(gè)案分析）原則，討論了基因編輯技術(shù)及其產(chǎn)品的安全管理，初步提出了基于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)框架的基因編輯產(chǎn)品的安全評(píng)價(jià)和管理思路。針對(duì)基因編輯產(chǎn)品需要按照個(gè)案原則進(jìn)行評(píng)價(jià)和管理，安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)開(kāi)展分子特征及食用安全評(píng)價(jià)；同時(shí)需要針對(duì)基因編輯技術(shù)的特點(diǎn)建立更加有效、特異的檢測(cè)新方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因編輯產(chǎn)品的有效監(jiān)測(cè)，以促進(jìn)基因組編輯產(chǎn)品的商業(yè)化應(yīng)用。

基因組編輯；轉(zhuǎn)基因生物；安全監(jiān)管

隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生物體基因組精確編輯的多種基因組編輯（genome editing）技術(shù)相繼出現(xiàn)?？蓪?duì)生物體基因組進(jìn)行精確地敲除、插入或置換的這些技術(shù)已被用于動(dòng)物、植物基因組的改造，作為一種新型技術(shù)展現(xiàn)出在基因工程技術(shù)育種中的巨大潛力。基因組編輯技術(shù)為“按需定制”的新型分子育種提供了技術(shù)保障，將會(huì)廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)育種?；蚪M編輯技術(shù)雖然具有高精確性，但由于其脫靶效應(yīng)的存在，可能為基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品帶來(lái)潛在的安全性問(wèn)題，也為基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品的安全管理帶來(lái)新的挑戰(zhàn)。

1 基因組編輯技術(shù)簡(jiǎn)介

基因組編輯技術(shù)是指對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾和改變的技術(shù)。該技術(shù)主要利用序列特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和非特異性的 DNA修飾結(jié)構(gòu)域組合而成的序列特異性核酸內(nèi)切酶（sequence specific nuclease, SSN）在基因組特定位置對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行定向切割，進(jìn)而激活細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)能來(lái)實(shí)現(xiàn)基因敲除、定點(diǎn)插入或替換等定向改造[1]。這種技術(shù)能夠在不改變目標(biāo)生物基因組整體穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，在目標(biāo)位點(diǎn)產(chǎn)生堿基缺失或插入，實(shí)現(xiàn)對(duì)單一或多個(gè)性狀的消除或獲得，研究基因的功能，進(jìn)而應(yīng)用于生物育種、臨床治療等領(lǐng)域。

目前，基因編輯技術(shù)主要有：鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）[2]、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）系統(tǒng)[3]、規(guī)律成簇的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/ CRISPR關(guān)聯(lián)蛋白（CRISPR-associated proteins，Cas）系統(tǒng)[4]、格氏嗜鹽堿桿菌的 Argonaute蛋白（Natronobacterium gregoryi Argonaute, NgAgo）核酸酶[5]和結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的內(nèi)切酶（structure-guided nuclease，SGN）系統(tǒng)[6]等，其基本原理是核酸內(nèi)切酶在基因組的特定位點(diǎn)切割DNA雙鏈，然后利用細(xì)胞自身的DNA損傷應(yīng)答機(jī)制，以同源重組修復(fù)（homologydirected repair，HDR）或非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）的方式修復(fù)斷裂DNA雙鏈，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的插入、一個(gè)或多個(gè)堿基的缺失或替換，使目的基因的功能發(fā)生改變。上述5種基因組編輯技術(shù)的主要區(qū)別在于對(duì)序列的靶向識(shí)別方式和機(jī)制。ZFNs和 TALEN是利用蛋白與DNA結(jié)合方式靶向特定的基因組位點(diǎn)，而CIRISPR/ Cas9、NgAgo和 SGN系統(tǒng)則利用簡(jiǎn)單的核苷酸互補(bǔ)配對(duì)方式識(shí)別結(jié)合基因組靶位點(diǎn)。

ZFNs是經(jīng)過(guò)人工改造的核酸內(nèi)切酶，由特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和非特異性切割域核酸內(nèi)切酶FokⅠ兩部分組成。結(jié)合結(jié)構(gòu)域由一系列串聯(lián)的具有Cys2-His2結(jié)構(gòu)的鋅指蛋白構(gòu)成[2]。每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別并結(jié)合一個(gè)特異的堿基三聯(lián)體，結(jié)合域能識(shí)別一段 9—12 bp的堿基序列。在基因組靶標(biāo)位點(diǎn)左右兩邊各設(shè)計(jì)1個(gè)ZFN，識(shí)別結(jié)構(gòu)域會(huì)將2個(gè)ZFN結(jié)合到特定靶點(diǎn)，當(dāng)2個(gè)識(shí)別位點(diǎn)間距為6—8 bp時(shí)，2個(gè)FokⅠ單體相互作用形成二聚體，行使酶切功能對(duì)目標(biāo) DNA雙鏈進(jìn)行切割，實(shí)現(xiàn)基因組編輯。

TALEN的構(gòu)成與ZFN相似，由改造的TALE蛋白 DNA結(jié)合域和 FokⅠ核酸酶兩部分融合而成，TALEN蛋白最初來(lái)源于黃單胞桿菌。TALEN和ZFNs的差別在于特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其DNA結(jié)合域由13—28個(gè)串聯(lián)的具有DNA識(shí)別特異性的高度保守的重復(fù)單元組成。每個(gè)重復(fù)單元含有大約34個(gè)氨基酸，且不同單元的氨基酸序列非常保守，僅第12和13位氨基酸不同。這兩個(gè)可變氨基酸被稱(chēng)為重復(fù)可變的雙氨基酸殘基（repeat variable-diresidue，RVD），它們決定重復(fù)單元的DNA識(shí)別特異性。TALEN根據(jù)靶標(biāo)位點(diǎn)兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)一對(duì)TALEN，結(jié)合到對(duì)應(yīng)的識(shí)別位點(diǎn)后，2個(gè) FokⅠ單體相互作用形成二聚體，對(duì)靶標(biāo)序列進(jìn)行切割，實(shí)現(xiàn)基因修飾[3]。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)基于細(xì)菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機(jī)制而產(chǎn)生，由CRISPR和及其相關(guān)Cas蛋白組成。該系統(tǒng)先產(chǎn)生與靶標(biāo)序列對(duì)應(yīng)的RNA序列，與病毒或質(zhì)粒的DNA互補(bǔ)形成RNA-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)，然后引導(dǎo) Cas9內(nèi)切酶對(duì)目的DNA雙鏈進(jìn)行切割，使DNA雙鏈斷裂，進(jìn)而對(duì)基因組進(jìn)行編輯[4]。靶序列通常由23個(gè)堿基組成，包括與小向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA）堿基配對(duì)的前20個(gè)堿基，以及3'端Cas9識(shí)別的三核苷酸NGG序列PAM（protospacer adjacent motifs，PAM）。Cas9切割位點(diǎn)位于PAM上游3nt處。靶序列的結(jié)合特異性是由sgRNA和PAM序列共同決定的。Cas9蛋白不需要形成蛋白二聚體起作用，而向?qū)NA（guide RNA，gRNA）通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)決定靶序列的特異性。因此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)大大降低了技術(shù)門(mén)檻，一經(jīng)面世就迅速得到廣泛應(yīng)用。

NgAgo-gDNA系統(tǒng)的工作原理與 CRISPR-Cas9類(lèi)似，都是在引導(dǎo)序列的引導(dǎo)下，核酸酶對(duì)特定位點(diǎn)的基因序列進(jìn)行切割，從而進(jìn)行基因編輯。不同的是NgAgo-gDNA系統(tǒng)中的內(nèi)切酶是源自格氏嗜鹽堿桿菌的 Argonaute蛋白，引導(dǎo)工具是一段引導(dǎo) DNA（guideDNA，gDNA）[5]。

SGN系統(tǒng)利用了一種能識(shí)別3′flap結(jié)構(gòu)的內(nèi)切酶FEN1（flapstructure-specific endonuclease1）。FEN1與Fn1（FokⅠ）的剪切結(jié)構(gòu)域結(jié)合起來(lái)可以識(shí)別靶序列與gDNA形成的3′flap結(jié)構(gòu)，通過(guò)Fn1二聚化對(duì)靶序列進(jìn)行切割，實(shí)現(xiàn)基因組的編輯[6]。

新型基因組編輯技術(shù)的興起，已經(jīng)開(kāi)啟了基因組工程的一個(gè)新篇章。特別是CRISPR-Cas9系統(tǒng)已成功應(yīng)用于植物、細(xì)菌、酵母、魚(yú)類(lèi)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞，為構(gòu)建更高效的基因定點(diǎn)修飾技術(shù)提供了全新的平臺(tái)，是目前最高效的基因組編輯系統(tǒng)[7]。

2 國(guó)內(nèi)外研究與應(yīng)用現(xiàn)狀

基因組編輯技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多種模式生物靶基因的定點(diǎn)斷裂、插入、缺失、替換等編輯，積極推動(dòng)了生物體基因功能研究、作物遺傳改良和分子育種以及人類(lèi)疾病的基因治療等領(lǐng)域的發(fā)展。2012年和2013年《Science》分別將TALEN和CRISRP/Ca9技術(shù)評(píng)為年度十大重要科學(xué)突破，2014年《Nature Methods》將基因組編輯技術(shù)評(píng)為過(guò)去十年中對(duì)生物學(xué)研究最有影響力的十項(xiàng)研究方法之一。ZFN、TALEN和CRISPR/CAS9技術(shù)已成功用于黑長(zhǎng)尾猴、大鼠、線蟲(chóng)、小鼠、中國(guó)倉(cāng)鼠、非洲爪蟾卵細(xì)胞、斑馬魚(yú)、果蠅、海膽、家蠶、擬南芥、煙草、玉米、大豆等模式生物的細(xì)胞或胚胎的內(nèi)源基因的定點(diǎn)突變，特別是在果蠅、斑馬魚(yú)、大鼠等物種中獲得了可穩(wěn)定遺傳的突變體[8-14]。部分已經(jīng)報(bào)道的基因組編輯的物種和基因等信息見(jiàn)表1[15-30]。

在動(dòng)物或人類(lèi)的基因治療等應(yīng)用中，由于現(xiàn)有的基因組編輯技術(shù)存在一定的脫靶效應(yīng)，可能造成致命的后果，其安全性備受關(guān)注。在植物生產(chǎn)中，脫靶效應(yīng)不是應(yīng)用的主要制約因素。因此，在培育過(guò)程中可以通過(guò)全基因組測(cè)序、分子檢測(cè)等手段可評(píng)價(jià)是否存在脫靶，或通過(guò)與親本多次回交降低脫靶位點(diǎn)的頻率，從而可以有效避免因脫靶效應(yīng)帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)[31]。因此，基因組編輯植物產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用相對(duì)成熟。迄今為止，基因組編輯植物已經(jīng)開(kāi)始商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。2009年，SHUKLA等[32]利用ZFN將除草劑抗性基因?qū)胗衩谆蚪M的預(yù)設(shè)位點(diǎn)，破壞玉米中的ZmIPK1，抑制肌醇六磷酸的合成，獲得了抗除草劑和減少肌醇六磷酸水平的植株。CAI等[33]利用ZFN改變煙草植物細(xì)胞單個(gè)基因的序列，獲得了耐除草劑的煙草。2012年，愛(ài)荷華州立大學(xué)LI等[34]利用TALEN技術(shù)對(duì)水稻感病基因OsSWEET14進(jìn)行編輯后，提高了水稻對(duì)白葉枯病的抗性；2012年，美國(guó)政府已經(jīng)批準(zhǔn)了首個(gè)基因組定向修飾的磷高效玉米，可以直接作為常規(guī)品種進(jìn)行田間評(píng)價(jià)。2014年，美國(guó)Cellectis Plant Sciences公司利用基因組編輯敲除大豆脂肪脫氫酶2個(gè)基因家族，得到的大豆中油酸含量從20%提高到80%，并降低了儲(chǔ)存中易發(fā)生氧化的亞油酸含量，顯著改善了大豆油的品質(zhì)[35]。2015年，美國(guó)Calyxt公司利用TALEN技術(shù)對(duì)一個(gè)馬鈴薯品系進(jìn)行了基因編輯，降低了天門(mén)冬酰胺和單糖的含量，提高馬鈴薯的耐儲(chǔ)藏性，并減少高溫烹飪時(shí)產(chǎn)生的致癌物質(zhì)丙烯酰胺[35]。Calyxt公司還利用TALEN技術(shù)研發(fā)了2種大豆改良品系，其單不飽和脂肪酸的含量與橄欖油和菜籽油相當(dāng)。2016年，杜邦公司利用CRISPR技術(shù)將自然存在的糯玉米性狀直接引入優(yōu)秀的高產(chǎn)雜交品種中，解決了糯玉米產(chǎn)量低的問(wèn)題[36]。2016年，利用CRISPR技術(shù)對(duì)雙孢菇（Agaricusbisporus）中一類(lèi)編碼導(dǎo)致褐變的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）基因家族進(jìn)行了刪除，將PPO酶的活性降低了30%，讓雙孢菇抗褐變[37]。

中國(guó)基因組編輯技術(shù)進(jìn)展迅速，特別是在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物領(lǐng)域。2016年，GAO等[5]和XU等[6]發(fā)明了新的基因組編輯技術(shù)NgAgo和SGN。高彩霞等通過(guò)基因組編輯水稻甜菜堿乙醛脫氫酶基因（OsBADH2），改善了稻米的香味品質(zhì)[38]；在小麥中，同時(shí)敲除 A、B和 D基因組上 3個(gè)拷貝的白粉病基因（mildew resistance locus O，MLO），獲得了對(duì)白粉病具有廣譜和持久抗性的小麥材料[39-40]。2011年，YU等[41]通過(guò)ZFN技術(shù)成功地在牛上實(shí)現(xiàn)了基因定點(diǎn)突變，得到了β-乳球蛋白基因敲除牛。2012年，QIAN等[42]利用ZFN技術(shù)制備了肌肉生長(zhǎng)抑制素（myostatin，MSTN）基因編輯梅山豬，該豬具有顯著的高瘦肉率表型，并進(jìn)入轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)的環(huán)境釋放階段；在2013年和2014年又利用TALEN技術(shù)制備了MSTN基因編輯梅山豬和大白豬（未發(fā)表），并進(jìn)入轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)的中間階段。2013年，LIU等[43]利用ZFN技術(shù)將溶葡萄球菌素（lysostaphin）基因插入到 β-酪蛋白（beta-casein）基因座，制備的基因編輯牛的乳腺能夠生成溶葡萄球菌素蛋白；2014年，LIU等[44]通過(guò)ZFN技術(shù)將人溶菌酶（human lysozyme，hlyz）基因插入到牛的β-酪蛋白基因座，獲得的轉(zhuǎn)基因牛的乳汁中可分泌人溶菌酶，具有殺死金黃色葡萄球菌的能力。2015年，WU等[45]利用TALENs技術(shù)將胞內(nèi)病原體抗性基因1（intracellular pathogen resistance1，Ipr1）定點(diǎn)插入牛的基因組中，使轉(zhuǎn)基因牛獲得了抵抗結(jié)核病的能力，為中國(guó)抗結(jié)核病轉(zhuǎn)基因牛新品種培育奠定了良好的基礎(chǔ)。2016年，LUO等[46]利用TALEN技術(shù)將人血清白蛋白基因定點(diǎn)插入到牛β乳球蛋白座位上，并制備了轉(zhuǎn)基因牛。同時(shí)，中國(guó)學(xué)者利用基因組編輯技術(shù)，發(fā)掘了Rosa26[47]、H11[48]等“友好基因座”位點(diǎn)，制備了一批具有重要醫(yī)學(xué)價(jià)值的人類(lèi)疾病模型[49-52]及生產(chǎn)人藥用蛋白的動(dòng)物生物反應(yīng)器[53-54]。

表1 使用ZFN、TALEN和CRISPR/Cas對(duì)生物體進(jìn)行基因組修飾統(tǒng)計(jì)表Table1 List of the applications of genome editing using ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas systems

ZFN系統(tǒng)由于鋅指單元與靶序列結(jié)合的特異性有限，其脫靶效應(yīng)較高，限制了ZFN技術(shù)的應(yīng)用。TALEN和CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性高，脫靶效應(yīng)較低，已經(jīng)基本上代替了ZFN用于基因組編輯。特別是CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有構(gòu)建簡(jiǎn)單、突變效率高、成本低、多靶點(diǎn)同時(shí)突變等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于動(dòng)植物的精準(zhǔn)遺傳改良[11-12]。2016年，NgAgo和SGN兩種新的基因組編輯技術(shù)被首次報(bào)道，引起了科學(xué)界的熱議，其有望成為繼CRISPR/Cas9技術(shù)之后的更具突破性和適用性的基因組編輯技術(shù)。但是，針對(duì)這兩種新編輯技術(shù)的未來(lái)還需要更多的試驗(yàn)和實(shí)際應(yīng)用來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。

3 基因組編輯技術(shù)主要優(yōu)勢(shì)

3.1 較高的安全性

基因組編輯技術(shù)在進(jìn)行基因敲除或替換時(shí)，序列和結(jié)構(gòu)特異核酸酶的整合位點(diǎn)與靶基因位點(diǎn)通常不在同一染色體上，通過(guò)后代的自然分離即可獲得無(wú)轉(zhuǎn)基因痕跡的遺傳材料。如果采用序列特異核酸酶的瞬時(shí)表達(dá)等方法，可使人工核酸酶基因不整合到受體基因組的同時(shí)獲得基因定點(diǎn)敲除或替換突變體。基因組編輯獲得的突變體一般只有幾個(gè)堿基的刪除或者改變，與傳統(tǒng)的天然突變、人工誘變和種內(nèi)雜交獲得的遺傳材料相類(lèi)似，而且基因組編輯引發(fā)的突變是定向的，相比非定向的傳統(tǒng)誘變技術(shù)可以很大程度減少隨機(jī)突變所帶來(lái)的非預(yù)期效應(yīng)。在定點(diǎn)插入方面，基因組編輯技術(shù)主要是利用同源重組的方式，可以做到外源DNA序列的定點(diǎn)插入整合，與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，極大地減少了由于隨機(jī)插入和整合所帶來(lái)的非預(yù)期效應(yīng)產(chǎn)生的安全性風(fēng)險(xiǎn)。因此，從技術(shù)層面上基因組編輯技術(shù)比傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有較高的安全性。

3.2 多位點(diǎn)突變

利用TALEN或CRISPR技術(shù)，可以將多個(gè)序列特異性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)同時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)DNA片段刪除、倒位、易位等染色體重組及多基因敲除[11-12]。染色體重組和多基因敲除是反向遺傳學(xué)研究的重要技術(shù)手段。利用多基因敲除技術(shù)可提高復(fù)雜數(shù)量性狀基因功能研究的效率，構(gòu)建多基因缺失突變體，實(shí)現(xiàn)多個(gè)關(guān)聯(lián)基因的功能網(wǎng)絡(luò)研究。同時(shí)，也可以通過(guò)構(gòu)建成千上萬(wàn)基因的大規(guī)模向?qū)gRNA文庫(kù)，從全基因組層面進(jìn)行定點(diǎn)敲除、抑制、激活，再結(jié)合功能性篩選平臺(tái)和深度測(cè)序技術(shù)，實(shí)現(xiàn)高通量方式進(jìn)行全基因組范圍的飽和篩選，全面認(rèn)識(shí)基因的功能和相互作用網(wǎng)絡(luò)。

3.3 研發(fā)成本低

基因組編輯技術(shù)最顯著的特點(diǎn)是“精準(zhǔn)靶定目標(biāo)位點(diǎn)”，突破了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)外源基因“隨機(jī)插入”受體基因組的瓶頸，直接將基因型和表現(xiàn)型聯(lián)系在一起，極大地減少了需要篩選的群體樣本數(shù)量，可準(zhǔn)確判斷基因的功能和育種應(yīng)用價(jià)值，提高了產(chǎn)品研發(fā)速度，降低了研發(fā)成本。另外，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過(guò)不斷改進(jìn)，其載體構(gòu)建更加簡(jiǎn)單易行，靶向效率更高，極大地降低了實(shí)驗(yàn)室研發(fā)成本。

4 基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品安全管理的探討

基因組編輯技術(shù)及其產(chǎn)品已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)室研究階段逐步進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用階段，基因組編輯產(chǎn)品將對(duì)農(nóng)牧漁業(yè)生產(chǎn)、糧食安全、醫(yī)療健康產(chǎn)業(yè)等國(guó)計(jì)民生產(chǎn)生重大而深遠(yuǎn)的影響，其潛在經(jīng)濟(jì)效益更是不可估量。在分子育種方面，基因組編輯技術(shù)已經(jīng)展現(xiàn)了較傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)高效、精準(zhǔn)、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)，未來(lái)將會(huì)有大量的基因組編輯作物新品種出現(xiàn)。鑒于世界各國(guó)對(duì)于轉(zhuǎn)基因技術(shù)及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性的高度關(guān)注和爭(zhēng)議，通過(guò)基因組編輯技術(shù)獲得的產(chǎn)品的安全性將會(huì)同樣引起全社會(huì)的關(guān)注。中國(guó)在基因組編輯技術(shù)研究和應(yīng)用方面已處于世界前列，理應(yīng)盡早思考和規(guī)劃即將出現(xiàn)的基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品和新品種的安全性及其安全性管理，促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，切實(shí)為國(guó)家的生物安全和糧食安全作出重要貢獻(xiàn)。

4.1 國(guó)外安全評(píng)價(jià)和管理現(xiàn)狀

自2014年開(kāi)始，歐美等國(guó)多家公司相繼研發(fā)生產(chǎn)了源于基因組編輯技術(shù)的作物新品種，并向本國(guó)政府提交了這些新品種的商業(yè)化應(yīng)用申請(qǐng)。由于基因組編輯技術(shù)作為一種新的技術(shù)，世界各國(guó)還沒(méi)有明確的、針對(duì)性的法律法規(guī)，目前，對(duì)于這類(lèi)產(chǎn)品的安全性及其安全管理很大程度上還處于討論階段或者是發(fā)布初步的管理建議。

2015年7月，美國(guó)白宮表示，將對(duì)1992年頒發(fā)的《生物科技產(chǎn)品的審核框架》進(jìn)行修訂，重新明確美國(guó)食品與藥物監(jiān)督管理局（FDA）、美國(guó)農(nóng)業(yè)部（USDA）和美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（EPA）在判定轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物安全性中的地位和作用。此外，針對(duì)新型技術(shù)的審核過(guò)程也將進(jìn)行更新修正。如對(duì)基因組編輯產(chǎn)品的監(jiān)管遵循個(gè)案分析的原則，以科學(xué)為基礎(chǔ)開(kāi)展。美國(guó)農(nóng)業(yè)部認(rèn)為某些基因組編輯作物與傳統(tǒng)育種得到的作物相似，基因組編輯作物不需要像轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品那樣進(jìn)行審批管理。2016年 5月，美國(guó)農(nóng)業(yè)部宣布利用CRISPR-Cas9基因組編輯的蘑菇和玉米不屬于轉(zhuǎn)基因生物監(jiān)管范疇[53]。2015年，阿根廷決定針對(duì)新的育種技術(shù)產(chǎn)品（包括基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品），實(shí)施“個(gè)案分析”的管理審批政策，如果確認(rèn)最終產(chǎn)品不含有外源基因，則不屬于轉(zhuǎn)基因生物監(jiān)管范疇[56]。2013年，澳大利亞新西蘭食品標(biāo)準(zhǔn)局建議，簡(jiǎn)單的堿基缺失的基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品不屬于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，但是有新的外源DNA插入的基因組編輯產(chǎn)品仍將被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行管理。日本明確表示基因組編輯產(chǎn)品不屬于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的范疇，和常規(guī)作物產(chǎn)品一樣。加拿大對(duì)于基因組編輯產(chǎn)品的管理基于產(chǎn)品管理的原則，關(guān)注其是否產(chǎn)生新的性狀，而不考慮利用什么樣的技術(shù)獲得新性狀[57]。歷來(lái)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品持相對(duì)保守態(tài)度的歐盟也在審視其針對(duì)基因組編輯技術(shù)的政策。歐盟委員會(huì)已啟動(dòng)了對(duì)“轉(zhuǎn)基因生物體”定義的法律審查程序，重新定義轉(zhuǎn)基因生物體。歐洲食品安全局轉(zhuǎn)基因生物小組則表示，如果新品種中無(wú)外源遺傳物質(zhì)且基因組編輯產(chǎn)生改變與自然突變無(wú)法區(qū)分，不應(yīng)作為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對(duì)待。歐洲科學(xué)院科學(xué)咨詢(xún)委員會(huì)認(rèn)為，需要對(duì)新產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)估，不對(duì)育種技術(shù)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

4.2 中國(guó)安全評(píng)價(jià)和管理探討

中國(guó)已利用基因組編輯技術(shù)研發(fā)了一系列的水稻、小麥和動(dòng)物等新品系[38-54]，具有良好的商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用前景。為此，中國(guó)農(nóng)業(yè)管理部門(mén)十分重視基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品的安全性及其安全管理，努力為新產(chǎn)品的生產(chǎn)應(yīng)用保駕護(hù)航。以李家洋院士牽頭的研究小組，提出了基因組編輯作物管理框架，包括5個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即：（1）產(chǎn)品在實(shí)驗(yàn)室和田間試驗(yàn)階段，應(yīng)該嚴(yán)格控制管理，避免向外界逃逸。（2）如果開(kāi)發(fā)過(guò)程中基因編輯的元件以DNA載體的形式引入，必須確保基因組編輯作物中的外源DNA被完全去除。（3）準(zhǔn)確報(bào)告記錄靶標(biāo)位點(diǎn)處詳盡的DNA序列變化。如果通過(guò)同源重組引入了新的序列，需確定供體和受體的親緣關(guān)系，以此來(lái)表征引入的序列與遺傳背景是否有新的相互作用可能性。若通過(guò)同源重組引入的外源基因與受體親緣關(guān)系很遠(yuǎn)，須具體情況具體分析。（4）確保產(chǎn)品中的主要靶點(diǎn)沒(méi)有發(fā)生非預(yù)期的二次編輯事件，并基于現(xiàn)有參考基因組信息和全基因組重測(cè)序技術(shù)，評(píng)價(jià)是否發(fā)生脫靶效應(yīng)及其可能的安全性風(fēng)險(xiǎn)。（5）以上4點(diǎn)應(yīng)在新品種登記資料中詳細(xì)說(shuō)明備案。只有在滿(mǎn)足上述5個(gè)條件的基礎(chǔ)上，基因組編輯作物產(chǎn)品在進(jìn)入市場(chǎng)之前才能和常規(guī)育種作物同等監(jiān)管[55]。

在上述基因組編輯作物管理框架的基礎(chǔ)上，結(jié)合中國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例，從以下4個(gè)方面探討了中國(guó)今后對(duì)于基因組編輯作物的安全性評(píng)價(jià)和管理。

4.2.1 明確基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品的安全管理范疇中國(guó)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》第三條明確定義，“本條例所稱(chēng)的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物，是指利用基因工程技術(shù)改變基因組構(gòu)成，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)或者農(nóng)產(chǎn)品加工的動(dòng)植物、微生物及其產(chǎn)品”?；蚪M編輯技術(shù)主要是對(duì)基因組DNA序列進(jìn)行定向修飾的技術(shù)，其屬于基因工程技術(shù)范疇。根據(jù)上述定義，通過(guò)基因組編輯技術(shù)獲得的農(nóng)作物其產(chǎn)品，應(yīng)該屬于農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物，應(yīng)依法納入農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理范疇。但由于《條例》主要是針對(duì)第一代轉(zhuǎn)基因技術(shù)而言，即通過(guò)基因工程技術(shù)，在受體基因組上插入整合了外源DNA序列，而獲得的具有新的性狀的產(chǎn)品?；蚪M編輯技術(shù)主要用來(lái)對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行精準(zhǔn)修飾或?qū)⒛繕?biāo)基因定點(diǎn)整合到基因組中，對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行精準(zhǔn)修飾時(shí)只在操作過(guò)程中涉及外源DNA的導(dǎo)入，篩選的后代中只有目標(biāo)基因被修飾而不含有外源DNA，與傳統(tǒng)誘變育種獲得的最終產(chǎn)品相似，因此，建議將進(jìn)行基因精準(zhǔn)修飾獲得的少量堿基缺失、替換或者敲除的突變體類(lèi)新產(chǎn)品視為特殊農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，可簡(jiǎn)化這一類(lèi)產(chǎn)品的安全評(píng)價(jià)和管理。通過(guò)基因組編輯技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)整合有外源DNA插入的，則按傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行安全評(píng)價(jià)和管理。

4.2.2 確定安全評(píng)價(jià)的內(nèi)容 現(xiàn)階段，中國(guó)基于實(shí)質(zhì)等同性和個(gè)案分析的原則，對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)管理，主要包括3個(gè)方面的內(nèi)容：分子特征評(píng)價(jià)、環(huán)境安全評(píng)價(jià)和食用安全評(píng)價(jià)。對(duì)于基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品，仍然需要按照轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)管理。應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注是否存在非預(yù)期的基因編輯，是否產(chǎn)生新的環(huán)境安全和食用安全風(fēng)險(xiǎn)。其中，堿基缺失或敲除的突變體類(lèi)基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品可簡(jiǎn)化安全性評(píng)價(jià)管理，重點(diǎn)開(kāi)展分子特征評(píng)價(jià)和食用安全評(píng)價(jià)。安全性評(píng)價(jià)的具體內(nèi)容可參考傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)辦法和評(píng)價(jià)指南。但是，對(duì)分子特征的評(píng)價(jià)，可利用全基因組重測(cè)序等手段進(jìn)行分析，以便清楚地解釋基因組編輯發(fā)生的位點(diǎn)，以及引起的缺失、插入、重組等。

4.2.3 建立分子檢測(cè)新方法 基因組編輯技術(shù)由于其定點(diǎn)編輯，且在改造的受體生物體內(nèi)留下的痕跡較少，原有的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)方法，如蛋白質(zhì)水平和核酸水平檢測(cè)方法，已經(jīng)很難滿(mǎn)足基因組編輯產(chǎn)品的檢測(cè)，特別是單堿基或少量堿基缺失的基因組編輯產(chǎn)品。需要加強(qiáng)檢測(cè)新技術(shù)的研究，建立特異性的針對(duì)基因組編輯產(chǎn)品的檢測(cè)新方法，以保護(hù)研發(fā)人的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，為國(guó)家安全監(jiān)管監(jiān)測(cè)提供有力的技術(shù)支撐。

4.2.4 完善配套的安全管理法律法規(guī) 2001年，中國(guó)頒布《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，2002年農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)口安全管理辦法》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》等 3個(gè)配套管理辦法，對(duì)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行全程監(jiān)控。近幾年，為規(guī)范管理轉(zhuǎn)基因生物，又制定了安全評(píng)價(jià)指南和一系列檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，使轉(zhuǎn)基因生物研發(fā)人員、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)和國(guó)家農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)委員會(huì)工作有章可循、有據(jù)可依。隨著基因組編輯技術(shù)的研發(fā)應(yīng)用，原有法規(guī)中規(guī)定的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物概念的范圍等已經(jīng)不完全適合于基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品。因此，中國(guó)亟需對(duì)已有的法律法規(guī)進(jìn)行修改完善，參考國(guó)際上先進(jìn)做法，相機(jī)而行。促進(jìn)新技術(shù)的發(fā)展，推進(jìn)第二代基因工程育種技術(shù)創(chuàng)新性革命，創(chuàng)制新農(nóng)作物種質(zhì)資源，培育突破性新品種。

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（責(zé)任編輯 李莉）

The Safety Management of Genome Editing Technology

SHEN Ping1, ZHANG QiuYan2, YANG LiTao3, ZHANG Li4, LI WenLong1, LIANG JinGang1, LI XiaYing1, WANG HaoQian1, SHEN XiaoLing5, SONG GuiWen1
(1Science and Technology Development Center, Ministry of Agriculture, Beijing 100122;2Agro-Environmental Protection Institute, Ministry of Agriculture, Tianjin 300191;3Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240;4School of Life Science, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074;5Tianjin Academy of Agriculture Science, Tianjin 300381)

Genome editing technologies using sequence-specific nuclease (SSN) creates DNA double-strand breaks (DSBs) in the genomic target sites, and the DSBs can be repaired by the non-homologous end joining (NHEJ) or homologous recombination (HR) pathways with the help of artificially engineered nucleases, which can be employed to achieve targeted genome modifications such as gene mutation, gene insertion, gene replacement or chromosome rearrangement. There are three major artificially engineered nucleases including zinc finger nuclease (ZFN), transcription activator-like effector nuclease (TALEN) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) systems. The genome editing techniques have been widely used in the fields of plant gene function research, molecular breeding, and etc. The genome editing crops (GEC) showpromising application prospects compared with traditional genetically modified organism (GMO). The GECs with good traits have been gradually transferred from labs to fields. Herein, the principles, characters, and applications of these three mainly used techniques in animal and plants genome editing have been described. The advantages and disadvantages compared with conventional transgenic technique were also discussed, including the safety came from the off-target effects. The management regulations of GECs of different countries in global area were elaborated. Finally, the safety management of GECs and their products in China were discussed combined with Chinese current regulations on the safety management of GMOs, so as to facilitate the development and commercialization of GECs and their products.

genome editing; genetically modified organisms; safety management

2016-10-19；接受日期：2016-11-17

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2016ZX08012-003）

聯(lián)系方式：沈平，Tel：010-59198111；E-mail：shenping84@Hotmail.com。通信作者宋貴文，Tel：010-59198150；E-mail：songguiwen@agri.gov.cn