神經(jīng)示蹤技術在針灸研究中的應用

周姍姍,賈成禎,尹磊淼,徐玉東,劉艷艷,楊莎莎,楊永清,王宇

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神經(jīng)示蹤技術在針灸研究中的應用

周姍姍,賈成禎,尹磊淼,徐玉東,劉艷艷,楊莎莎,楊永清,王宇

(上海中醫(yī)藥大學,上海市針灸經(jīng)絡研究所,上海 200030)

經(jīng)絡效應的神經(jīng)解剖基礎是針灸機制研究熱點之一,其效應主要取決于穴位、脊髓、腦針灸信息的產(chǎn)生、傳導、整合與輸出。神經(jīng)示蹤技術是神經(jīng)生物學基本方法。該文介紹了近年來神經(jīng)示蹤技術在針灸領域應用進展,總結了針灸研究中應用的神經(jīng)示蹤劑種類、標記經(jīng)絡和腧穴相關神經(jīng)元及其神經(jīng)纖維在脊髓階段和大腦區(qū)域性分布規(guī)律,為針灸效應神經(jīng)生物學機制研究提供方法學參考。

神經(jīng)示蹤技術;針灸研究;經(jīng)絡;針刺穴位;綜述

針灸效應是通過調(diào)控神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡途徑實現(xiàn)的,具有多環(huán)節(jié)、多靶向特征[1],其效應主要取決于穴位、脊髓、腦這三個關鍵系統(tǒng)針灸信息的產(chǎn)生、傳導、整合與輸出[2]。經(jīng)穴效應的神經(jīng)生物學基礎始終是針灸機制研究熱點。自20世紀80年代陶之理等[3]首次將辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)應用到腧穴神經(jīng)支配研究以來,經(jīng)絡腧穴研究開始從區(qū)域水平走向細胞水平[4]。此后,眾多的神經(jīng)示蹤劑不斷應用到針刺效應神經(jīng)解剖機制研究中。本文總結了針灸研究中應用的神經(jīng)示蹤劑種類、標記經(jīng)絡和腧穴相關神經(jīng)元及其神經(jīng)纖維在脊髓階段和大腦區(qū)域性的分布規(guī)律,為針灸效應的神經(jīng)生物學機制研究提供方法學參考。

神經(jīng)示蹤劑在體內(nèi)主要通過軸漿運輸(axoplasmic transport)追蹤神經(jīng),按照運輸方式分為三類,順行示蹤劑、逆行示蹤劑、跨突觸示蹤劑[5]。其中逆行示蹤劑在針灸研究中應用較多。

1 逆行示蹤劑

逆行示蹤劑主要有辣根過氧化物酶[6-8]、霍亂毒素、熒光染料(熒光素、羰花青染料、熒光葡聚糖、熒光微球)等。在針灸研究中,主要用來標記經(jīng)絡或腧穴,研究相關神經(jīng)元及其神經(jīng)纖維在脊髓階段和大腦區(qū)域性分布規(guī)律[9-27],見表1。

1.1 辣根過氧化物酶(HRP)

HRP是一種提取于植物蛋白的雙向神經(jīng)示蹤劑[6],常用于逆行標記神經(jīng),可標記周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。標記后動物存活1 d,在鏡下觀察切片,可見細胞質(zhì)中呈顆粒樣分布的HRP,并能看到神經(jīng)元突起和神經(jīng)末梢[7]。存活5 d,鏡下觀察HRP出現(xiàn)褪色[6]。HRP能和不同的基團如麥芽凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)、霍亂毒素(cholera toxin subunit-B,CTB)結合形成新的神經(jīng)示蹤劑WGA-HRP、CTB-HRP,提高了靈敏度[8]。

1.1.1 研究腧穴神經(jīng)支配

HRP標記腧穴,可標記脊神經(jīng)節(jié)無髓纖維和細感覺纖維、脊髓后角第Ⅰ、脊髓后角Ⅱ?qū)?、延髓薄束核、面神?jīng)核和脊髓前角第Ⅸ層。

李繼偉[9]將5mL～6mL濃度為30%HRP溶液注射到錦鯉類似經(jīng)絡的神經(jīng)纖維處,發(fā)現(xiàn)標記細胞分布在面神經(jīng)核,該核團位于小腦與延髓迷葉間的面葉深部,居于腦橋下部被蓋部的腹外側(cè)網(wǎng)狀結構內(nèi)。蔣瑾等[10]將5mL濃度為1%HRP注射到Sprague-Dawley(SD)大鼠“太溪”穴區(qū)組織,標記的相關感覺神經(jīng)元分布在示蹤劑注入側(cè)L4～L6節(jié)段脊神經(jīng)節(jié)。細Ad感覺神經(jīng)纖維被標記,粗有髓纖維Aa、Ab未被標記,提示HRP吸收和傳送具有選擇性,主要被無髓和細有髓纖維吸收?？缟窠?jīng)節(jié)標記神經(jīng)元分布在L4～L6脊髓后角第Ⅰ、Ⅱ?qū)又虚g及延髓薄束核中間部,運動神經(jīng)元分布在示蹤劑注入側(cè)L4～L5階段脊髓前角第Ⅸ層后外側(cè)部及中外側(cè)部,可觀察到支配骨骼肌梭外肌a運動神經(jīng)元以及支配骨骼肌梭內(nèi)肌g運動神經(jīng)元。

1.1.2 研究經(jīng)絡神經(jīng)投射

HRP可分多點標記經(jīng)絡不同穴位來研究神經(jīng)投射,可標記脊神經(jīng)節(jié)、交感鏈及脊髓前角運動神經(jīng)元樹突。

李瑞午等[11]應用HRP研究乳鼠胃經(jīng)不同部位腧穴和相同部位不同經(jīng)絡腧穴神經(jīng)投射節(jié)段性分布,結果顯示,胃經(jīng)組“足三里”穴區(qū)和“陽陵泉”穴區(qū)標記的神經(jīng)元分布在L5～S2脊髓前角、L4～S2脊神經(jīng)節(jié),未在交感鏈發(fā)現(xiàn)標記細胞;“四白”穴區(qū)標記神經(jīng)元分布在交感神經(jīng)頸上節(jié)、上頸髓前角(副神經(jīng)核)、面神經(jīng)核、三叉神經(jīng)咀嚼核、三叉神經(jīng)中腦核和三叉神經(jīng)半月節(jié)。非胃經(jīng)組“梁門”穴區(qū)標記神經(jīng)元分布在T6～T9脊髓前角、T6～T10脊神經(jīng)節(jié),T6～T11交感鏈的神經(jīng)節(jié)?！拔赣帷毖▍^(qū)標記神經(jīng)元分布在T9～T11脊髓前角、T9～T12脊神經(jīng)節(jié),T9～T12交感鏈神經(jīng)節(jié)。根據(jù)不同穴區(qū)標記脊髓階段重疊情況不同,可推測胃和腹部腧穴主要在外周神經(jīng)發(fā)生聯(lián)系,胃與頭面部及下肢腧穴相關神經(jīng)可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生關系。劉克等[12]用1%CTB-HRP溶液分別注射到SD大鼠的足三陽經(jīng)胸腰段穴位肌肉,發(fā)現(xiàn)足三陽經(jīng)在脊髓前角運動神經(jīng)元樹突中特異性相互投射形成運動神經(jīng)元柱狀結構。在脊髓胸腰段,運動神經(jīng)元樹突纖維還特異性地投向脊髓交感節(jié)前神經(jīng)元區(qū),運動神經(jīng)元外側(cè)群樹突主要投向交感節(jié)前神經(jīng)元區(qū)中間外側(cè)柱,內(nèi)側(cè)細胞群樹突投向中央管周圍交感節(jié)前神經(jīng)元區(qū)。提示脊髓前角運動神經(jīng)元對交感節(jié)前神經(jīng)元樹突投射可能參與穴位對內(nèi)臟生理活動的調(diào)節(jié)。

1.1.3 研究腧穴和內(nèi)臟聯(lián)系

HRP還可同時標記體表腧穴和內(nèi)臟,研究兩者之間神經(jīng)聯(lián)系。趙英俠等[13]將10mL濃度為30%HRP溶液注射到SD大鼠“命門”穴區(qū)及卵巢、腎上腺實質(zhì)內(nèi),發(fā)現(xiàn)三者的傳入神經(jīng)在脊神經(jīng)節(jié)T15～L2節(jié)段互相重疊,為體表穴位治療臟腑疾病提供了形態(tài)學基礎。

1.2 霍亂毒素類示蹤劑

霍亂毒素亞單位B(Cholera toxin subunit-B, CTB)能與神經(jīng)細胞膜表面GM1神經(jīng)節(jié)苷脂特異性結合,可順行或逆行示蹤神經(jīng),中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)均可標記[14]。注入動物體內(nèi)后,存活期一般為3～5 d。CTB可以和免疫熒光或者免疫組化技術結合,操作簡單,結果清晰,易于觀察。CTB和不同熒光基團結合,形成發(fā)出不同顏色熒光的神經(jīng)示蹤劑,如CTB- Alexa488、555、594、647,具有注射區(qū)域小,穩(wěn)定性強,熒光強度高的優(yōu)點[15]。

1.2.1 研究腧穴的神經(jīng)支配

CTB標記腧穴,可觀察到Aa、Ag、Ad、C感覺神經(jīng)纖維,脊髓后角Ⅲ、Ⅳ層及延髓薄束核、面神經(jīng)核和脊髓前角Ⅸ層。

哈麗娟等[16]用5mL濃度1%CTB標記SD大鼠涌泉穴區(qū)組織,標記相關感覺神經(jīng)元分布在示蹤劑注入側(cè)L3～L5節(jié)段脊神經(jīng)節(jié),a、g運動神經(jīng)元分布在示蹤劑注入側(cè)L3～L6節(jié)段脊髓前角后外側(cè),跨神經(jīng)節(jié)標記神經(jīng)元分布在L3～L4脊髓后角第Ⅲ、Ⅳ層內(nèi)側(cè)端及延髓薄束核。用紅色熒光示蹤劑CTB-Alexa594標記合谷穴,標記相關感覺神經(jīng)元分布在注入側(cè)C5～T1脊神經(jīng)節(jié)中,運動神經(jīng)元分布在注入側(cè)C6～T1脊髓前角后外側(cè)[17]。有學者[18-20]應用綠色熒光示蹤劑CTB-Alexa488分別標記SD大鼠環(huán)跳、委中、承山、三陰交穴區(qū)組織,存活期2～3 d后,在熒光顯微鏡下可觀察到標記的a、g運動神經(jīng)元胞體和樹突。環(huán)跳穴可觀察到不同直徑Aa、Ag、Ad、C感覺神經(jīng)纖維,相關感覺神經(jīng)元分布在示蹤劑注入側(cè)T13～L6節(jié)段脊神經(jīng)節(jié),運動神經(jīng)元分布在注入側(cè)L1～L5節(jié)段脊髓前角前外側(cè)部[18];委中穴標記相關感覺神經(jīng)元分布在示蹤劑同側(cè)L2～L6節(jié)段脊神經(jīng)節(jié),運動神經(jīng)元分布在示蹤劑同側(cè)L3～L5節(jié)段脊髓前角中外側(cè),以L4居多[18];承山穴相關感覺神經(jīng)元分布在示蹤劑注入側(cè)L4～L5節(jié)段脊神經(jīng)節(jié),運動神經(jīng)元分布在示蹤劑注入側(cè)L4～L5節(jié)段脊髓前角第Ⅸ層中外側(cè)[20];三陰交穴相關感覺神經(jīng)元分布在示蹤劑注入側(cè)L3～L6節(jié)段脊神經(jīng)節(jié),運動神經(jīng)元分布在示蹤劑注入側(cè)L3～L6節(jié)段脊髓前角后側(cè)中間[19]。

1.2.2 研究腧穴和內(nèi)臟聯(lián)系

CTB類示蹤劑標記內(nèi)臟,可追蹤到交感神經(jīng)節(jié)。

朱新龍[21]用CTB-Alexa488和CTB-Alexa594兩種示蹤劑研究SD大鼠太溪穴和腎臟的聯(lián)系。將6mL濃度為0.1%CTB-Alexa488溶液注入腎臟,選擇上、內(nèi)、外三點,注入到腎臟表層(包膜與腎實質(zhì)之間),5mL 0.1%CTB-Alexa594溶液注入太溪穴。結果在脊髓及背根結內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量雙標記神經(jīng)元,此外,在交感神經(jīng)節(jié)內(nèi)觀察到了標記的神經(jīng)元胞體。

表1 逆行示蹤劑在針灸研究中的具體應用

續(xù)表1

注:“—”未提到

1.3 熒光類示蹤劑

熒光示蹤劑暴露在一定波長激光下能發(fā)出不同顏色,可直接在熒光顯微鏡下觀察,不需要經(jīng)過后期顯色。主要包括熒光素、羰花青染料、熒光葡聚糖、熒光微球和熒光納米粒[22]。針灸中應用較多的為熒光素,主要有雙苯甲亞胺(bisbenzimide,Bb)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)、核黃(nuclear yellow,NY)、快藍(fast blue,FB)、熒光金(fluro-gold,FG)。熒光素在體內(nèi)易擴散,激光照射后容易褪色,不容易長時間保存[23]。

1.3.1 研究腧穴神經(jīng)支配

熒光類示蹤劑可研究單個腧穴的神經(jīng)支配。

衣華強等[24]用PI標記Wistar大鼠足陽明胃經(jīng)足三里穴位組織,存活2～2.5 d后將動物灌流固定,取出同側(cè)T5～L3脊神經(jīng)節(jié),熒光顯微鏡下觀察脊髓冰凍切片發(fā)現(xiàn),PI標記細胞主要分布在T9～L1脊神經(jīng)節(jié)段。Jia ZF等[25]用10 mg/cm3熒光納米粒0.06 mL注入Wistar或SD大鼠足三里穴位組織,存活4 h灌注固定后將坐骨神經(jīng)做冰凍切片,發(fā)現(xiàn)納米粒子沿著坐骨神經(jīng)神經(jīng)外膜和神經(jīng)束膜中的淋巴管進入脊神經(jīng)。

1.3.2 研究腧穴和內(nèi)臟聯(lián)系

不同顏色的熒光示蹤劑可分別注入腧穴和臟腑,用于研究兩者之間神經(jīng)聯(lián)系[26-45],見表2。

表2 熒光雙標法在針灸研究中的應用

PI標記胞漿,發(fā)橘紅色熒光;Bb標記胞核,發(fā)藍色熒光。衣華強等[26]用PI和Bb雙標研究Wistar大鼠俞募穴和相應臟腑在脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)標記細胞出現(xiàn)節(jié)段。大鼠麻醉后,在俞穴或募穴注射15mL濃度為5%PI,存活 24 h左右重新腹腔麻醉開腹,在相應臟器包膜下向各個方向緩慢注入20mL濃度為10%Bb,關閉腹腔,存活12 h后,4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1M,pH7.2～7.4)灌注,取出同側(cè)脊神經(jīng)節(jié),在熒光顯微鏡下觀察冰凍切片,得出俞募穴與臟腑在相同或相近脊髓節(jié)段的傳入神經(jīng)存在神經(jīng)聯(lián)系,并在脊神經(jīng)節(jié)進行整合。傳入神經(jīng)元在不同脊神經(jīng)節(jié)會聚是俞募配穴針刺效應的重要形態(tài)學基礎。

1.3.3 研究大腦核團的神經(jīng)聯(lián)系

熒光示蹤劑可標記大腦核團。陳杰斯[27]用0.5mL濃度為4%FG微量注射到SD大鼠孤束核內(nèi),存活1星期后,先經(jīng)2.5%福爾馬林灌胃,4%多聚甲醛和0.1 mol/L磷酸緩沖液灌注,取出延髓,固定脫水后制作冰凍切片,在熒光顯微鏡下觀察到FG標記的陽性細胞從三叉旁核向同側(cè)孤束核投射。

2 跨突觸示蹤劑

常用的跨突觸示蹤劑包括WGA-HRP、CTB-HRP以及嗜神經(jīng)病毒。其中嗜神經(jīng)病毒應用最多,它在宿主神經(jīng)元內(nèi)復制增值,經(jīng)過一定存活期示蹤信號可放大[28]。病毒類示蹤劑主要分兩類[23],一類是腺病毒和腺相關病毒(adeno-associated virus,rAAV)。主要以腺病毒為載體,將各種神經(jīng)營養(yǎng)因子或熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入體內(nèi)進行神經(jīng)修復或神經(jīng)示蹤研究[29],優(yōu)點是能根據(jù)研究目的對病毒基因進行改造和重組;另一類是嗜神經(jīng)病毒(neurotropic virus),主要有Ⅰ型單純皰疹病毒(herpes simplex virus-1,HSV1)、狂犬病毒(Rabies virus)和豬a皰疹病毒(porcine alpha-herpes virus, PrV)。病毒示蹤劑具有一定致病性,如HSV1能引起動物發(fā)熱,PrV會使動物全身發(fā)癢[30]。研究病毒實驗室的生物安全級別需至少達到2級[31]。

病毒示蹤劑可注射到腧穴,研究腧穴神經(jīng)支配。張鳳[32]在“關元”穴注射10mL滴度為107PFU/ml偽狂犬病毒PrV,存活3 d后,在鏡下觀察切片,發(fā)現(xiàn)病毒感染主要分布在脊髓腰、胸、頸段腹側(cè)和背側(cè)角,腦干孤束核、楔束核、巨細胞網(wǎng)狀核、迷走神經(jīng)背核、三叉神經(jīng)脊束核、中縫大核、藍斑、腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核、腦橋被蓋網(wǎng)狀核、小細胞網(wǎng)狀核、三叉神經(jīng)主核、三叉神經(jīng)中腦核、斜方體核、旁正中網(wǎng)狀核、外側(cè)網(wǎng)狀核、下橄欖核、丘腦腹側(cè)核、中央灰質(zhì)、海馬、隔內(nèi)側(cè)核、下丘腦室旁核、視交叉部的弓狀核、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、斜角帶核、外側(cè)視前區(qū)以及皮層紋狀區(qū)等部位。

3 討論

神經(jīng)示蹤技術的發(fā)展為經(jīng)絡腧穴神經(jīng)解剖研究提供了有力工具。近年來,腦功能成像技術出現(xiàn)使腦區(qū)功能可視化成為可能[33],并已應用到針刺效應神經(jīng)機制研究領域[34]。

神經(jīng)示蹤技術應用于針灸研究,在以下兩方面有待進一步:(1)應用的神經(jīng)示蹤劑種類少,主要應用逆行示蹤劑(HRP、CTB)以及熒光素類示蹤劑(PI、Bb)。新型示蹤劑具有穩(wěn)定、準確等多種優(yōu)點,但很少或未被應用在經(jīng)絡腧穴研究中,如羰化青染料(carbocyanine -dyes),可標記活體和固定組織,具有低毒性、穩(wěn)定性;熒光微球(fluorescent microspheres)[35],在體內(nèi)不易擴散并且可長時間保存;熒光納米粒[36],可準確標記神經(jīng);NIR探針(Tc-Alexa790)[37],具有神經(jīng)特異性;熒光分子BMB、GE3082和GE3011[38-39],具有髓鞘靶向性。(2)先進示蹤技術在針灸神經(jīng)研究中應用少,如轉(zhuǎn)基因熒光小鼠,不需要其他示蹤劑標記,可直接在熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元軸突結構。熒光顯微光學斷層成像技術(fluorescent micro-optical sectioning tomo- graphy,fMOST),可對小鼠全腦樣本精細結構三維成像,長距離追蹤神經(jīng)元在全腦的軸突投射,分辨率達到亞微米級[46]。

綜上所述,傳統(tǒng)逆行神經(jīng)示蹤劑在針灸研究中應用廣泛,新型神經(jīng)示蹤劑和先進示蹤技術的應用將有助于針灸效應神經(jīng)生物學機制研究。

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The Application of the Neural Tracer Technique to Acupuncture Studies

,,,,,,,1.

200030,

The neuroanatomical basis of meridian effects is one of the focuses of acupuncture mechanism studies. Meridian effects depend mainly on the generation, conduction, integration and output of acupuncture information in the acupoint, spinal cord and brain. The neural tracer technique is a basic method in neurobiology. This article presents recent years’ advances in the application of the neural tracer technique to acupuncture field and summarizes the types of neural tracer used in acupuncture studies and regularities in the distribution of neurons and their fibers related to labeled meridians and acupoints in spinal segments and brain regions to provide methodological reference for studies on neurobiological mechanism of acupuncture effects.

Neural tracer technique; Acupuncture study; Meridian; Acupuncture point; Review

1005-0957(2017)04-0490-08

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.04.0490

2016-10-20

國家自然科學基金項目(81173332,81173341,81201753,81473760,81574058);上海市中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動計劃重大研究項目(ZYSNXD-CC-ZDYJ039,ZY3-CCCX-3-3005);上海市衛(wèi)計委項目(ZJ2016029)

周姍姍(1991—),女,2014級碩士生

王宇(1973—),男,副研究員,碩士生導師,Email:wy.sh.cn@163.com

楊永清(1964—),男,研究員,博士生導師,Email:yyq@shutcm.edu.cn