捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc-daf-22基因的原核表達(dá)及重組蛋白酶活性測定

鄭秀平，丁豪杰，郭筱璐，楊怡，黃艷，陳學(xué)秋，周前進(jìn)，杜愛芳

（1浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/浙江省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058；2寧波大學(xué)生物技術(shù)系，浙江寧波 315211）

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc-daf-22基因的原核表達(dá)及重組蛋白酶活性測定

鄭秀平1，丁豪杰1，郭筱璐1，楊怡1，黃艷1，陳學(xué)秋1，周前進(jìn)2，杜愛芳1

（1浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/浙江省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058；2寧波大學(xué)生物技術(shù)系，浙江寧波 315211）

【目的】捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)是反芻動(dòng)物主要的胃腸道線蟲之一，該病在中國呈全國性流行。為研究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）脂肪酸代謝相關(guān)蛋白DAF-22的生化特性，對其基因進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)，并對重組蛋白進(jìn)行了體外酶活性測定。以期了解捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc-DAF-22蛋白在過氧化物酶體脂肪酸β氧化中的作用?！痉椒ā扛鶕?jù)NCBI公布的H. contortus ZJ株daf-22 cDNA序列（GenBank：HQ738470.1）設(shè)計(jì)特異性引物，克隆Hc-daf-22基因并構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b-Hc-daf-22， 經(jīng)測序鑒定正確后將其轉(zhuǎn)化E. coli BL21，經(jīng)終濃度為0.1 m mol·L-1IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)誘導(dǎo)表達(dá)4h，離心菌液，50 mmol·L-1濃度的PBS溶液重懸菌體溶液，冰浴超聲破碎后上清沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE分析。超聲破碎后產(chǎn)物以鎳柱親和色譜法分離純化重組蛋白Hc-DAF-22，并用SDS-PAGE檢測蛋白純化情況及以抗His血清作為一抗Western Blot鑒定。純化后蛋白用超濾管濃縮除去鹽分，并按照蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定。利用天然狀態(tài)下的乙酰乙酰CoA（AcAc-CoA）分子會(huì)發(fā)生酮-烯醇互變形成烯醇化合物特性，酶活試驗(yàn)以乙酰乙酰輔酶a為底物建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。硫解酶體外測活體系為（50 mmol·L-1Tris-Cl pH 8.1，20 mmol·L-1MgCl2，60 μmol·L-1CoA，10 μmol·L-1AcAc-CoA，加入約0.1 μg蛋白），通過記錄反應(yīng)過程中由于底物（AcAc-CoA）的減少而引起303 nm波長下的吸收值的變化，從而計(jì)算出硫解反應(yīng)的初始反應(yīng)速率，最終確定復(fù)性后的Hc-DAF-22的硫解酶活性。在相同條件下，取AcAc-CoA底物濃度為10μmol·L-1的反應(yīng)體系（50 mmol·L-1Tris-Cl pH 8.1，20 mmol·L-1MgCl2，60 μmol·L-1CoA，10 μmol·L-1AcAc-CoA，加入約0.1 μg蛋白于室溫起始反應(yīng)），分別調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的溫度及pH梯度，確定Hc-DAF-22最佳酶活反應(yīng)溫度及pH條件?！窘Y(jié)果】成功克隆Hc-daf-22基因，測序結(jié)果與NCBI已公布的 H. contortus ZJ株 Hc-daf-22基因序列比對基因相似度為 99.9%，并實(shí)現(xiàn)重組子pET-22b-Hc-daf-22在 E. coli BL21體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE和 Western Blot檢測顯示，pET-22b-Hc-daf-22基因在大腸桿菌中成功表達(dá)，呈部分可溶性，融合蛋白的分子量約為59 kD，測得蛋白濃度為 1.70 μg·μL-1；針對該表達(dá)產(chǎn)物的酶活分析結(jié)果表明，原核表達(dá)的 Hc-DAF-22具有一定的硫解酶活性，其最適反應(yīng)pH為8.0，最佳反應(yīng)溫度為37℃，酶學(xué)常數(shù)Km值和Vmax值分別為33.765 μmol·L-1和1 784 nmol·L-1·min-1?！窘Y(jié)論】捻轉(zhuǎn)血矛線蟲DAF-22是過氧化物酶體脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶之一，本試驗(yàn)通過體外酶活試驗(yàn)成功測定Hc-DAF-22蛋白的酶活性，證明Hc-DAF-22具有一定硫解酶活性，但與秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）同源蛋白相比硫解酶活性較低。

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲；Hc-daf-22；原核表達(dá)；酶活測定；β氧化

0 引言

【研究意義】捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）是反芻動(dòng)物主要的胃腸道線蟲之一，屬毛圓科血矛屬，成蟲主要寄生于牛羊的真胃中。其引起的疾病以消瘦、貧血以及慢性消耗性癥狀為主，在感染嚴(yán)重的情況下可引起大批死亡[1]。該病在中國呈全國性流行，感染率在26.4%—80%之間[2-3]。目前捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的防控仍然是以藥物預(yù)防為主，但線蟲耐藥問題的日益嚴(yán)重[4]，因此迫切需要新型抗線蟲藥物緩解現(xiàn)狀。近年來，藥物靶標(biāo)的篩選已成為藥物開發(fā)的主流方向[5]，而藥物靶標(biāo)的功能分析是其中重要的一環(huán)。理想的藥物靶標(biāo)通常存在于病原體感染、存活以及繁殖過程中所必需，而與宿主有明顯區(qū)別的代謝通路中[6]。寄生線蟲需氧的營自由生活與微氧的寄生生活兩個(gè)階段決定了其具有不同的脂肪酸代謝與能量代謝方式；尤其寄生生活階段，線蟲在宿主體外發(fā)生的脂肪酸β-氧化等生理過程將會(huì)因宿主體內(nèi)的微氧環(huán)境而受到抑制，糖酵解成為寄生階段線蟲獲能的主要方式[7-8]。因而線蟲獨(dú)特的脂肪酸代謝機(jī)制為新型藥物的研發(fā)提供了潛在的藥物靶位點(diǎn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】寄生線蟲寄生階段不能通過實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行模擬，使得有關(guān)真核生物代謝通路的機(jī)制研究均不能在其體內(nèi)有效開展。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）主要通過滯育信息素感知外界環(huán)境，決定生長發(fā)育的方向[9-10]。其中，過氧化酶體的脂肪酸β-氧化過程是滯育信息素合成的主要途徑[11]。長鏈脂肪酸或超長鏈脂肪酸依次在?；o酶 A氧化酶 ACOX-1、水合酶MAO-1、β-羥烷基輔酶A脫氫酶Ce-DHS-28及硫解酶Ce-DAF-22[12]催化的級聯(lián)反應(yīng)下逐步水解并生成滯育信息素。DAF-22作為脂肪酸代謝中過氧化物酶體 β-氧化的關(guān)鍵酶，對秀麗隱桿線蟲的生存非常重要，若此過程不能進(jìn)行即不能產(chǎn)生相應(yīng)的滯育素來感知外界環(huán)境[12-14]。在這一過程中，Ce-DAF-22主要是將由脫氫酶 Ce-DHS-28催化生成的 β-酮脂酰輔酶 A 中間體硫解[15]。Ce-DAF-22功能缺失的線蟲突變株不能合成滯育信息素，且蟲體內(nèi)出現(xiàn)大量的脂肪酸積聚，呈現(xiàn)病態(tài)[16]。已有研究報(bào)道分離自捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體內(nèi)的Hc-DAF-22是DAF-22的同源類似物，初步的研究表明 Hc-daf-22能夠一定程度上補(bǔ)償秀麗隱桿線蟲因daf-22缺失引起的生理缺陷[17]，猜測Hc-daf-22在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體內(nèi)可能具有與daf-22相似的功能能明顯改變該線蟲的滯育表型，而且這個(gè)改變伴隨有線蟲體內(nèi)脂肪顆粒積聚量的變化。而越來越來多的實(shí)驗(yàn)表明Hc-DAF-22可能作為關(guān)鍵酶參與了線蟲的長鏈脂肪酸代謝，控制著線蟲的發(fā)育[18]。分析發(fā)現(xiàn) Hc-DAF-22的 N末端具有典型的參與長鏈脂肪酸代謝的 I 型脂肪酸硫解酶（即3-酮脂酰輔酶A硫解酶）功能域，在C末端具有典型的?；o酶A轉(zhuǎn)移酶的保守功能域，推測具有類似于Ce-DFA-22硫解酶活性的潛力?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲 Hc-daf-22研究較多，對其Hc-DAF-22蛋白活性研究較少，本研究擬在已有研究基礎(chǔ)上生物體外利用酶學(xué)相關(guān)技術(shù)研究Hc-DAF-22的硫解酶活性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為進(jìn)一步明確 Hc-daf-22的可能的生物學(xué)功能，通過對原核表達(dá)的Hc-DAF-22蛋白進(jìn)行了體外酶活試驗(yàn)，確定 Hc-DAF-22蛋白的硫解酶活性，為進(jìn)一步研究Hc-DAF-22蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年5月至2016年12月在浙江大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)研究所寄生蟲病理生物學(xué)研究室進(jìn)行。

1.1 蟲體、菌株與質(zhì)粒

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ZJ株成蟲由浙江省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離，鑒定并保存；質(zhì)粒pET-22b(+)vector、菌株E. coli TOP10和E. coli BL21（DE3）由浙江省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備并保存；和質(zhì)粒pMD19-T vector購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。

1.2 試劑與試劑盒

T4 DNA連接酶、TaKaRa LA TaqTM酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ等購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自Axygen公司。乙酰乙酰輔酶a、輔酶a均購自Sigma公司；Millipore超濾管、Bio-Rad蛋白濃度測定試劑盒購自Promega公司；Ni-NTA親和色譜樹脂購自Qiagen公司。

1.3 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc-daf-22基因的克隆

根據(jù)NCBI已公布的H. contortus ZJ株Hc-daf-22基因序列（GenBank登錄號：HQ738470.1）設(shè)計(jì)特異性引物，具體引物序列為Hc-daf-22-F: CGCGAATTC TAAATGGGTAAATCAAAAGTATATGT（下劃線為限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ的識別位點(diǎn)），Hc-daf-22-R: GCCGTCGAC GATTTTCGCTTTGAGCATTT（下劃線為SalⅠ的識別位點(diǎn)），引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成。以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲 RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用LA TaqTM酶擴(kuò)增，PCR條件：94℃5 min；94℃ 30 s；62℃ 30 s；72℃ 90 s；32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物連接至pMD19-T載體，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，菌液PCR鑒定陽性菌落，將陽性菌液送至上海博尚生物技術(shù)有限公司測序分析。

1.4 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲 Hc-DAF-22表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá)

選取測序正確的pMD19-T-daf22質(zhì)粒與pET-22b質(zhì)粒，同時(shí)用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切后回收目的片段與載體，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，繼而轉(zhuǎn)入E. coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆經(jīng)PCR鑒定后，陽性克隆抽提質(zhì)粒后用限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定。雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)型大腸桿菌株BL21（DE3），鑒定為陽性克隆的菌種于20%甘油中-80℃保存。

將BL21接種于200 mL（Amp 100mg·L-1）LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3h左右，至菌液OD600為0.6左右時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol·L-1。誘導(dǎo)表達(dá)4 h，完成后將培養(yǎng)基在4℃以8 000×g 離心10 min， 棄上清，用50 mmol·L-1PBS 緩沖液（pH=7.4）重懸細(xì)胞，冰浴條件下超聲波破碎細(xì)胞。細(xì)胞破碎完成后，12 000×g，4℃離心30 min，收集上清。分別取10 μL上清液與沉淀液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測表達(dá)情況。

1.5 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc-DAF-22蛋白的分離純化

收集含DAF-22蛋白組分的細(xì)胞破碎上清液，加入到用PBS（pH=7.4）預(yù)先平衡的鎳瓊脂糖凝膠柱中，控制流速1 mL·min-1。經(jīng)PBS平衡后用含不同濃度咪唑的緩沖液進(jìn)行階段洗脫，流速2 mL·min-1，收集洗脫液。含有目的蛋白的洗脫成分用超濾管過濾，收集除鹽濃縮后的蛋白，SDS-PAGE檢測蛋白回收情況。驗(yàn)證后，將純化的Hc-DAF-22蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，經(jīng)5%脫脂乳封閉，以抗His血清為一抗，羊抗兔HRP-IgG（1﹕4 000）為二抗，通過DAB底物顯色進(jìn)行Western Blot鑒定。按照Bio-Rad公司蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定。

1.6 酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

天然狀態(tài)下的乙酰乙酰CoA（AcAc-CoA）分子會(huì)發(fā)生酮-烯醇互變形成烯醇化合物，該烯醇化合物能與 Mg2+結(jié)合后在 303 nm 處形成特征吸收峰（ε303=16.5 mM-1cm-1）[19]。將乙酰乙酰輔酶A（AcAc-CoA）配制成0、3、6、9、12、15 μmol·L-1等4個(gè)濃度梯度分別加入20 mmol·L-1MgCl2。測定不同濃度在303 nm 波長處的吸光值，根據(jù)吸光值與 AcAc-CoA濃度關(guān)系繪制AcAc-CoA標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照AcAc-CoA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出反應(yīng)產(chǎn)物濃度。

1.7 Hc-DAF-22蛋白酶活測定

我們利用AcAc-CoA烯醇化合物這一特征和硫解酶體外測活體系（50 mmol·L-1Tris-Cl pH8.1，20 mmol·L-1MgCl2，60 μmol·L-1CoA，10 μmol·L-1AcAc-CoA，加入約0.1 μg蛋白），通過記錄反應(yīng)過程中由于底物（AcAc-CoA）的減少而引起303 nm波長下的吸光值的變化，從而計(jì)算出硫解反應(yīng)的初始反應(yīng)速率。酶促反應(yīng)的方程式如下所示：

1.7.1 Hc-DAF-22蛋白最適溫度及最適 pH的確定在相同條件下，取AcAc-CoA底物濃度為10 μmol·L-1的反應(yīng)體系（50 mmol·L-1Tris-Cl pH8.1，20 mmol·L-1MgCl2，60 μmol·L-1CoA，10 μmol·L-1AcAc-CoA，加入約0.1 μg蛋白于室溫起始反應(yīng)），調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的反應(yīng)溫度，設(shè)置溫度梯度為32.0、33.0、35.0、37.0、38.0、39.0、40.0℃。震蕩反應(yīng)30min，反應(yīng)完成后，測定不同溫度條件下反應(yīng)體系的 OD303值。同理，在測得的最適溫度條件下，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的 pH，設(shè)置pH梯度為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0，反應(yīng)完成后測定不同pH條件下反應(yīng)體系的OD303值。

1.7.2 Hc-DAF-22蛋白 Km與 Vmax的確定 在最適 pH和最適溫度條件下，在其他反應(yīng)體系一致的情況下，AcAc-CoA濃度分別設(shè)置為 15、30、40、100、150 μmol·L-1的底物溶液中分別加入0.1 μg重組蛋白溶液，進(jìn)行多次酶促反應(yīng)。每隔1 min測定一次反應(yīng)體系的OD303值。根據(jù)酶促反應(yīng)數(shù)據(jù)計(jì)算出初始反應(yīng)速率，進(jìn)一步計(jì)算得到初始反應(yīng)速率倒數(shù)1/v與底物濃度倒數(shù)1/[S]，然后以1/[S]對1/v作圖，根據(jù)直線斜率和截距得出米氏常數(shù)Km與Vmax[20]。

2 結(jié)果

2.1 Hc-daf-22基因的克隆及其鑒定

以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增Hc-daf-22。1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，在1 500 bp附近有單一明顯的條帶，大小與預(yù)期片段一致（圖1-A），測序結(jié)果與NCBI已公布的H. contortus ZJ株Hc-daf-22基因序列比對基因相似度為99.9%。

選擇pET-22b-Hc-daf22陽性克隆用EcoRⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定。酶切后，獲得約1 500 bp的片段與約 4 000 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1-B），證明Hc-daf22已正確轉(zhuǎn)入pET-22b中。

圖1 Hc-daf-22序列擴(kuò)增結(jié)果及pET-22b-Hc-daf-22酶切鑒定Fig. 1 Cloning of Hc-daf-22 gene fragment and identification of pET-22b-Hc-daf-22 by digestion

2.2 Hc-DAF-22蛋白的表達(dá)，純化及其鑒定

2.2.1 Hc-DAF-22蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將帶有Hc-daf-22-pET-22b重組質(zhì)粒的E. coli BL21菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h，離心菌液，50 mmol·L-1濃度的PBS溶液重懸菌體溶液，冰浴超聲破碎后分別進(jìn)行 SDSPAGE分析。根據(jù)Hc-daf-22-pET-22b質(zhì)粒的載體圖，利用 EditSeq軟件預(yù)測融合表達(dá)蛋白分子量約為 59 kD，SDS-PAGE結(jié)果顯示蛋白條帶大小與軟件預(yù)測的結(jié)果一致，在上清和沉淀中均有表達(dá)，呈部分可溶（圖3）。

2.2.2 Hc-DAF-22蛋白分離純化及鑒定 收集親和色譜純化后的目標(biāo)蛋白，SDS-PAGE檢測蛋白純化情況。經(jīng)純化超濾的重組蛋白如圖3-A，蛋白大小與預(yù)期一致為59 kD，且濃度較高無雜帶。重組蛋白以抗His血清作為一抗Western Blot鑒定，結(jié)果顯示蛋白大小與預(yù)期一致為59 kD（圖3-B）。蛋白濃度測定按照蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行，測得蛋白濃度為1.70 μg·μL-1。說明純化的可溶性蛋白濃度較高，可用于后續(xù)酶活性測定。

圖2 Hc-DAF-22重組蛋白在大腸桿菌BL21菌株中的誘導(dǎo)表達(dá)情況Fig. 2 Hc-DAF-22 protein expressed in E. coli strains BL21

圖 3 Hc-DAF-22重組蛋白純化后的 SDS-PAGE分析及Western Blot鑒定Fig. 3 SDS-PAGE analysis of purified protein and Western blot analysis

2.3 Hc-DAF-22蛋白酶活性測定

2.3.1 乙酰乙酰輔酶a標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按照文獻(xiàn)[19]所述，以底物乙酰乙酰輔酶 a為標(biāo)準(zhǔn)物，測定其不同濃度對應(yīng)的吸光值，繪制濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖4-A所示，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.99289，滿足試驗(yàn)要求。試驗(yàn)中可通過OD值的變化判斷AcAc-CoA的反應(yīng)量，進(jìn)而推測Hc-DAF-22催化下的反應(yīng)速率。

2.3.2 Hc-DAF-22蛋白酶活性反應(yīng)最適溫度確定

在反應(yīng)體系與其他反應(yīng)條件一致的情況下，如圖 4-B所示，在37℃反應(yīng)條件下，Hc-DAF-22蛋白活性最高，說明其最佳反應(yīng)溫度為37℃。并且在32—39℃溫度區(qū)間，蛋白酶活性先升高后降低，且保持在80%以上；當(dāng)溫度達(dá) 40℃時(shí)，其蛋白活性僅剩 40%左右，說明40℃對蛋白酶活性有較大影響，該蛋白酶不耐高溫。

2.3.3 Hc-DAF-22蛋白酶活性反應(yīng)最適pH確定 在37℃反應(yīng)溫度下，不同 pH條件下測定酶活，數(shù)據(jù)如圖4-C所示?？芍?，pH從中性到堿性的變化過程中，酶的活性先升高后降低，在 pH=8.0的弱堿性環(huán)境中達(dá)到最大活性。因此，說明Hc-DAF-22蛋白偏好在弱堿環(huán)境中發(fā)揮活性，當(dāng)pH為8.0時(shí)，該蛋白酶活性最強(qiáng)；當(dāng)pH繼續(xù)升高時(shí)，該酶活性不斷下降，在pH為10時(shí)，酶活性接近0，說明強(qiáng)堿對酶活性有抑制性作用。

2.3.4 不同底物濃度下，Hc-DAF-22酶活性測定 測定不同底物濃度下Hc-DAF-22酶反應(yīng)速率，運(yùn)用濃度速度雙倒數(shù)做圖，結(jié)果如圖4-D所示。根據(jù)方程計(jì)算，可得Vmax=1 784 nmol·L-1·min-1，Km=33.765 μmol·L-1。

3 討論

目前，關(guān)于寄生性線蟲脂肪酸代謝通路研究較少，但已有研究在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲發(fā)現(xiàn)與秀麗線蟲硫解酶基（Ce-daf-22）具有高同源性的新基因Hc-daf-22，預(yù)測編碼的氨基酸同源性為 83%[20]。因此，推測捻轉(zhuǎn)血矛線蟲存在與秀麗線蟲相似的過氧化物酶體β-氧化過程。本試驗(yàn)成功克隆捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc-daf-22，并在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。選擇pET-22b作為表達(dá)載體，在低溫條件下誘導(dǎo)有利于融合蛋白的表達(dá)，在一定程度上可增加表達(dá)蛋白的可溶性[21]，本研究獲得 pET-22b-Hc-daf-22可溶性重組蛋白。

在模式生物C. elegans體內(nèi)，Ce-DAF-22通過參與過氧化酶體長鏈脂肪酸代謝途徑從而影響脂肪顆粒的體內(nèi)積聚而改變蟲體的發(fā)育方向[22-23]。分析發(fā)現(xiàn)Hc-DAF-22的N末端具有典型的參與長鏈脂肪酸代謝的I型脂肪酸硫解酶（即3-酮脂酰輔酶A硫解酶）功能域，在C末端具有典型的酰基輔酶A轉(zhuǎn)移酶的保守功能域，具有類似于 Ce-DAF-22硫解酶活性的潛力[24]。由此推測在H. contortus體內(nèi)同樣存在與上述C. elegans相似的脂肪酸代謝途徑，而 Hc-DAF-22具有長鏈脂肪酸硫解酶活性，參與線蟲生活方式的某些劇變過程，參與決定蟲體進(jìn)入寄生階段后的發(fā)育方向，而參與滯育形成只是其影響蟲體生長發(fā)育的表現(xiàn)之一[25]。本試驗(yàn)參照C. elegans硫解酶測定方法[26]對Hc-daf-22硫解酶活性進(jìn)行體外測定，了解Hc-DAF-22硫解酶活性及其他生化特性，并比較秀麗線蟲與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲DAF-22硫解酶活性差異。體外酶活測定試驗(yàn)結(jié)果顯示，Hc-DAF-22 最佳反應(yīng)pH為8.0，此結(jié)果與李志杰[27]研究秀麗線蟲 Ce-DAF-22蛋白酶活所得結(jié)果一致，且哺乳動(dòng)物同源蛋白酮脂酰輔酶A硫解酶最適反應(yīng)pH為8.3[28]，說明該硫解酶最適反應(yīng)pH一致，均在弱堿環(huán)境下反應(yīng)活性最高。本試驗(yàn)測得，Hc-DAF-22最佳酶活反應(yīng)溫度為37℃，在相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，37℃蛋白可完全反應(yīng)，其最佳反應(yīng)溫度與環(huán)境溫度及宿主體溫相比，與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲所寄生宿主牛羊體溫更為接近，說明該蛋白在寄生階段酶活反應(yīng)效率較高，推測捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在寄生階段因能量需求更大，脂肪酸代謝比自由生活階段強(qiáng)烈[29]。另一方面已有研究表明在 Hc-daf-22基因在蟲體滯育階段差異表達(dá)，達(dá)脫鞘L3幼蟲（ExL3）與L4階段呈高豐度表達(dá)[21]，因此推測與Hc-daf-22在寄生階段參與H. contortus的滯育形成有關(guān)。

圖4 Hc-DAF-22蛋白酶活測定相關(guān)數(shù)據(jù)Fig. 4 Enzyme activity deternimation of Hc-DAF-22

本試驗(yàn)采用了經(jīng)典的硫解酶Mg2+測定法，首次測定得捻轉(zhuǎn)血矛線蟲 DAF-22蛋白硫解酶活性參數(shù)Vmax=1 784 nmol·L-1·min-1，Km=33.765 μmol·L-1。李志杰等[27]測得 Ce-DAF-22蛋白硫解酶活參數(shù)為 Vmax= 2 810 nmol·L-1·min-1，Km=13 μmol·L-1；JIA等[30]測得鼠過氧化物酶體3-酮脂酰輔酶A硫解酶硫解酶活參數(shù)為Vmax=30 000 nmol·L-1·min-1，Km=21 μmol·L-1。與這些同源蛋白相比，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲DAF-22蛋白，酶活性與Ce-DAF-22接近但仍偏??；與鼠過氧化物酶體3-酮脂酰輔酶A硫解酶相比，酶活性為鼠硫解酶的十分之一左右?？傮w來說，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲DAF-22蛋白酶活性相對較低，所需反應(yīng)較長，其 Km較高，達(dá)最大反應(yīng)速度時(shí)所需的底物濃度相對較高。

4 結(jié)論

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲DAF-22蛋白是過氧化物酶體脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶之一，本研究在利用E. coli BL21對 HC-DAF-22進(jìn)行了表達(dá)，經(jīng)純化、復(fù)性后，該重組蛋白能夠?qū)σ阴Ｒ阴］o酶 A體現(xiàn)出一定的催化活性，Vmax和 Km值分別是 33.765 μmol·L-1和 1 784 nmol·L-1·min-1，其最適反應(yīng)pH為8.0，最佳反應(yīng)溫度為37℃，結(jié)果表明Hc-DAF-22具有一定硫解酶活性，但與秀麗線蟲同源蛋白相比硫解酶活性較低。

[1] WANG C R, QIU J H, ZHU X Q, HAN X H, NI H B, ZHAO J P, ZHOU Q M, ZHANG H W, LUN Z R. Survey of helminths in adult sheep in Heilongjiang Province, People's Republic of China. Veterinary Parasitology, 2006, 140: 378-382.

[2] 沈效平. 湖南山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染調(diào)查及rDNA ITS遺傳差異分析[D]. 長沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

SHEN X P. Investigating prevalence and researching genetic differences of rDNA ITS of Haemonchus contortus from goat in Hunan[D]. Changsha: Hunan Agricultural University, 2013. (in Chinese)

[3] 解曉鈺, .博州地區(qū)羊消化道寄生蟲感染調(diào)查及冬季驅(qū)蟲試驗(yàn)研究[D]. 烏魯木齊: 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

XIE X Y. Investigation on the infection of digestive parasites in sheep in Bo-zhou area and winter expel parasites experiment study[D]. Wurumuqi: Xinjiang Agricultural University, 2009.(in Chinese)

[4] GETACHEW T, DORCHIES P, JACQUIET P. Trends and challenges in the effective and sustainable control of Haemonchus contortus infection in sheep. Review. Parasite-journal De La Societe Francaise De Parasitologie, 2007, 14: 3-14.

[5] KEARNEY P E, MURRAY P J, HOY J M, HOHENHAUS M, KOTZE A. The ‘Toolbox’ of strategies for managing Haemonchus contortus in goats: What’s in and what’s out. Veterinary Parasitology, 2016, 220: 93-107.

[6] CAMPBELL B E, BOAG P R, HOFMANN A, CANTACESSI C, WANG C K, TAYLOR P, HU M, SINDHU Z U, LOUKAS A, STERNBERG P W, GASSER R B. Atypical (RIO) protein kinases from Haemonchus contortus--promise as new targets for nematocidal drugs. Biotechnology Advance, 2011, 29(3): 338-350.

[7] ALBARQI M M, STOLTZFUS J D, PILGRIM A A, NOLAN T J, WANG Z, KLIEWER S A, MANGELSDORF D J, LOK J B. Regulation of life cycle checkpoints and developmental activation of infective larvae in Strongyloides stercoralis by dafachronic acid. PLoS Pathogens, 2016, 35: 570-574.

[8] LI N C, FAN J, PAPADOPOULOS V. Sterol carrier protein-2, a nonspecific lipid-transfer protein, in intracellular cholesterol trafficking in testicular leydig cells. PLoS One, 2016, 11: e0149728.

[9] REUSS S H V, BOSE N, SRINIVASAN J, YIM J J, JUDKINS J C, STERNBERG P W, SCHROEDER F C. Comparative metabolomics reveals biogenesis of ascarosides, a modular library of small-molecule signals in C. elegans. Journal of the American Chemical Society, 2012, 134: 1817-1824.

[10] LUDEWIG A H, SCHROEDER F C. Ascaroside signaling in C. elegans. Wormbook the Online Review of C. elegans Biology, 2013, 18: 1-22.

[11] JOO H J, YIM Y H, JEONG P Y, JIN Y X, LEE J E, KIM H, JEONG S K, CHITWOOD D J, PAIK Y K. Caenorhabditis elegans utilizes dauer pheromone biosynthesis to dispose of toxic peroxisomal fatty acids for cellular homoeostasis. Biochemical Journal, 2009, 422: 61-71.

[12] JOO H J, KIM K Y, YIM Y H, JIN Y X, KIM H, KIM M Y, PAIK Y K. Contribution of the peroxisomal acox gene to the dynamic balance of daumone production in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry, 2010, 285: 29319-29325.

[13] ZHANG S O, BOX A C, XU N Y, MEN J L, YU J, GUO F, TRIMBLE R, MAK H Y. Genetic and dietary regulation of lipid droplet expansion in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107: 4640-4645.

[14] WANG R, KNIAZEVA M, HAN M. Peroxisome protein transportation affects metabolism of branched-chain fatty acids that critically impact growth and development of C. elegans. PLoS One, 2013, 8(8):e76270.

[15] SRINIVASAN J, VON REUSS S H, BOSE N, ZASLAVER A, MAHANTI P, HO M C, O’DOHERTY O G, EDISON A S, STERNBERG P W, SCHROEDER F C. A modular library of small molecule signals regulates social behaviors in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology, 2012, 10:e1001237-e1001237.

[16] JEONG P Y, KWON M S, JOO H J, PAIKY K. Molecular time-course and the metabolic basis of entry into dauer in Caenorhabditis elegans. PLoS One , 2009, 4:e4162.

[17] LI F, LOK J B, GASSER R B, KORHONEN P K., SANDEMAN M R, SHI D, ZHOU R, LI X, ZHOU Y, ZHAO J. Hc-daf-2 encodes an insulin-like receptor kinase in the barber’s pole worm, Haemonchus contortus , and restores partial dauer regulation. International Journal for Parasitology, 2014, 44: 485-496.

[18] PENKOV S, KAPTAN D, ERKUT C, SAROV M, MENDE F, KURZCHALIA T V. Integration of carbohydrate metabolism and redox state controls dauer larva formation in Caenorhabditis elegans. Nature Communications, 2015, 6: 8060.

[19] MADERN D, CAI X, ABRAHAMSEN M S, GUAN Z. Evolution of Cryptosporidium parvum lactate dehydrogenase from malate dehydrogenase by a very recent event of gene duplication. Journal of Medical Molecular Biology, 2006, 21: 489-497.

[20] 張紅麗. 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲滯育相關(guān)基因daf-22和hsp70全基因的獲得及其功能的研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2012.

ZHANG H L. Acquiring and function study of Haemonchus contortus arrested development related genes daf-22 and hsp70[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2012. (in Chinese)

[21] LIU J, NING B, LIU M, SUN Y, SUN Z, ZHANG Y, FAN X, ZHOU Z, GAO Z. Construction of ribosome display library based on lipocalin scaffold and screening anticalins with specificity for estradiol. Analyst, 2012, 137: 2470-2479.

[22] MCCORMICK M A, DELANEY J R, TSUCHIYA M, TSUCHIYAMA S, SHEMORRY A, SIM S, CHOU C Z, AHMED U, CARR D, MURAKAMI C J. A Comprehensive analysis of replicative lifespan in 4,698 single-gene deletion strains uncovers conserved mechanisms of aging. Cell Metabolism, 2015, 22: 895-906.

[23] CUI Y F, LI Z L, ZHAO E P, JIA Y F, LI D H, JU Z, CUI N Q. Overexpression of sterol carrier protein-2 in patients with hereditary cholesterol gallstones. BioMed Central Gastroenterology, 2011, 11: 784-788.

[24] GALLEGOS A M, ATSHAVES B P, STOREY S M, STARODUB O, PETRESCU A D, HUANG H, MCINTOSH AL, MARTIN G G, CHAO H, KIER A B. Gene structure, intracellular localization, and functional roles of sterol carrier protein-2. Progress in Lipid Research, 2001, 40: 498-563.

[25] LANGROVá I, MAKOVCOVá K, VADLEJCH J, JANKOVSKá I, PETRTYL M, FECHTNER J, KEIL P, LYTVYNETS A, BORKOVCOVá M. Arrested development of sheep strongyles: onset and resumption under field conditions of Central Europe. Parasitology Research, 2008, 103: 387-392.

[26] LENITAV, MATTS N, EKLUND D M, ALM C, ERIKSSON A K, TUUF J, SALMINEN T A, MATTJUS P, EDQVIST J. Characterization of SCP-2 from Euphorbia lagascae reveals that a single Leu/Met exchange enhances sterol transfer activity. Febs Journal, 2006, 273: 5641–5655.

[27] 李志杰. 線蟲線粒體極長鏈脂酰CoA脫氫酶、烯脂酰CoA水合酶和硫解酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究[D]. 天津: 南開大學(xué), 2010.

LI Z J. Research on the structure and function of Caenorhabditis elegans mitochondrial very long chain acyl-CoA dehydrogenase enoyl-CoA hydratase and thiolase[D]. Tianjin: Nankai University, 2010.(in Chinese)

[28] RADEK J T, DYER D H, LAN Q. Effects of mutations in Aedes aegypti sterol carrier protein-2 on the biological function of the protein. Biochemistry, 2010, 49: 7532-7541.

[29] YAN B, GUO X, ZHOU Q, YI Y, CHEN X, SUN W, DU A. Hc-fau, a novel gene regulating diapause in the nematode parasite Haemonchus contortus. International Journal for Parasitology, 2014, 44: 775-786.

[30] JIA Z, DING L. Expression and purification of His-tagged rat mitochondrial 3-ketoacyl-CoA thiolase wild-type and His352 mutant proteins. Protein Expression & Purification, 2004, 35: 320-326.

（責(zé)任編輯 林鑒非）

Characteristics of Hc-daf-22 Gene from Haemonchus contortus: Crokaryotic Expression and Its Enzymatic Activity

ZHENG XiuPing1, DING HaoJie1, GUO XiaoLu1, YANG Yi1, HUANG Yan1, CHEN XueQiu1, ZHOU QianJin2, DU AiFang1

(1Institute of Preventive Veterinary Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310029;2School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211 Zhejiang)

【Objective】 Haemonchus contortus is one of the major gastrointestinal nematodes infecting millions of ruminants, the disease (haemonchosis) is nationally epidemic in China. In order to analyze the biochemical properties of Hc-DAF-22 in Haemonchus contortus, the enzyme activity of renatured Hc-DAF-22 was measured in this study. By the results of enzyme activity assay, the role of Hc-DAF-22 protein will be understood in peroxisomal β-oxidation. 【Method】 First, the full-length of open reading frame of Hc-daf-22 was amplified by PCR from total cDNA of adult H. contortus ZJ Strain （GenBank：HQ738470.1）. A recombinant pET-22b-Hc-daf-22 was constructed and transformed into E. coli BL21 strain; and its prokaryotic expression was induced for four hours by IPTG (0.1 mmol·L-1). Then the bacterial liquid was centrifuged and the cells were resuspended in PBS solution (50 mmol·L-1). After verification by SDS-PAGE and Western blot, the prokaryotic Hc-DAF-22 was purified by Ni-chelating affinity chromatography and concentrated by ultrafiltration tube. The concentration of protein was measured according to the protein concentration assay kit. Acetoacetylat natural state of CoA can occur keto - enol tautomerase and then enol compound is formed. Using this property, taking acetoacetyl coenzyme A as the substrate, the enzyme activity of renatured Hc-DAF-22 was measured in the reaction system (50 mmol·L-1Tris-Cl pH8.1, 20 mmol·L-1MgCl2,60 μmol·L-1CoA, 10 μmol·L-1AcAc-CoA, 0.1 μg protein). Different temperatures and pH were set in order to determine the optimum reaction conditions. 【Result】 The results showed that Hc-daf-22 gene was successfully cloned and gene similarity was 99.9% compared with H. contortus ZJ strain. Recombinant Hc-daf-22 could be expressed in E. coli BL21 and it could be detected both in the lysate supernate and precipitates, and molecular weight of the fusion protein was about 59 kD. The enzyme assay indicated that it could catalyze the substrate acetoacetyl coenzyme A, suggesting the activity of thiolase. And the optimal pH of this reaction was 8 and the optimal temperature was 37oC. Under the optimal reaction conditions, the Michaelis constant Kmand the maximum reaction velocity Vmaxwere 33.765 μmol·L-1and 1 784 nmol·L-1·min-1, respectively. 【Conclusion】 H. contortus DAF-22 protein is a key enzyme of peroxisome β-oxidation, this experiment is successfully determined the Hc-DAF-22 protein activity using in vitro activity test. It was proved that Hc-DAF-22 has a certain thiolase activity, but is low compared with the Caenorhabditis elegans homolog protein.

Haemonchus contortus; Hc-daf-22; prokaryotic expression; enzyme activity assay; β-oxidation

2016-07-01；接受日期：2017-01-22

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（“973”計(jì)劃）（2015CB150300）、浙江省自然科學(xué)基金（LY14C180002）

聯(lián)系方式：鄭秀平，Tel：13738144872；E-mail：13738144872@163.com。通信作者杜愛芳，Tel：0571-88982583；E-mail：afdu@zju.edu.cn