MSCs與CD34+單核細(xì)胞共培養(yǎng)聯(lián)合脫細(xì)胞支架植入體內(nèi)構(gòu)建兔陰莖海綿體

李瑞庭 劉志瀚 冀晨陽 肖小蓮 梁偉強(qiáng) 張金明

MSCs與CD34+單核細(xì)胞共培養(yǎng)聯(lián)合脫細(xì)胞支架植入體內(nèi)構(gòu)建兔陰莖海綿體

李瑞庭 劉志瀚 冀晨陽 肖小蓮 梁偉強(qiáng) 張金明*

目的研究將異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）和CD34+單核細(xì)胞（MNCs）共培養(yǎng)體系種植于脫細(xì)胞海綿體支架上在兔體內(nèi)構(gòu)建陰莖海綿體組織的可行性。方法分別從兔骨髓與兔外周血中提取并鑒定MSCs與CD34+MNCs，將兩種細(xì)胞組分以107/mL的密度種植于制備好的兔陰莖海綿體脫細(xì)胞膠原支架上，同時將相同密度的MSCs、CD34+MNCs分別種植于支架上，培養(yǎng)4天后植入一種兔陰莖海綿體缺損模型中。3個月后對工程化組織進(jìn)行取材，行H&E及Masson三色染色等組織學(xué)檢測。結(jié)果MSCs和CD34+MNCs共培養(yǎng)組近白膜處的海綿體保留了正常海綿體結(jié)構(gòu)，而MSCs組、CD34+單核細(xì)胞組及空白支架組以疤痕增生為主，盡管較之CD34+單核細(xì)胞組及空白支架組，間充質(zhì)干細(xì)胞組疤痕組織中的血管數(shù)目較多（P＜0.05）。結(jié)論我們的研究證明了將MSCs和CD34+MNCs的共培養(yǎng)體系種植于脫細(xì)胞支架上植入兔體內(nèi)可以構(gòu)建出一段組織學(xué)上與原生海綿體相似的組織；CD34+MNCs在體內(nèi)主要通過協(xié)同MSCs而非單獨(dú)發(fā)揮其促血管化的生物學(xué)效應(yīng)。

CD34+單核細(xì)胞；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；脫細(xì)胞海綿體支架；組織工程；組織工程化陰莖海綿體；陰莖再造

0 背景

陰莖損傷，陰莖腫瘤以及一些先天性的生殖區(qū)畸形比如說嚴(yán)重的尿道下裂，膀胱外翻?尿道上裂綜合癥和性別分化障礙常常需要陰莖重建［1?3］。目前陰莖重建的效果局限于形態(tài)上大體令人接受，而無任何勃起功能。陰莖重建的常規(guī)方法包括各種皮瓣轉(zhuǎn)移［4?7］，這不僅導(dǎo)致受區(qū)的損傷，重構(gòu)的陰莖還無任何勃起功能。為了克服上述缺點(diǎn)，陰莖組織工程技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。陰莖組織工程旨在重構(gòu)一個無論在形態(tài)上還是在功能上都與原生的陰莖高度相似的器官，正是基于這樣一個誘人的前景，過去十余年間人們對陰莖組織工程進(jìn)行了大量研究［8?14］。值得一提的是，Chen等人宣稱他們團(tuán)隊(duì)成功地利用自體海綿體平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合海綿體脫細(xì)胞支架構(gòu)建出了一整段有功能的兔陰莖［11］。盡管在陰莖海綿體組織工程領(lǐng)域取得的巨大進(jìn)展，將動物成果轉(zhuǎn)化為人組織工程器官仍障礙重重，因?yàn)樵谂R床案例中很少有供利用的正常海綿體平滑肌及內(nèi)皮細(xì)胞。鑒于成體干細(xì)胞強(qiáng)大的分化特性以及旺盛的生殖特性，我們曾利用從肌肉中取得的間充質(zhì)干細(xì)胞（肌源性干細(xì)胞）構(gòu)建低容量的陰莖組織［12，13］。我們發(fā)現(xiàn)種植有肌源性干細(xì)胞的脫細(xì)胞支架在體內(nèi)發(fā)生了不同程度的纖維化和散在的組織壞死。

最近，我們注意到兩種細(xì)胞組分的組合，血管內(nèi)皮前體細(xì)胞（EPCs）和間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），可以大大提高新生血管的數(shù)量和質(zhì)量［15］。內(nèi)皮前體細(xì)胞主要分布于骨髓，成人外周血和人類臍帶血中，可以分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，不僅在胚胎發(fā)育時期參與血管生成和血管化，還在組織損傷修復(fù)的血管化中起重要作用［16］。有研究指出它們可以促進(jìn)心梗［17，18］及腦梗灶［19］的血管化。此外，在骨組織工程中，兩種細(xì)胞組分的聯(lián)合植入不僅可以促進(jìn)骨組織的血管化，還可以促進(jìn)骨細(xì)胞的生成［20，21］。

因此，在本研究中，我們利用了CD34+單核細(xì)胞（MNCs）——一種包含了EPCs的細(xì)胞亞群——與MSCs共培養(yǎng)，來檢驗(yàn)它們在陰莖組織工程中分化與再生的潛能。

1 材料和方法

1.1 脫細(xì)胞海綿體支架（ACCM）的制備

本研究中包含的所有動物實(shí)驗(yàn)方案由中山大學(xué)動物倫理委員會審批通過。根據(jù)之前文獻(xiàn)中描述的方案［12］，ACCM取材于死兔子的陰莖海綿體。簡單地講，首先將陰莖去除皮膚，尿道和肉膜，留下兩根相連的陰莖海綿體及環(huán)繞周圍的白膜，并將其橫切成4 mm長；然后將陰莖海綿體組織放入裝有清水的燒杯中，在4度環(huán)境中用磁力攪拌器攪拌24 h，使得部分細(xì)胞裂解，隨后再用2%的Triton X?100（Sigma?Aldrich）和0.1%的氨水?dāng)嚢杼幚?0天，1 mol/L的脫氧核酸酶（Sigma?Aldrich）處理12 h，最后再用磷酸緩沖鹽水處理24 h。脫細(xì)胞支架經(jīng)干燥處理后用環(huán)氧乙烷消毒，備用。從制備完成的脫細(xì)胞支架中隨機(jī)抽樣經(jīng)H&E染色和Masson三色染色確認(rèn)無細(xì)胞特性。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM?MSCs）的分離和擴(kuò)增

BM?MSCs取自5只雄性新西蘭兔的骨髓抽取物。簡略地說，用18G針頭和EDTA?K2處理過的注射器于兔一側(cè)髂骨穿刺抽取骨髓，抽取物用PBS以1∶2的比例稀釋，并將其置于Ficoll梯度溶液（Sigma?Aldrich）之上，用400 g的速度離心25 mins。離心后，單核細(xì)胞成分被吸出并被洗滌，用紅細(xì)胞裂解液去除其中的紅細(xì)胞成分，再將其種入裝有商品化兔間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基（賽業(yè)）的T?25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于敷箱中敷育5天。5天后，非貼壁的細(xì)胞被除去，被認(rèn)為是間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁細(xì)胞在相同條件下繼續(xù)敷育15天，隔天換一次培養(yǎng)基，直到瓶中細(xì)胞的匯合度達(dá)到80%～90%。用細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)檢測細(xì)胞樣本中的CD34抗原（Miltenyi Biotec），CD105抗原（Gene?Tex）以及α?SMA抗原（Sigma?Aldrich），確認(rèn)是否為MSCs。

1.3 外周血CD34+單核細(xì)胞（CD34+MNCs）的分離

與上述方法相似，CD34+單核細(xì)胞的提取也是通過密度梯度分離法完成的。不同的是，血抽自頸靜脈，以1∶1的比例用PBS稀釋，每50 mL離心管中裝20 mL稀釋液。洗滌之后，單核細(xì)胞組分被標(biāo)記上結(jié)合有FITC的抗CD34抗體（Sigma?Al?drich），之后再結(jié)合抗FITC的磁珠（Miltenyi Bio?tec）。根據(jù)供貨廠商的指南完成磁珠分選。陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本進(jìn)一步行流式檢測來確定每個樣本的陽性率。

1.4 兩種細(xì)胞組分的種植和共培養(yǎng)

以下所有的操作步驟都應(yīng)保證無菌。24只干燥且無菌的ACCM被放入96孔板中，每個孔放一只，隨后在有標(biāo)本的孔中加入培養(yǎng)基（每孔約200 μL）。標(biāo)本截面需與孔底垂直以保證兩截面都與培養(yǎng)基有相同的接觸機(jī)會，保證ACCM完全浸入培養(yǎng)基。在剩余的空白孔中加入PBS，96孔板放入4℃冰箱后靜置過夜。

在種植之前，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃敷箱中敷育20分鐘。第三或第四代的BM?MSCs被消化，離心和洗滌。獲取的細(xì)胞在培養(yǎng)基中重懸，加入或不加入相等數(shù)量的CD34+MNCs，樣本經(jīng)細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)保證其終濃度達(dá)到每毫升107個細(xì)胞。共培養(yǎng)，BM?MSCs，以及CD34+MNCs的細(xì)胞懸液以每類6孔，每孔200 μL的量加入共計18孔的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，剩余6孔中加入不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白支架組。支架在各樣的培養(yǎng)基中37℃敷育24 h。最后，經(jīng)各樣細(xì)胞懸液/培養(yǎng)基浸泡過的ACCM被轉(zhuǎn)移至24孔板中培養(yǎng)4天，每天更換培養(yǎng)基。用組織免疫熒光染色技術(shù)檢測支架樣本中的CD34抗原，CD105抗原以及α?SMA抗原。

1.5 移植

在包皮內(nèi)板上距包皮內(nèi)外板交界處約5 mm處環(huán)切，暴露肉膜，肉膜下陰莖背側(cè)部各有兩條血管。仔細(xì)分離并保留上述血管及尿道后截斷陰莖海綿體。4 mm長的支架插入陰莖海綿體兩殘端，用6?0聚乙醇酸縫線間斷縫合兩吻合端，并在兩吻合端用6?0聚丙烯縫線各縫一針作標(biāo)記。根據(jù)處理的不同，24只新西蘭白兔被隨機(jī)平均分為4組：共培養(yǎng)組種植有MSCs與CD34+MNCs共培養(yǎng)體系的ACCM，MSCs組植入種植有MSCs的ACCM，CD34+MNCs組植入種植有CD34+MNCs的ACCM，空白支架組植入浸泡有培養(yǎng)基的ACCM。術(shù)后3天所以實(shí)驗(yàn)動物均使用抗生素及鎮(zhèn)痛藥物。

1.6 組織學(xué)檢測

植入后三個月，余下23只兔子，1只兔子死于細(xì)菌感染。將這23只兔子麻倒后取材，于距吻合端約5 mm的正常組織處截斷陰莖海綿體，于每個移植物正中橫向截斷再生海綿體。用4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋，再用石蠟切片機(jī)橫切切成10 μm厚的切片行蘇木素?伊紅（H&E）染色及Masson三色染色。用光學(xué)顯微鏡行組織學(xué)檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

在顯微鏡下貼壁的細(xì)胞呈錐形或梭形，用細(xì)胞熒光測定術(shù)檢測后這些細(xì)胞被確認(rèn)為MSCs。抗CD34染色基本陰性，而抗CD105及抗α?SMA染色為陽性結(jié)果。對經(jīng)磁珠分選的樣本行流式回測，此樣本在經(jīng)磁珠分選時已標(biāo)記有抗CD34和FITC偶聯(lián)的信號。陽性分選標(biāo)本的陽性率為95.8%，而陰性分選標(biāo)本的陽性率僅為8.01%。脫細(xì)胞支架與Ji等人［12］描述的非常相似。簡而言之，支架的結(jié)構(gòu)與陰莖海綿體脫細(xì)胞前大致相似，但經(jīng)處理的支架顏色蒼白，質(zhì)地柔軟。（圖1）在組織學(xué)層面上，肉眼可辨別的血竇結(jié)構(gòu)更少，膠原纖維的排布更松散。在切片中未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)。Masson三色染色顯示空白支架中均為膠原纖維，無平滑肌細(xì)胞。（圖2）

圖1 兔陰莖海綿體脫細(xì)胞支架大體觀：

圖2 脫細(xì)胞支架的組織學(xué)檢測

3個月后將所有動物處死取材。在共培養(yǎng)組的大體標(biāo)本中，可看見新生海綿體色澤紅潤，觸之稍軟；而空白支架組的標(biāo)本則較為蒼白，觸之硬韌。（圖3）在HE染色中，僅有共培養(yǎng)組近白膜處保留了正常海綿體的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，其中包含了上千個血竇結(jié)構(gòu)（黑色箭頭標(biāo)出），在血竇結(jié)構(gòu)之間穿插有排列不規(guī)則的脈管結(jié)構(gòu)（藍(lán)色箭頭標(biāo)出）。Masson三色染色顯示，血竇結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步分成了多個平滑肌成分單位（紅染），后者可以被包裹及突入其中的膠原纖維（藍(lán)染）區(qū)別。相反在其他組別中，海綿體正常結(jié)構(gòu)被破壞，取而代之的是無再生平滑肌肌束的疤痕組織。有意思的是，在MSCs組別中，盡管也充滿著纖維化的疤痕組織，但血管化程度明顯高于CD34+MNCs組和空白支架組。（圖4）

圖3 植入3月后的組織工程化海綿體大體觀

圖4 ?1植入3月后的組織工程化海綿體組織學(xué)檢測

圖4 ?2植入3月后的組織工程化海綿體組織學(xué)檢測

3 討論

據(jù)我們所知，之前并沒有人描述過兔正常陰莖海綿體血管的解剖。與人類的陰莖海綿體血管走行不同，兔陰莖背側(cè)近段及中段正中大體上無血管走行，無所謂陰莖背深靜脈。陰莖動靜脈與陰莖體平行走行于陰莖背側(cè)方，大約在10點(diǎn)和2點(diǎn)鐘的方向。靜脈在動脈側(cè)外方，夾著尿道。在遠(yuǎn)端，血管逐漸向背側(cè)及淺面發(fā)出分支?？紤]到兔陰莖血管特殊的走行，我們選擇陰莖中段為手術(shù)入路，并以環(huán)切方式保證分離尿道和血管的準(zhǔn)確性。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，盡管CD34+MNCs中富含血管前體細(xì)胞，但是作為海綿體組織工程的種子細(xì)胞，CD34+MNCs單獨(dú)使用的血管化效果并不理想。CD34+MNCs組不僅沒有再生出海綿體組織，在疤痕中的血管化效果甚至不及MSCs組。這說明在體內(nèi)，CD34+MNCs是通過協(xié)同MSCs而非單獨(dú)發(fā)揮其促血管化的生物學(xué)效應(yīng)。有文獻(xiàn)指出，相比內(nèi)皮細(xì)胞，MSCs被認(rèn)為可以分泌更多的VEGF，且在體外共培養(yǎng)系統(tǒng)里VEGF的表達(dá)有所上調(diào)［22］。此外，在體外實(shí)驗(yàn)中，EPCs參與維持MSCs的干性［23］。最后，MSCs的組織整合可以通過內(nèi)皮細(xì)胞集落形成細(xì)胞源性生長因子激活血小板衍生物生長因子BB/血小板衍生物生長因子受體β信號通路而上調(diào)，這提示了CD34+MNCs對于促進(jìn)MSCs的組織整合和防止MSCs的細(xì)胞凋亡中起到了獨(dú)特作用［24］。

我們的結(jié)果不僅證明了MSCs與CD34+MNCs共培養(yǎng)體系強(qiáng)大的成血管能力，還驗(yàn)證了它們在體內(nèi)向平滑肌譜系分化的能力。有報道指出注射進(jìn)體內(nèi)的MSCs有分化成SMCs的能力，還有促進(jìn)血管重塑的能力［25，26］。然而在我們的實(shí)驗(yàn)中，種植在支架上的MSCs在體內(nèi)并沒有分化為平滑肌，而是纖維化形成了疤痕。越來越多的證據(jù)提示在體外，從血管壁上分離的間充質(zhì)干細(xì)胞有分化為功能血管全部細(xì)胞成分（包括內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞）的能力［27］。當(dāng)與EPCs共培養(yǎng)時，骨髓MSCs可能被賦予血管壁來源MSCs的細(xì)胞學(xué)特性，最終分化為平滑肌組分。值得一提的是，正常人類陰莖海綿體內(nèi)血竇中的內(nèi)皮細(xì)胞周圍并無周細(xì)胞［28］，這使得在工程化組織過程中無需發(fā)揮MSCs的成纖維間質(zhì)作用。

相比于肌源性干細(xì)胞，同種異源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更易獲取和擴(kuò)增。除了技術(shù)上的便捷，MSCs受到了大量研究，并成功應(yīng)用于臨床，在治療諸如移植物抗宿主病中發(fā)揮了巨大的作用［29］，因此，當(dāng)應(yīng)用于人陰莖海綿體重建時，骨髓干細(xì)胞具有成熟的商業(yè)來源。CD34+單核細(xì)胞可以從人的外周血中獲得。在臨床應(yīng)用中，獲取途徑的便利性可以為兩者聯(lián)合植入帶來一個光明的前景。

盡管MSCs與CD34+MNCs共培養(yǎng)組靠近白膜的工程化組織具有正常的海綿體結(jié)構(gòu)，但其深部組織仍以纖維化為主，我們并沒有就工程化組織的深度作出定量分析。我們也沒有對植入的陰莖海綿體在不同的時間點(diǎn)行組織學(xué)或免疫熒光檢查，失去了動態(tài)觀察陰莖海綿體組織分化及血管化的機(jī)會。最后，我們也沒有行任何實(shí)驗(yàn)追溯再生平滑肌的細(xì)胞來源。

4 結(jié)論

我們的研究驗(yàn)證了將MSCs與CD34+MNCs共培養(yǎng)體系種植于脫細(xì)胞支架植入體內(nèi)可以構(gòu)建出一部分與原生海綿體類似的陰莖海綿體組織，CD34+MNCs在體內(nèi)主要通過協(xié)同MSCs而非單獨(dú)發(fā)揮其促血管化的生物學(xué)效應(yīng)。

［1］Goodwin WE，Scott WW.Phalloplasty［J］.J Urol，1952，68（6）：903-908.

［2］Horton CE，Dean JA.Reconstruction of traumatically acquired defects of the phallus［J］.World J Surg，1990，14（6）：757-762.

［3］Woodhouse CR.The sexual and reproductive consequences of congenital genitourinary anomalies［J］.J Urol，1994，152（2 Pt 2）：645-651.

［4］Song R，Gao Y，Song Y，et al.The forearm flap［J］.Clin Plast Surg，1982，9（1）：21-26.

［5］Santi P，Berrino P，Canavese G，et al.Immediate reconstruc?tion of the penis using an inferiorly based rectus abdominis myo?cutaneous flap［J］.Plast reconstr Surg，1988，81（6）：961-964.

［6］Sadove RC，Sengezer M，McRoberts JW，Wells MD.One-stage total penile reconstruction with a free sensate osteocutaneous fib?ula flap［J］.Plast reconstr Surg，1993，92（7）：1314-1325.

［7］Rohrich RJ，Allen T，Lester F，et al.Simultaneous penis and perineum reconstruction using a combined latissimus dorsi?scap?ular free flap with intraoperative penile skin expansion［J］.Plast reconstr Surg，1997，99（4）：1138-1141.

［8］Kershen RT，Yoo JJ，Moreland RB，et al.Reconstitution of hu?man corpus cavernosum smooth muscle in vitro and in vivo［J］. Tissue Eng，2002，8（3）：515-524.

［9］Falke G，Yoo JJ，Kwon TG，et al.Formation of corporal tissue architecture in vivo using human cavernosal muscle and endothe?lial cells seeded on collagen matrices［J］.Tissue Eng，2003，9（5）：871-879.

［10］Eberli D，Susaeta R，Yoo JJ，Atala A.A method to improve cel?lular content for corporal tissue engineering［J］.Tissue Eng Part A，2008，14（10）：1581-1589

［11］Chen KL，Eberli D，Yoo JJ，Atala A.Bioengineered corporal tissue for structural and functional restoration of the penis［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（8）：3346-3350.

［12］Ji C，Min F，Liang W，et al.Construction of tissue?engineered corpus cavernosum with muscle?derived stem cells and transplan?tation in vivo［J］.BJU Int，2011，107（10）：1638-1646.

［13］An G，Ji C，Wei Z，et al.Engineering of corpus cavernosum us?ing vascular endothelial growth factor?expressing muscle?derived stem cells seeded on acellular corporal collagen matrices［J］. Urology，2013，81（2）：424-431.

［14］Laks M，F(xiàn)reitas?Filho LG，Sayeg K，et al.Penile reconstruction using mesenchymal stem cells［J］.Acta Cir Bras，2015，30（8）：529-536.

［15］Traktuev DO，Prater DN，Merfeld?Clauss S，et al.Robust func?tional vascular network formation in vivo by cooperation of adi?pose progenitor and endothelial cells［J］.Circ Res，2009，104（12）：1410-1420.

［16］Gruh I，Beilner J，Blomer U，et al.No evidence of transdifferen?tiation of human endothelial progenitor cells into cardiomyocytes after coculture with neonatal rat cardiomyocytes［J］.Circulation，2006，113（10）：1326-134.

［17］Suuronen EJ，Price J，Veinot JP，et al.Comparative effects of mesenchymal progenitor cells，endothelial progenitor cells，or their combination on myocardial infarct regeneration and cardiac function［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，2007，134（5）：1249-1258.

［18］Derval N，Barandon L，Dufourcq P，et al.Epicardial deposition of endothelial progenitor and mesenchymal stem cells in a coatedmuscle patch after myocardial infarction in a murine model［J］. Eur J Cardiothorac Surg，2008，34（2）：248-254.

［19］Borlongan CV，Glover LE，Tajiri N，et al.The great migration of bone marrow?derived stem cells toward the ischemic brain：therapeutic implications for stroke and other neurological disor?ders［J］.Prog Neurobiol，2011，95（2）：213-228.

［20］Usami K，Mizuno H，Okada K，et al.Composite implantation of mesenchymal stem cells with endothelial progenitor cells enhanc?es tissue?engineered bone formation［J］.J Biomed Mater Res A，2009，90（3）：730-741.

［21］Li G，Wang X，Cao J，et al.Coculture of peripheral blood CD34+cell and mesenchymal stem cell sheets increase the for?mation of bone in calvarial critical?size defects in rabbits［J］.Br J Oral Maxillofac Surg，2014，52（2）：134-139.

［22］Pedersen TO，Blois AL，Xue Y，et al.Mesenchymal stem cells induce endothelial cell quiescence and promote capillary forma?tion［J］.Stem Cell Res Ther，2014，5（1）：23.

［23］Wen L，Wang Y，Wen N，et al.Role of endothelial progenitor cells in maintaining stemness and enhancing differentiation of mesenchymal stem cells by indirect cell?cell interaction［J］. Stem Cells Dev，2016，25（2）：123-138.

［24］Lin RZ，Moreno?Luna R，Li D，et al.Human endothelial colony? forming cells serve as trophic mediators for mesenchymal stem cell engraftment via paracrine signaling［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111（28）：10137-1042.

［25］Gojo S，Gojo N，Takeda Y，et al.In vivo cardiovasculogenesis by direct injection of isolated adult mesenchymal stem cells［J］. Exp Cell Res，2003，288（1）：51-59.

［26］Yoon YS，Wecker A，Heyd L，et al.Clonally expanded novel multipotent stem cells from human bone marrow regenerate myo?cardium after myocardial infarction［J］.J Clin Invrst，2005，115（2）：326-238.

［27］Zaniboni A，Bernardini C，Bertocchi M，et al.In vitro differenti?ation of porcine aortic vascular precursor cells to endothelial and vascular smooth muscle cells［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2015，309（5）：C320-331.

［28］Wessells H，King SH，Schmelz M，et al.Immunohistochemical comparison of vascular and sinusoidal adherens junctions in cav?ernosal endothelium［J］.Urology，2004，63（1）：201-206.

［29］Le Blanc K，F(xiàn)rassoni F，Ball L，et al.Mesenchymal stem cells for treatment of steroid?resistant，severe，acute graft?versus?host disease：a phase II study［J］.Lancet，2008，371（9624）：1579-1586.

Construction of rabbit tissue?engineered corpus cavernosum with co?culture of BM?MSCs and CD34+MNCs and transplantation in vivo

LI Ruiting，LIU Zhihan，JI Chenyang，XIAO Xiaolian，

ObjectiveTo investigate the feasibility of co?cultured mesenchymal stem cells（MSCs）and CD34+mononuclear cells seeded in acellular matrix to construct a section of rabbit tissue?engineered cavernosum in vivo.MethodsMSCs and CD34+mononuclear cells（MNCs）were extracted from bone marrow and peripheral blood.After being identified，the two components of the cells were seeded in prepared acellular corporal matrix alongside with MSCs and CD34+MNCs seeded in the same density respectively.The cell?laden matrix was transplanted into a rabbit model of penile interruption after culture for 4 days in vitro.Three months after implantation，animals were killed and the engineered tissue was collected for histological examination（H&E staining and Masson′s trichrome staining）.ResultsThe engineered corporal tissue near tunica albuginea in MSCs and CD34+MNCs cocultured group preserved the histological feather of intact corporal tissue.The other 3 groups，including MSCs group，CD34+MNCs group and acellular matrix group，failed to preserve the corporal structure.Instead，they underwent fibrosis and formed scar tissue though samples from MSCs group showed more small vessels than from CD34+MNCs group and acellular matrix group（P＜0.05）.ConclusionOur work demonstrates the feasibility of co?implantation of MSCs and CD34+MNCs in acellular matrix to construct corporal tissueresembling to native one.CD34+MNCs promote vascularization in vivo along with MSCs rather than alone.

CD34+Mononuclear Cells；bone marrow?derived Mesenchymal stem cells；acellular corporal matrix；tissue engineering；tissue?engineered corpus cavernosum；penile reconstruction

R622

A

10.3969/j.issn.1009?976X.2017.02.011LIANG Weiqiang，ZHANG Jinming.Department of Plastic Surgery，Sun Yat?sen Memorial Hospital，Sun Yat?sen University，Guangzhou，510120，China.Corresponding author：ZHANG Jinming，zxmrwk@126. com

2017-03-05）

廣東省自然科學(xué)基金（2015A030313028）

510120廣州中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院整形外科

*通訊作者：張金明，E?mail：zxmrwk@126.com